江衛(wèi)民，張偉康，李東棟，宋曄

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微米陣列結(jié)構(gòu)聚合物薄膜的制備及其對(duì)細(xì)胞三維培養(yǎng)的影響

江衛(wèi)民1，張偉康2,3，李東棟2，宋曄3

1 南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬口腔醫(yī)院 南京市口腔醫(yī)院，江蘇 南京 210008 2 中國科學(xué)院上海高等研究院，上海 201210 3 南京理工大學(xué) 軟化學(xué)與功能材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210094

江衛(wèi)民, 張偉康, 李東棟, 等. 微米陣列結(jié)構(gòu)聚合物薄膜的制備及其對(duì)細(xì)胞三維培養(yǎng)的影響.生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(11): 1850–1859.Jiang WM, Zhang WK, Li DD, et al. Preparation of microarray-structured polymer film and its effect on 3D cell culture. Chin J Biotech, 2018, 34(11): 1850–1859.

二維 (Two-dimensional，2D) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪悄壳把芯咳祟惣膊〉募?xì)胞過程和藥物篩選的主流方法。然而，生物細(xì)胞的生長受到眾多因素的影響，傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)在精確再現(xiàn)三維組織內(nèi)細(xì)胞的功能方面存在一些障礙。與2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，三維 (Three-dimensional，3D) 細(xì)胞培養(yǎng)體系注重細(xì)胞間的接觸及細(xì)胞-基質(zhì)間的接觸，更接近于生物體的生長環(huán)境，更適合于藥物篩選、細(xì)胞培植等研究。文中通過納米壓印技術(shù)制備了不同結(jié)構(gòu)微米陣列聚合物薄膜，并將其應(yīng)用于293T細(xì)胞的培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)薄膜表面結(jié)構(gòu)、表面接觸角成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)生物細(xì)胞生長形貌的調(diào)控。利用掃描電鏡等方法，對(duì)比了聚合物薄膜不同微結(jié)構(gòu)、不同表面潤濕性對(duì)細(xì)胞生長形貌的影響，重點(diǎn)關(guān)注細(xì)胞團(tuán)的形態(tài)變化。結(jié)果表明，細(xì)胞在親水性10 μm柱形陣列薄膜上呈現(xiàn)三維生長狀態(tài)，這種薄膜可能更適用于制備生物細(xì)胞3D培養(yǎng)基；疏水性3 μm柱形陣列薄膜適用于體積小、表皮硬的組織細(xì)胞的3D培養(yǎng)，對(duì)于體積較大的細(xì)胞效果差。另外，對(duì)于疏水性較強(qiáng)的薄膜，細(xì)胞傾向于球狀生長，而親水性較強(qiáng)的薄膜則易貼壁生長。研究結(jié)果為微結(jié)構(gòu)薄膜在生物細(xì)胞3D培養(yǎng)方面的應(yīng)用作了初步探索。

納米壓印，超疏水，超親水，細(xì)胞培養(yǎng)

在生物醫(yī)藥行業(yè)中，眾多的藥物通過臨床研究后并不能達(dá)到預(yù)期的療效和安全性要求，所以藥物的研發(fā)是一個(gè)耗時(shí)、成本高、成功率低的工作[1-2]。二維 (Two-dimensional，2D) 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑樗幬锏难邪l(fā)提供了一個(gè)有效的發(fā)現(xiàn)模型，已經(jīng)成為研究人類疾病的細(xì)胞過程和藥物篩選的主流方法[3-4]。

