劉艷環(huán)，李海濤，朱言柱，常彤，肖家美，苗利光

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112）

特異性免疫是含有病原相關(guān)分子模式（PAMP）的反應(yīng)物與天然免疫細胞上的模式識別受體（PRR）相結(jié)合，激活天然免疫應(yīng)答，從而活化抗感染途徑的過程[1]。高度純化的新型疫苗因缺少PAMP成分，不能被天然免疫細胞的PRR很好地識別，不足以產(chǎn)生引起免疫應(yīng)答的有效信號。CPG-DNA作為佐劑可以克服新型疫苗PAMP不足的缺陷，通過模擬感染過程誘導(dǎo)強烈的免疫應(yīng)答[2]。本項研究為篩選適合亞單位疫苗免疫的CpG佐劑，通過淋巴細胞增殖試驗篩選出對羊、小鼠淋巴細胞都有較強細胞增殖作用的序列，為CpG佐劑的研制與應(yīng)用提供理論依據(jù).

CpG-DNA是一些具有免疫激活功能的以未甲基化的CpG基序為核心的DNA序列，它包括含CpG基序的人工合成的寡聚脫氧核苷酸（Oligodeoxynucleotides，ODN）和自然界中細菌、病毒、無脊椎動物等低等生物的基因組DNA。長期以來，DNA被認(rèn)為只具有較弱的免疫原性，難以引起機體強烈的免疫反應(yīng)。雖然早在1965年Braw等發(fā)現(xiàn)，用寡聚脫氧核苷酸與綿羊紅細胞一起注射小鼠，可明顯提高小鼠對綿羊紅細胞的免疫應(yīng)答水平，并首先提出寡聚脫氧核苷酸具有免疫佐劑的觀點。但是，DNA的免疫調(diào)節(jié)作用被廣泛認(rèn)識和重視是在20年后，人們研究結(jié)果表明，DNA是刺激免疫反應(yīng)的重要成分之一，特別是具有特定序列的細菌 DNA或經(jīng)化學(xué)修飾的DNA能刺激機體產(chǎn)生極為強烈的免疫應(yīng)答。這類DNA可以導(dǎo)致一些免疫細胞的增殖和分化，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。1984年，Tokunaga等[3]報道了牛分支結(jié)核桿菌（Mycobactetium Bouis，BCG）提取物中的DNA片段可增強NK細胞的活性，具有抗腫瘤效應(yīng)。

本試驗通過淋巴細胞增殖試驗，篩選出對羊、小鼠淋巴細胞都具有較強細胞增殖作用的序列，并進行相應(yīng)的動物安全性試驗，為進一步開展CpG免疫增強劑免疫效力試驗奠定了基礎(chǔ)。

1 試驗材料、儀器與試劑

1.1 試驗儀器

厭氧手套培養(yǎng)箱（美國Forma Scientific公司），825A厭氧罐（沈陽第五人民醫(yī)院），高速冷凍離心機ST-21（美國 Sorvall公司），96孔細胞培養(yǎng)板（Greiner公司）。

1.2 化學(xué)試劑[4，5，6]

限制性內(nèi)切酶 EcoR1、Marker 2 000（Promega公司），EY培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、TE緩沖液、質(zhì)粒提取液、RPMI1640、胎牛血清（HyClone公司），淋巴細胞分離液（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所）。

1.3 試驗動物

體重為16g～20g昆明小白鼠52只，雌、雄各半，購于長春生物制品研究所。

1.4 試驗材料

1.4.1 非致病性微生物來源 CpG-DNA的設(shè)計與合成 根據(jù)CpG-DNA特性，從非致病性的4種食品釀造菌〔枯草芽孢桿菌、乳酸菌（gi：16124244）、黃色短桿菌、雙歧桿菌〕基因組中找出27條CpG-DNA序列（見表1），由北京華大中生科技發(fā)展有限公司合成，聚丙烯酰氨凝膠電泳純化，純度＞99%，不含有脂多糖和內(nèi)毒素。

1.4.2 致病性微生物來源 CpG-DNA的篩選 從節(jié)瘤擬桿菌、壞死梭桿菌基因組中找出5條富含CpGDNA的序列，分別命名為 CFNCpG1、CFNCpG2、CFNCpG3、CFNCpG4、Cp6。序列如下：

表1 CpG-DNA序列Tab.1 CpG-DNA Sequence

2 方法

2.1 含CpG-DNA序列質(zhì)粒菌株的培養(yǎng)與質(zhì)粒提取以及CpG-DNA序列片段的回收

將菌株接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)24h。用堿裂解法提取質(zhì)粒，在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳，鑒定提取結(jié)果；用EcoRI酶切質(zhì)粒，1%低熔點膠回收目的片段。

2.2 淋巴細胞增殖實驗

2.2.1 羊、小鼠淋巴細胞分離 羊頸靜脈、小鼠去眼球無菌采血，肝素鈉抗凝。取抗凝血1份，與Hank’s液1∶1混勻后，加于1份細胞于分離液面之上；1500r/min離心10min；收集界面上的細胞，放入含Hank’s液4mL試管中，充分混勻；1500r/min，離心10min；吸去上清液，沉淀洗滌2次；用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細胞，取少量于鏡下檢查分離效果。

