杜 彬，孟 帆，樊振華，吳 忻，趙 岳，薛翼鵬，米瑞娟，王娟萍，姚敬明，閆益波

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032）

豬偽狂犬病（PR）是由豬偽狂犬病病毒（PRV）引起的一種高度接觸性、急性傳染病，豬是本病的天然宿主、貯存者和傳播者[1-3]。該病毒破壞豬的神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等，可引起豬群持續(xù)感染，終身帶毒，現(xiàn)在已成為對全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一。中國自1947年首次報道該病以來，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化規(guī)?；陌l(fā)展，許多種豬場呈暴發(fā)流行趨勢。自20世紀80年代以gE基因為代表的基因缺失疫苗研制成功以后，許多國家應(yīng)用gE基因缺失的偽狂犬病病毒弱毒疫苗，配合gE單抗ELISA鑒別診斷方法成功地撲滅了偽狂犬病。在我國gE基因缺失疫苗的廣泛使用也使該病得到有效控制。但是2012年以來，許多使用gE基因缺失活疫苗免疫的豬場出現(xiàn)了疑似偽狂犬病的臨床癥狀[4-8]，而且這種狀況在近兩三年內(nèi)已蔓延到全國二十多個省市的豬場。山西2013年以來也有母豬發(fā)生流產(chǎn)、仔豬疑似偽狂犬病死亡的類似情況，2016年、2017年、2018年項目組深入到山西不同地市，對11個規(guī)模型種豬場進行了豬偽狂犬病免疫防控和發(fā)病情況調(diào)研，同時采集血樣和病料進行了野毒感染抗體（gE）和豬偽狂犬病病毒檢測，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 試驗材料與方法

1.1 調(diào)研豬場與方法

在山西不同地市選擇有代表性的11個規(guī)模型種豬場，調(diào)查了解免疫情況、母豬產(chǎn)仔情況、仔豬生長發(fā)育和病死情況，同時采集母豬和仔豬血樣及時分離血清，-80℃冷凍保存?zhèn)溆?；采集有神?jīng)癥狀病死豬的延腦、淋巴、脾等組織，放液氮中冷凍并研磨，-80℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測試劑盒

豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測試劑盒（阻斷法）由武漢科前動物生物股份有限公司生產(chǎn)；豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測試劑盒由北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 檢測方法與判定標準

1.3.1 豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測方法（抗體檢測按照ELISA檢測試劑盒操作步驟進行） 試劑盒使用前各試劑應(yīng)先平衡至室溫；首先將20倍濃縮洗滌液稀釋成1倍洗滌液備用；將待測血清（凍存標本應(yīng)平衡至室溫并充分混勻）及陽性對照和陰性對照用標本稀釋液按1∶1稀釋。以上工作準備好，取出PRV包被板，記錄陽性對照（2孔）、陰性對照（2孔）及待檢標本，分別加入100 μL PRV陽性對照血清、PRV陰性對照血清及已稀釋待檢標本于相應(yīng)孔中；接著用封板膜蓋好反應(yīng)板，置37℃溫育30 min（gE蛋白45 min）后小心去掉封板膜，甩盡板孔中液體，向每孔中加200 μL 1倍洗滌液，靜置3 min倒掉，重復(fù)5次，最后1次在吸水紙上拍干；然后向每孔加PRV酶標記物100 μL，用封板膜蓋好反應(yīng)板，置37℃溫育30 min（gE蛋白20 min）后重復(fù)上面的洗板操作步驟，再分別向每孔中加底物液A、底物液B各1滴（50 μL），混勻，室溫避光顯色10 min；最后分別向每孔中加終止液 1滴（50 μL）終止反應(yīng)，10 min內(nèi)于630 nm波長酶標儀讀板。

豬偽狂犬病病毒gE蛋白ELISA抗體檢測：在酶標儀上測各孔OD630nm值。試驗成立的條件是陰性對照孔平均OD630nm值與陽性對照孔平均OD630nm值之差≥0.3。S=樣品孔OD630nm值，N=陰性對照孔平均OD630nm值，若S/N值≤0.35，樣品判斷為陽性，S/N＞0.4，樣品判斷為陰性，0.35＜S/N≤0.4，樣品判斷為可疑，必須重測，如結(jié)果相同，則判為抗體陽性。

1.3.2 豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測方法（病毒檢測按照PCR檢測試劑盒操作步驟進行） 取-70℃保存的血清或組織混懸液上清液和陽性、陰性對照100 μL至1.5 mL滅菌離心管中，8 000 r/min 離心 2 min，加入 200 μL 消化液和 20 μL蛋白酶K振蕩混勻后，置56℃水浴中消化1 h；取出降至室溫后，加入300 μL DNA結(jié)合液，顛倒混勻后移入吸附柱中，室溫靜置3 min，10 000 r/min離心30 s后棄去收集管液體，然后加入500 μL DNA洗滌液，10 000 r/min離心30 s，棄去收集管液體，重復(fù)加入500 μL DNA洗滌液洗滌后10 000 r/min離心1 min，將吸附柱放入新的1.5 mL滅菌離心管中，加入DNA洗脫液50 μL，室溫放置2 min，10 000 r/min離心30 s，獲取模板DNA。取2 μL模板DNA做PCR反應(yīng)，取單管單份PRV PCR反應(yīng)管，加入模板DNA、PRV陽性對照和陰性對照各2 μL，10 000 r/min順時針離心30 s。將反應(yīng)管放入PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)，按下列反應(yīng)循環(huán)條件進行擴增：94℃→3 min，后94℃ 30 s→65℃ 30 s→72℃ 30 s，共35個循環(huán)，再72℃延伸7 min。