然而，生物細(xì)胞的生長受到眾多因素的影響，如可溶性因子、細(xì)胞外基質(zhì)、相鄰細(xì)胞等[5]，傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境與生物體中細(xì)胞的實(shí)際生長環(huán)境有較大差異，對(duì)于許多人類疾病2D細(xì)胞培養(yǎng)基不能有效模擬[6]，并在精確再現(xiàn)三維組織內(nèi)細(xì)胞的功能方面存在一些障礙[7-9]。針對(duì)此問題，科研工作者作出了一系列探究，開發(fā)了生物細(xì)胞的三維 (Three-dimensional，3D) 培養(yǎng)技術(shù)。與傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)相比，3D細(xì)胞培養(yǎng)注重細(xì)胞間的接觸及細(xì)胞-基質(zhì)間的接觸，更接近于生物體的生長環(huán)境，更適合于藥物篩選、細(xì)胞培植等研究。因此，開發(fā)3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有良好的應(yīng)用前景[10-11]。2017年Fang等[12]開發(fā)了一系列三維人體器官的體外模型，培養(yǎng)出細(xì)胞球狀體。日本的ORGANOGENIX公司開發(fā)了基于3D結(jié)構(gòu)支架的細(xì)胞培養(yǎng)板[13]，并在3D細(xì)胞培養(yǎng)板上培養(yǎng)人宮頸癌細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了3D培養(yǎng)基的商業(yè)應(yīng)用。Hu等[14]開發(fā)了一種3-氨基苯基硼酸功能化石墨烯泡沫網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)結(jié)合了3-氨基苯基硼酸的仿生性能和石墨烯的機(jī)械、電化學(xué)性能，耐久性好且電化學(xué)傳感性能靈敏的優(yōu)點(diǎn)，因此這種3D細(xì)胞培養(yǎng)材料可實(shí)現(xiàn)培養(yǎng)過程的實(shí)時(shí)監(jiān)控。Han[15]應(yīng)用膠原蛋白與轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶交聯(lián)，開發(fā)出一種可調(diào)節(jié)的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，并在細(xì)胞分析中起到了至關(guān)重要的作用。然而，目前制備3D細(xì)胞培養(yǎng)基的方法成本高、且培養(yǎng)基耐久性與耐腐蝕性差。所以為了開發(fā)出一種工藝簡(jiǎn)單、成本低廉、性能良好的3D細(xì)胞培養(yǎng)基，我們將微結(jié)構(gòu)聚合物薄膜作為功能性基底，引入到3D細(xì)胞培養(yǎng)基的制備中。

由Wenzel模型[16]和Cassie-Baxter模型[17]可知，同一種材料當(dāng)表面微結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，其表面的液體接觸角也會(huì)隨之變化。因此，通過調(diào)節(jié)材料表面微結(jié)構(gòu)即可控制表面性質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞生長的影響。可見，深入研究材料制備方法和界面調(diào)控機(jī)制，開發(fā)成本低廉、工藝簡(jiǎn)單、表界面特性可控、性能持久、可用于3D生物細(xì)胞培養(yǎng)的微結(jié)構(gòu)薄膜材料具有重要意義。

本研究介紹了一種工藝簡(jiǎn)單、易于界面改性的微結(jié)構(gòu)陣列聚合物薄膜(Microarray-structured polymer film，MSPF) 的制備方法，并將MSPF應(yīng)用于3D生物細(xì)胞的培養(yǎng)，探究了不同的微結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響，得到了最適合于制備細(xì)胞3D培養(yǎng)基的微結(jié)構(gòu)薄膜。我們?cè)诮档椭谱鞒杀镜幕A(chǔ)上，制備出多種結(jié)構(gòu)的細(xì)胞培養(yǎng)基，并深入研究其性能，為微米結(jié)構(gòu)超疏水薄膜應(yīng)用于生物細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

無水乙醇、丙酮、三氟 (1H，1H，2H，2H-全氟正辛基) 硅烷、乙二胺四乙酸 (EDTA) 等均為分析純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；去離子水為自制 (18 MΩ?cm)；壓印膠 (UV54) 購自康得新復(fù)合材料集團(tuán)股份有限公司；聚二甲基氧烷彈性體 (PDMS) 主劑和固化劑 (Sylgard 184) 購自道康寧 (上海) 有限公司；胎牛血清和DMEM細(xì)胞培養(yǎng)劑購自美國Gibco公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

超純水機(jī) (Milli-Q Reference System，美國 Millipore公司)；氧氣等離子機(jī) (Plasma-Preen Ⅱ 862，邁可諾技術(shù)有限公司)；納米壓印設(shè)備 (自制)；旋涂儀 (VCT-100，MTI Corp.)；CO2培養(yǎng)箱 (上海力申科學(xué)儀器有限公司)；掃描電鏡 (SEM，S4800，Hitachi)；接觸角測(cè)試儀 (DSA100，Kruss Kontaktwinkle Inc.)；3D激光掃描顯微鏡 (VK-9700K，日本基恩士公司)。