2.2.2 淋巴細胞增殖實驗 細胞計數(shù)后，用RPMI-1640培養(yǎng)液將淋巴細胞稀釋為1 106個/mL。將稀釋好的淋巴細胞加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加100細胞懸液。每孔加入1001640完全培養(yǎng)基。加入終濃度為15的CpG，同時設(shè)空白對照，混勻。37℃溫箱中培養(yǎng)48h。細胞計數(shù)。

2.3 CpG-DNA及CpG-DNA安全性實驗

免疫試驗前將淋巴細胞增殖試驗選出的CpG進行動物安全性試驗，保證CpG實際應(yīng)用時的安全。

2.3.1 質(zhì)量控制 主要檢測有無細菌、真菌等病原物質(zhì)。

2.3.2 異常毒性試驗 試驗組昆明小白鼠2只，雌、雄各1只，每只小鼠腹腔注射20CpG；陰性對照組昆明小白鼠2只，雌、雄各1只，每只小鼠腹腔注射相同劑量的生理鹽水，觀察1周。

2.3.4 亞急性毒性試驗 按給藥方式將實驗動物分為低劑量、中劑量、高劑量3個組及1個對照組，每組10只小鼠，雌、雄各半。3個劑量組分別于雙側(cè)后肢脛前肌肌肉注射CpG-DNA只，對照組給無菌生理鹽水。每周2次，連續(xù)4周，共給藥8次，每次注射體積均為以上各組于末次給藥后24h摘眼球放血，處死。試驗期間每日觀察小鼠的外表特征和行為活動、神經(jīng)癥狀、呼吸癥狀、糞便性狀等，并每周測1次體重，小鼠處死后進行病理學(xué)檢查。

3 試驗結(jié)果

3.1 淋巴細胞增殖反應(yīng)

表2 CpG序列對淋巴細胞增殖效應(yīng)Tab.2 The effect of CpG sequence on lymphocyte proliferation

3.2 CpG-DNA及CpG-DNA安全性試驗

3.2.1 質(zhì)量控制 以無菌生理鹽水稀釋合成的CpGDNA及提取的質(zhì)粒和酶切回收的CpG-DNA，未檢出細菌、真菌等病原體。

3.2.2 CpG異常毒性實驗 實驗期內(nèi)所有動物均未出現(xiàn)異常反應(yīng)，實驗結(jié)束后所有昆明小鼠全部健存且體重增加，說明試驗用CpG無異常毒性。

3.2.3 CpG超敏反應(yīng) 昆明小鼠在超敏試驗過程中未出現(xiàn)蜷縮、抽搐、被毛立起及休克等超敏反應(yīng)。

3.2.4 臨床表現(xiàn) 試驗期間各組動物活動狀態(tài)、被毛體態(tài)、飲食欲未見異常。

3.2.5 病理學(xué)檢查 末次給藥后24h，處死并剖檢小鼠，檢查小鼠臟器有無異常變化。結(jié)果，試驗組和對照組小鼠無明顯區(qū)別，各臟器均正常。

續(xù)表2

4 討論

自從20世紀(jì)20年代以來，研究者們均嘗試以各種物質(zhì)作為疫苗的佐劑從而使疫苗更有效。迄今為止，只有氫氧化鋁膠佐劑被食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）獲準(zhǔn)了在人類和動物疫苗中應(yīng)用，但它不能誘導(dǎo)產(chǎn)生Thl型反應(yīng)，且干擾細胞免疫，使得疫苗的免疫保護不全面、不持久，也存在輕度局部反應(yīng)、形成肉芽腫、局部無菌性膿腫等副作用，同時，有可能對人、畜神經(jīng)系統(tǒng)有影響等[7]。因此，研制新型的可誘導(dǎo)Thl型免疫反應(yīng)，且安全、有效、無毒副作用的佐劑成了眾多學(xué)者研究的熱點。

CpG-DNA可誘導(dǎo)Thl型免疫應(yīng)答或調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答向Thl型免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)換，使機體特異性體液免疫反應(yīng)增強。另外，CPG-DNA刺激淋巴細胞產(chǎn)生的細胞因子可作用于相同或不同類型的免疫細胞，從而組成復(fù)雜的免疫網(wǎng)絡(luò)，并具有免疫調(diào)節(jié)作用。其免疫增強活性較氫氧化鋁膠等常規(guī)佐劑高得多，既可用于滅活疫苗，也可用于活疫苗，而且與其他佐劑有強烈的協(xié)同作用，可增強一些弱抗原的免疫原性。CPG-DNA幾乎作為所有蛋白質(zhì)抗原和滅活疫苗的佐劑，而且在與其他佐劑合用時還可彌補其他佐劑誘導(dǎo)Th2性免疫應(yīng)答的缺陷，此外，一些不能與鋁鹽佐劑混合的減毒活疫苗或多價疫苗，CpG-DNA則可作為佐劑單獨使用。

本試驗依據(jù)CpG-DNA特性，制備出32條CpG序列，通過淋巴細胞增殖試驗篩選出4個對羊、小鼠淋巴細胞都有較強細胞增殖作用的序列，分別為L4、K13、CFNCpG3、CP6。

通過對選出的CpG進行無菌試驗、超敏試驗和異常毒性試驗的結(jié)果初步的研究分析表明，實驗篩選出的CpG-DNA無菌、無異常毒性、無超敏反應(yīng)。小鼠的亞急性毒性試驗結(jié)果顯示，各劑量組未見明顯的毒性反應(yīng)，解剖檢查均無明顯異常，說明該試驗已取得較為滿意的結(jié)果，為CpG佐劑的研制與應(yīng)用提供了理論依據(jù)。