最后取豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR產(chǎn)物10 μL與2 μL上樣緩沖液混合，加樣于凝膠孔內(nèi)，在陽性對照成立的條件下，1.5%瓊脂糖凝膠確定在217 bp處有清晰目的條帶（圖1），判為豬偽狂犬病毒株和豬圓環(huán)病毒2型陽性（圖2）。

圖1 豬偽狂犬病病毒PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果

圖2 豬圓環(huán)病毒2型PCR反應(yīng)產(chǎn)物結(jié)果

2 結(jié)果

2.1 免疫與生產(chǎn)情況調(diào)查

被調(diào)研的11個種豬場主要使用上海海利生物技術(shù)股份有限公司、洛陽普萊柯生物工程有限公司、中牧實業(yè)股份有限公司、美國輝瑞生產(chǎn)的豬偽狂犬病gE基因缺失疫苗，有8個豬場母豬采取普免（1年每季度免疫1次），仔豬1日齡滴鼻，35日齡、65日齡注射3次免疫；3個豬場母豬產(chǎn)前25～28 d跟胎免疫，仔豬 6～8周、10～12周 2次免疫。仔豬病死率為17.14%，有神經(jīng)癥狀（疑似偽狂犬病）仔豬死亡率（占仔豬死亡數(shù)）為1.41%，具體見表1。

2.2 豬偽狂犬病野毒感染gE抗體檢測結(jié)果

用豬偽狂犬病gE抗體檢測試劑盒共檢測母豬血樣388頭份，野毒感染陽性率為57.94%，仔豬血樣727頭份，陽性率為34.66%，11個場母豬野毒感染最高陽性率為83.33%、仔豬為70.00%，只有一個豬場仔豬沒有檢出野毒感染，詳見表2。

表1 免疫與生產(chǎn)情況匯總

表2 豬偽狂犬病gE抗體檢測結(jié)果

2.3 豬偽狂犬病PCR病原和豬圓環(huán)病毒2型檢測結(jié)果

用豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測試劑盒共檢測病料125份，其中豬偽狂犬病病毒陽性19份，豬圓環(huán)病毒2型陽性43份，兩種病混合感染陽性7份，詳見表3。

表3 豬偽狂犬病病毒和豬圓環(huán)病毒2型PCR檢測結(jié)果

3 小結(jié)與分析

（1）通過對11個種豬場調(diào)查證實大部分豬場母豬采取普免，仔豬采取3次免疫，仔豬實行1日齡滴鼻免疫后有效控制了初生仔豬口吐白沫、有神經(jīng)癥狀及死亡，但2016年以來豬場母豬流產(chǎn)、仔豬疑似偽狂犬病死亡時有發(fā)生，可能與豬偽狂犬病病毒發(fā)生變異或毒力增強有關(guān)。

（2）豬偽狂犬病gE抗體檢測證實豬群野毒感染率母豬為57.94%、最高感染率為83.33%；仔豬為34.66%、最高為70.00%，只有一個豬場仔豬沒有檢出野毒感染抗體。與雷宇平等報道2015年山西母豬群野毒感染率達49.06%，處于相對較高水平一致[9]。近幾年大部分豬場都實行3次免疫，臨床癥狀得到有效控制，但野毒感染率還較高，可能與環(huán)境控制、生物安全、頻繁引種、頻繁更換疫苗、病毒遺傳變異、毒力增強等有關(guān)，需要進一步開展研究。11個豬場中只有一個豬場仔豬沒有檢出野毒感染抗體，該場實行自繁自養(yǎng)，連續(xù)3年全部用上海海利疫苗免疫，沒有引進公豬，后備母豬從本場選留，環(huán)境控制較好，值得借鑒。

（3）對疑似偽狂犬病病死豬125份病料進行豬偽狂犬病PCR病毒檢測出19份陽性，項目組對陽性病料進一步做了病毒分離鑒定和遺傳變異分析，材料正在整理中。在病毒檢測中發(fā)現(xiàn)，在臨床癥狀上疑似豬偽狂犬病，但PCR病毒檢出率較低，這可能與采樣時間、部位、方法，以及采樣后在-80℃冷凍時間較長等有關(guān)。要進一步查找有關(guān)資料，請教專家，盡快解決這一難題。

（4）按照國家《動物疫病防控中長期規(guī)劃（2012—2020年）》要求，2020年我國種豬場達到PRV凈化標準。血清學(xué)調(diào)查是制訂凈化策略的基礎(chǔ)，本次檢測發(fā)現(xiàn)母豬gE抗體陽性率高達57.94%，如果采取“淘汰清群”的凈化方案，代價太大，且難以推廣落實。目前國內(nèi)的養(yǎng)殖模式，后備種豬一般都是從肥育階段選留的。在PRV野毒陽性發(fā)病的豬場，肥育豬感染帶毒率非常高，這增大了挑選出健康合格后備種豬的難度，不利于凈化工作開展。在一些陽性穩(wěn)定豬場，通過強化免疫、加強飼養(yǎng)管理和生物安全等綜合防控措施，完全可以擴繁出陰性的肥育豬。因此，對于目前大多數(shù)陽性豬場，可以通過強化免疫，先穩(wěn)定生產(chǎn)；堅持補充陰性后備種豬（自留或外購），自然淘汰陽性種豬，逐步完成凈化。如果條件允許，可以實施“檢測—淘汰”方案，以便加快凈化進度。