1.2 方法

1.2.1 3D微結(jié)構(gòu)薄膜制備

圖1為制備MSPF的工藝流程。首先，對(duì)Si模板進(jìn)行抗粘處理，將Si模板放在氧氣等離子體機(jī)中處理5 min，再放入自制的分子氣相沉積設(shè)備中，在其周圍滴上4 μL疏水劑 (三氟 (1H，1H，2H，2H-全氟正辛基) 硅烷)，真空狀態(tài)下加熱到150 ℃，保溫3 h。然后，將PDMS主劑與固化劑按照10∶1的比例混合均勻，澆鑄在Si模板上，放入真空箱中抽至0.08 MPa，除去氣泡，水平靜置30 min后放入60 ℃烘箱中固化3 h，剝離后得PDMS透明柔性模板。第三步，將玻璃裁剪成10 cm×5 cm矩形，依次用丙酮、乙醇、去離子水各超聲15 min并用氮?dú)獯蹈?，用作襯底。將壓印膠旋涂于玻璃基底上，轉(zhuǎn)速為500 r/min，時(shí)間10 s，之后改為1 000 r/min、30 s；最后，把上述PDMS模板貼于涂有壓印膠的玻璃表面并趕走氣泡，用光強(qiáng)10 mW/cm2的UV燈照射4 min，剝離PDMS后即得到MSPF。

圖1 MSPF薄膜制備流程圖

本研究采用納米壓印工藝制備了幾種不同結(jié)構(gòu)的MSPF，分別為：周期1 μm凹坑陣列薄膜、周期3 μm柱形陣列薄膜、周期10 μm柱形陣列薄膜和平面結(jié)構(gòu)薄膜，將這幾種MSPF留作對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MSPF的表面處理

通過納米壓印制備的MSPF表面為疏水性，將MSPF放到氧氣等離子機(jī)中，在功率150 W下處理2 min，即可將表面變?yōu)橛H水性。將同種結(jié)構(gòu)的薄膜各制備兩份，其中一份不做處理，另一份進(jìn)行氧氣等離子體處理，并對(duì)薄膜樣品進(jìn)行編號(hào)，如表1所示。將兩份樣品同時(shí)用作細(xì)胞培養(yǎng)的基底薄膜，進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 293T細(xì)胞的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)選擇293T細(xì)胞作為培養(yǎng)的目標(biāo)細(xì)胞。首先將293T細(xì)胞進(jìn)行傳代并接種到各個(gè)樣品薄膜上，其操作步驟如下：1) 將不同結(jié)構(gòu)的薄膜培養(yǎng)基用乙醇沖洗，并用氮?dú)獯蹈桑?) 將15 mL離心管、移液器、移液槍、12孔培養(yǎng)板、薄膜培養(yǎng)基放在潔凈臺(tái)上用紫外燈照射30–40 min，進(jìn)行消菌殺毒；3) 將無Ca2+、Mg2+的PBS，10%的胎牛血清，100 U/mL雙抗DMEM放到水浴鍋中預(yù)熱，備用，水浴鍋溫度設(shè)為37℃；4) 從37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中取出293T細(xì)胞，使用移液管將細(xì)胞移植到清洗過的細(xì)胞瓶中；5) 使用PBS將EDTA-0.25%胰蛋白酶稀釋5倍，取2–3 mL加入到細(xì)胞瓶中。使用顯微鏡觀察細(xì)胞，待細(xì)胞變圓加入胎牛血清，同時(shí)輕輕振蕩細(xì)胞瓶將瓶上的細(xì)胞震落，之后放入離心管中1 000 r/min離心3 min；6) 用移液管吸取上清液，加入3–5 mL DMEM將細(xì)胞稀釋，取一定量的細(xì)胞液進(jìn)行再次稀釋，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，留作備用；7) 分別將不同的薄膜培養(yǎng)基放入到12孔培養(yǎng)板中，用無菌移液管吸取75%的乙醇加入到培養(yǎng)板的孔洞中，對(duì)薄膜培養(yǎng)基進(jìn)行洗滌，吸凈乙醇；吸取5 mL的PBS繼續(xù)洗滌薄膜培養(yǎng)基，吸凈PBS；8) 使用移液管將制備好的細(xì)胞懸浮液接種到12孔培養(yǎng)板的薄膜培養(yǎng)基上，放置到37 ℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；9) 待細(xì)胞培養(yǎng)至20 h時(shí)取出，顯微鏡觀察細(xì)胞。

表1 不同結(jié)構(gòu)薄膜參數(shù)

在培養(yǎng)結(jié)束后，需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行特定的處理使其保持現(xiàn)有的形貌特征，以便進(jìn)行觀察。對(duì)細(xì)胞的處理包括：1) 細(xì)胞的固定。常用的固定方法是：在4 ℃下使用2.5%戊二醛浸泡1–3 h，1.0%四氧化鋨浸泡0.5–1 h；2) 細(xì)胞的脫水。常用的脫水劑為乙醇，方法是梯度脫水，即分別使用30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%、100%的乙醇浸泡15 min。在脫水過程中要沿壁緩慢加入乙醇，避免對(duì)樣品的沖擊、損壞等；3) 細(xì)胞的干燥。采用的方法為空氣干燥法，即將細(xì)胞樣品脫水到無水狀態(tài)后，退回到85%的脫水劑，然后取出樣品在空氣中自然干燥。

1.2.4 性能測(cè)試

使用SEM對(duì)樣品表面形貌進(jìn)行觀測(cè)。使用接觸角測(cè)試儀對(duì)不同結(jié)構(gòu)的薄膜進(jìn)行接觸角測(cè)試。同時(shí)，使用3D激光掃描顯微鏡對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行較大面積的觀察、測(cè)試。

2 結(jié)果與分析

2.1 MSPF的性能表征

圖2為周期3 μm、10 μm柱形陣列結(jié)構(gòu)薄膜與周期1 μm凹坑陣列結(jié)構(gòu)薄膜的SEM。從圖2B中可測(cè)出柱子的高度為1.5 μm，周期3 μm，柱子形狀呈圓包狀，側(cè)壁光滑，柱子頂部直徑約為1 μm，底部直徑約為2 μm。圖2E中凹坑結(jié)構(gòu)的深度為500 nm，圖2D中可以看出凹坑上端呈圓形，周期為1 μm。圖2H中柱子高為10 μm，直徑為4 μm，陣列周期為10 μm，柱子為圓柱形，側(cè)壁光滑，柱子上下直徑基本相同。通過納米壓印制備的微結(jié)構(gòu)薄膜上的結(jié)構(gòu)都是大面積規(guī)整有序。

圖2 不同結(jié)構(gòu)薄膜的SEM圖. (A)–(C) 分別為3 μm柱形陣列薄膜表面的俯視圖、斷面圖和斜面圖 (60°)；(D)–(F)分別為1 μm凹坑陣列薄膜表面的俯視圖、斷面圖和斜面圖 (60°)；(G)–(I) 分別為10 μm柱形陣列薄膜表面的俯視圖、斷面圖和斜面圖 (60°)

如前所述，由Wenzel模型[16]和Cassie-Baxter模型[17]可知相同材料的薄膜，其表面微結(jié)構(gòu)的不同會(huì)影響其表面接觸角。同時(shí)，相同結(jié)構(gòu)、同種材料的薄膜當(dāng)其表面自由能發(fā)生變化時(shí)其接觸角也會(huì)發(fā)生變化[18-19]。因此我們對(duì)8種樣品薄膜分別進(jìn)行了接觸角的測(cè)試，結(jié)果見圖3。我們發(fā)現(xiàn)，在結(jié)構(gòu)相同時(shí)通過氧氣等離子體的處理薄膜表面接觸角會(huì)變小。圖3 A、B、C、D即為氧氣等離子體處理后的聚合物薄膜，因?yàn)檠鯕獾入x子體處理會(huì)使聚合物表面懸掛鍵增多，改變其表面能，所以在結(jié)構(gòu)不變的情況下接觸角會(huì)變小。

由圖3也可以看出，在親水處理之前只有10 μm柱形陣列薄膜的接觸角達(dá)到了超疏水的效果，接觸角為161.5°，且在經(jīng)過氧氣等離子體處理后，接觸角變?yōu)?°，變?yōu)槌H水。所以處理前后這種結(jié)構(gòu)的MSPF薄膜接觸角變化最大，在探究接觸角對(duì)細(xì)胞生長形貌影響時(shí)作為重點(diǎn)觀察樣品。

2.2 微結(jié)構(gòu)薄膜在3D生物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

應(yīng)用納米壓印制備的聚合物薄膜，由于其特殊的表面形貌以及不同的表面潤濕性，導(dǎo)致在應(yīng)用這些薄膜進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，會(huì)影響細(xì)胞的形貌、遷移等特征。因此將實(shí)驗(yàn)1.2中制備得到的8種不同表面性質(zhì)的薄膜應(yīng)用于293T細(xì)胞的培養(yǎng)，并對(duì)培養(yǎng)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)分析，研究微結(jié)構(gòu)薄膜對(duì)生物細(xì)胞的影響。圖4分別為8種薄膜樣品在細(xì)胞生長不同時(shí)間段的顯微鏡圖片。

圖3 親水處理前后接觸角的變化

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間下各薄膜上細(xì)胞顯微鏡圖

一號(hào)膜 (親水性平面薄膜)：2 h部分細(xì)胞貼壁；20 h大部分細(xì)胞貼壁鋪展生長；30 h細(xì)胞呈明顯貼壁生長，且細(xì)胞數(shù)量較多 (圖4A)。

二號(hào)膜 (疏水性平面薄膜)：2 h細(xì)胞漂浮到細(xì)胞液中，懸浮生長；20 h細(xì)胞聚團(tuán)，仍有大部分懸浮在細(xì)胞液中；30 h細(xì)胞也呈現(xiàn)貼壁生長 (圖4B)。

三號(hào)膜 (親水性3 μm柱形陣列薄膜)：2 h細(xì)胞大部分粘附在膜上；20 h細(xì)胞聚團(tuán)粘附在膜上生長；30 h時(shí)細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁，但細(xì)胞數(shù)量較多 (圖4C)。

四號(hào)膜 (疏水性3 μm柱形陣列薄膜)：2 h細(xì)胞粘附在膜上；20 h細(xì)胞粘附在膜上生長，由于此時(shí)細(xì)胞體積較小所以呈現(xiàn)3D生長；30 h細(xì)胞體積變大呈貼壁生長 (圖4D)。

五號(hào)膜 (親水性1 μm凹坑陣列薄膜)：2 h細(xì)胞粘附在膜上；20 h細(xì)胞貼壁生長；30 h細(xì)胞大部分鋪展生長，與平面薄膜的相似 (圖4E)。

六號(hào)膜 (疏水性1 μm凹坑陣列薄膜)：2 h細(xì)胞懸浮在細(xì)胞液中；20 h細(xì)胞聚團(tuán)，大部分仍然懸浮在細(xì)胞液中；30 h留在薄膜上的細(xì)胞呈大面積貼壁生長 (圖4F)。

七號(hào)膜 (親水性10 μm柱形陣列薄膜)：2 h細(xì)胞球狀粘附在膜上；20 h部分細(xì)胞聚團(tuán)，仍有球狀細(xì)胞，細(xì)胞粘附在膜上，細(xì)胞3D生長效果好，且漂浮細(xì)胞很少；30 h細(xì)胞仍呈球狀生長，說明在此薄膜上細(xì)胞3D生長效果較好 (圖4G)。

八號(hào)膜 (疏水性10 μm柱形陣列薄膜)：2 h細(xì)胞球狀體落在膜上，輕微晃動(dòng)大部分漂浮到細(xì)胞液中；20 h有些細(xì)胞聚團(tuán)，大部分細(xì)胞仍是球狀，輕微晃動(dòng)少部分細(xì)胞懸浮；30 h細(xì)胞呈球狀立體生長，但是粘附力差，稍微晃動(dòng)就會(huì)飄落 (圖4H)。

通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，隨時(shí)間的延長細(xì)胞在薄膜上數(shù)量逐漸變多，細(xì)胞團(tuán)體積也逐漸變大。其中在20 h時(shí)細(xì)胞在疏水性3 μm薄膜上和親水性10 μm柱形陣列薄膜上均呈現(xiàn)3D生長，但隨著生長時(shí)間延長，最終只有在親水性10 μm薄膜上可一直保持3D生長狀態(tài)。因此親水性10 μm薄膜適用于制備細(xì)胞3D培養(yǎng)基。

從圖4中還可以看出，在細(xì)胞培養(yǎng)到20 h時(shí)細(xì)胞數(shù)量、體積及形貌最適宜觀察分析。培養(yǎng)時(shí)間短，形貌特征不明顯；培養(yǎng)時(shí)間過長，細(xì)胞易分裂傳代，不易觀察。因此，我們選取20 h的時(shí)間節(jié)點(diǎn)，對(duì)這個(gè)時(shí)間段的細(xì)胞進(jìn)行SEM分析。

圖5為兩種接觸角不同的平面結(jié)構(gòu)薄膜上細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)構(gòu)。從圖5A、B中可以看出，親水性的平面薄膜上細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁狀態(tài)生長，而且細(xì)胞通過繁殖、遷移會(huì)連接成片，這是傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)中細(xì)胞生長的狀態(tài)。圖5C、D為疏水性平面薄膜上的細(xì)胞狀態(tài)。與親水平面薄膜對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)平面接觸角較大時(shí)細(xì)胞會(huì)呈現(xiàn)球狀 (圖5C)，接近立體生長。但是隨著細(xì)胞體積的變大也會(huì)在細(xì)胞邊界生長出“觸角狀”結(jié)構(gòu) (圖5C中右邊的細(xì)胞)，表現(xiàn)出一定貼壁生長特征。這說明在平面結(jié)構(gòu)薄膜上接觸角對(duì)細(xì)胞生長的影響會(huì)隨著細(xì)胞體積變大而減弱。

圖5 細(xì)胞的SEM圖. (A) 和(B) 為一號(hào)薄膜上細(xì)胞的SEM；(C) 和(D) 為二號(hào)薄膜上細(xì)胞的SEM

通過接觸角不同的平面薄膜上細(xì)胞的對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)表面接觸角對(duì)細(xì)胞形貌有一定的影響，同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)不同表面微結(jié)構(gòu)也會(huì)影響細(xì)胞的生長。圖6和圖7分別為親水處理后3 μm柱形陣列薄膜和未經(jīng)處理的3 μm柱形陣列薄膜上細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果。圖6中薄膜的接觸角為41.8°，細(xì)胞貼在薄膜表面生長，從圖6C中可以發(fā)現(xiàn)細(xì)胞邊界也有許多“觸角狀”結(jié)構(gòu)，并且細(xì)胞包裹住柱子，“觸角狀”結(jié)構(gòu)延伸到柱子之間并向底部生長。由于薄膜親水性較好，細(xì)胞對(duì)薄膜的附著力較大，細(xì)胞數(shù)量較多，所以親水處理后3 μm柱形陣列薄膜上細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長，不能用作細(xì)胞的3D培養(yǎng)。

圖6 親水處理后3 μm柱形陣列薄膜上細(xì)胞的SEM

圖7 未經(jīng)親水處理的3 μm柱形陣列薄膜上細(xì)胞的SEM

圖7中的薄膜結(jié)構(gòu)與圖6中薄膜結(jié)構(gòu)相同，均為3 μm柱形陣列薄膜，但是圖7中的薄膜沒有經(jīng)過親水處理，其接觸角為75.9°。在圖7C的插圖中可以看出，細(xì)胞被柱子頂在頂端生長，并沒有包裹住柱子，而且細(xì)胞邊界沒有“觸角狀”結(jié)構(gòu)，說明細(xì)胞沒有貼壁生長的特征。圖7B顯示細(xì)胞并沒有連接成片，并且呈現(xiàn)出一定程度的球狀生長狀態(tài)，證明疏水性3 μm柱形陣列薄膜上細(xì)胞接近于三維生長。經(jīng)過分析其原因是：3 μm柱形陣列結(jié)構(gòu)比細(xì)胞體積小，圓包狀柱子可以為細(xì)胞提供支點(diǎn)，使其與基底脫離，提供立體生長的空間。但由于薄膜接觸角較小并沒有達(dá)到疏水效果，隨著細(xì)胞的生長，當(dāng)體積變大時(shí)細(xì)胞就會(huì)逐漸包裹住柱子，呈扁平狀并出現(xiàn)“觸角狀”結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)貼壁生長狀態(tài)，如圖7A、D所示。綜上，疏水性3 μm柱形陣列薄膜適用于體積較小的組織細(xì)胞的3D培養(yǎng)，對(duì)于體積較大細(xì)胞的支撐效果差。

五號(hào)樣品與六號(hào)樣品為周期1 μm凹坑陣列薄膜，由于凹坑結(jié)構(gòu)較小 (圖2e)，基本不會(huì)影響細(xì)胞形貌，如圖8A所示，親水性1 μm凹坑陣列薄膜上細(xì)胞呈現(xiàn)出明顯的貼壁生長狀態(tài)，與親水性平面薄膜上細(xì)胞的生長狀態(tài)相似。而疏水性1 μm凹坑陣列薄膜的接觸角較大，為110.8°，比疏水性平面薄膜的接觸角還要大，所以細(xì)胞在薄膜上呈球狀，表現(xiàn)出一定程度的三維生長，如圖8C所示細(xì)胞明顯是球狀生長，沒有貼壁的特征。但是隨著細(xì)胞體積的變大、遷移和聚集，細(xì)胞逐漸向貼壁的二維生長狀態(tài)轉(zhuǎn)化，如圖8D所示，細(xì)胞邊界依舊長出“觸角狀”結(jié)構(gòu)。雖然疏水性1 μm凹坑陣列薄膜的接觸角大于90°，但細(xì)胞整體數(shù)量較疏水性平面薄膜上細(xì)胞數(shù)量多。這是由于凹坑狀結(jié)構(gòu)為細(xì)胞提供了附著點(diǎn)，使“觸角狀”分支可以貼附在凹坑中，故其附著力較強(qiáng)，進(jìn)而細(xì)胞數(shù)量也較多。

圖8 細(xì)胞的SEM圖. (A)和(B)為五號(hào)薄膜上細(xì)胞的SEM；(C)和(D)為六號(hào)薄膜上細(xì)胞的SEM

圖9為親水性10 μm柱形陣列薄膜上的細(xì)胞生長狀況。從圖中可以看出，細(xì)胞在柱子之間生長，柱子側(cè)壁為細(xì)胞提供了生長支架，使細(xì)胞向三維方向生長。圖9C中細(xì)胞呈現(xiàn)“圓潤”的球狀，且邊界沒有“觸角狀”結(jié)構(gòu)。從圖9D大面積視圖來看，所有的細(xì)胞都是在柱子之間進(jìn)行三維方向生長。這說明親水性10 μm柱形陣列薄膜可以保證細(xì)胞的3D生長，是細(xì)胞3D培養(yǎng)基的最佳候選材料。

圖10中為疏水性10 μm柱形陣列薄膜上細(xì)胞的生長狀態(tài)。細(xì)胞在薄膜上被頂在柱子頂部，與薄膜底部未接觸，呈現(xiàn)懸空狀態(tài)。這防止了細(xì)胞的貼壁生長，在一定程度上保證了細(xì)胞的3D生長。隨著細(xì)胞體積逐漸變大，細(xì)胞會(huì)包裹住柱子，并沿著側(cè)壁向下生長 (圖10C)。從圖10D可以看出，薄膜上細(xì)胞數(shù)量較少，只有較少區(qū)域有細(xì)胞殘留。原因可歸結(jié)為兩點(diǎn)：1) 細(xì)胞在柱子頂部生長，柱子周期較大故細(xì)胞附著面積較??；2) 由于薄膜的接觸角較大，為161.5°，細(xì)胞與柱子的結(jié)合力小，易脫落到培養(yǎng)液中。通過七、八號(hào)樣品的對(duì)比得出，相同結(jié)構(gòu)薄膜上親、疏水性的不同對(duì)細(xì)胞形貌、生長狀態(tài)影響很大。疏水性10 μm柱形陣列薄膜并不適用于制備細(xì)胞3D培養(yǎng)基。

圖9 七號(hào)薄膜上細(xì)胞的SEM

圖10 八號(hào)薄膜上細(xì)胞的SEM

以上通過SEM從微觀上研究了薄膜結(jié)構(gòu)與接觸角對(duì)細(xì)胞生長狀態(tài)的影響。為了進(jìn)一步驗(yàn)證上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們使用3D激光顯微鏡對(duì)不同薄膜上的細(xì)胞進(jìn)行了宏觀上的觀察，如圖11所示。圖11A–D為親水性的薄膜，可以看出當(dāng)薄膜接觸角較小時(shí)細(xì)胞數(shù)量明顯較多，生長較為牢固，且細(xì)胞團(tuán)體積偏大；而疏水性薄膜，參見圖11A1–D1，薄膜表面接觸角較大，其細(xì)胞的數(shù)量較少，且細(xì)胞團(tuán)的體積較小、細(xì)胞分散。這說明接觸角會(huì)影響細(xì)胞與薄膜的附著力，進(jìn)而影響細(xì)胞團(tuán)的形貌。接觸角大的薄膜上，細(xì)胞容易脫落漂浮在培養(yǎng)液中；接觸角小的薄膜上，細(xì)胞容易粘附在上面，從而有利于細(xì)胞的培養(yǎng)、觀察和分析。所以通過宏觀上的觀察，也證實(shí)通過調(diào)節(jié)薄膜表面微結(jié)構(gòu)與潤濕性可以對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3 結(jié)論

本研究通過納米壓印制備了不同結(jié)構(gòu)微米陣列聚合物薄膜MSPF，發(fā)現(xiàn)不同表面微結(jié)構(gòu)影響表面接觸角，證明可以通過調(diào)節(jié)薄膜表面微結(jié)構(gòu)對(duì)其表面接觸角進(jìn)行調(diào)控。同時(shí)，我們將微米陣列結(jié)構(gòu)薄膜用于293T細(xì)胞的培養(yǎng)，主要得到以下結(jié)論：1) 細(xì)胞在親水性10 μm柱形陣列薄膜上呈現(xiàn)三維生長狀態(tài)，這種薄膜可能更適用制備生物細(xì)胞3D培養(yǎng)基；疏水性3 μm柱形陣列薄膜適用于體積小、表皮硬的組織細(xì)胞的3D培養(yǎng)，對(duì)于體積較大的細(xì)胞效果差。2) 當(dāng)薄膜結(jié)構(gòu)相同時(shí)，薄膜表面接觸角會(huì)影響細(xì)胞形態(tài)。接觸角越大細(xì)胞越易呈現(xiàn)球狀生長，接觸角越小則越易貼壁生長。但隨著細(xì)胞體積變大接觸角的影響變小。3) 薄膜表面接觸角會(huì)影響細(xì)胞數(shù)量，接觸角較大細(xì)胞吸附力小易脫落，接觸角較小細(xì)胞吸附力較大，細(xì)胞數(shù)量也變多。

圖11 各薄膜樣品的激光顯微鏡圖. (A)、(B)、(C)和(D) 為親水性薄膜；(A1)、(B1)、(C1) 和(D1)為疏水性薄膜

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Preparation of microarray-structured polymer film and its effect on 3D cell culture

Weimin Jiang1, Weikang Zhang2,3, Dongdong Li2, and Ye Song3

1 Nanjing Stomatological Hospital, Medical School of Nanjing University, Nanjing 210008, Jiangsu, China 2 Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China 3 Key Laboratory of Soft Chemistry and Functional Materials of Education Ministry, Nanjing University of Science and Technology, Nanjing 210094, Jiangsu, China

The two-dimensional (2D) cell culture model is currently used to study cellular processes and drug screening for human diseases. However, the growth of cells is affected by many factors. For conventional 2D cell culture, many of the difficulties are encountered in accurately replicating the cell function in three-dimensional (3D) tissues. Compared with 2D cell culture, much attention is paid to the cell-to-cell and cell-matrix interactions for 3D cell culture systems, which can more closely mimic the growth environment for cultured cells. Therefore, the 3D cell culture system was more suitable for a variety of applications such as drug screening and cell proliferation. In this work, we prepared microarray-structured polymer films with different geometric structures by nanoimprint lithography and used the films as cell culture platforms for the culture of 293T cells. Through the adjustment of the surface morphology and water contact angle of the prepared films, the regulation of the morphological changes of cell growth was successfully realized. Experimental results demonstrated that the hydrophilic films with 10 μm-pillar microstructure are applicable to 3D cell culture, whereas the hydrophobic films with 3 μm-pillar microstructure are only suitable for 3D culture of cells with a smaller size and stiff cuticular layer. In addition, cells tended to the formation of spheroids on the hydrophobic films, while cells usually adhered to the surface and grew on the hydrophilic films. This work represents further technological progress in the development of 3D cell culture, thereby facilitating future studies of physiologically relevant processes.

nanoimprint, superhydrophobic, superhydrophilic, cell culture

April 17, 2018;

June 20, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 61474128, 51377085).

Ye Song. Tel: +86-25-84315949; E-mail: soong_ye@sohu.com

10.13345/j.cjb.180144

國家自然科學(xué)基金(Nos. 61474128，51377085) 資助。

2018-07-10

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180709.1036.002.html

(本文責(zé)編 郝麗芳)