，，

狂犬病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，除南極洲以外的所有大洲都有報(bào)告。進(jìn)入21世紀(jì)后，狂犬病仍然是一個(gè)重要的公共健康威脅，每年大約有60 000人死于狂犬病，它是最致命的動(dòng)物傳播傳染病[1]。目前，99%的人類(lèi)狂犬病發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，主要在亞洲、非洲、拉丁美洲和加勒比海地區(qū)。亞洲狂犬病病例居世界首位，每年約有30 000人死亡(95% CI，8 100-61 400)[2]。印度是狂犬病疫情最嚴(yán)重的國(guó)家，其次是中國(guó)，2007年報(bào)告病例數(shù)達(dá)到3 300例[3]。2004-2014年，狂犬病死亡人數(shù)居我國(guó)法定感染性疾病前3位，中國(guó)狂犬病疫情形勢(shì)十分嚴(yán)峻。

在控制和消除人類(lèi)狂犬病的基本措施中，除了對(duì)人類(lèi)進(jìn)行有效接種外，還必須對(duì)狗進(jìn)行大規(guī)模免疫。在西歐、中歐、加拿大和美國(guó)大部分地區(qū)，用誘餌對(duì)野生動(dòng)物進(jìn)行口服免疫已成功地消除了當(dāng)?shù)氐暮偪袢〔p少和控制了人類(lèi)狂犬病[4]。同時(shí)，世界衛(wèi)生組織(WHO)大力鼓勵(lì)研究和開(kāi)發(fā)安全有效的犬餌口服疫苗，并為犬餌口服疫苗的研究和現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用制定了指南[5]，一些高度減毒的疫苗株，如SAG2和VRG，已被WHO推薦用于流浪狗的口腔免疫[6]，并在許多國(guó)家得到廣泛應(yīng)用[7]。

本實(shí)驗(yàn)室對(duì)狂犬病減毒活疫苗的研究從20世紀(jì)80年代就開(kāi)始了，已成功篩選出1株減毒株CTN-181。CTN-181減毒株對(duì)4周齡小鼠不致病，但對(duì)4周齡以下的小鼠而言仍會(huì)致病[8]，且該病毒具有異質(zhì)性和遺傳穩(wěn)定性差。為培育出具有更高同質(zhì)性，減毒更穩(wěn)定和更好免疫原性的減毒株，我們將CTN-181通過(guò)豚鼠頜下腺內(nèi)連續(xù)傳3代，后空斑純化，發(fā)現(xiàn)不同的空斑病毒毒力變化很大。 毒力高的可達(dá)3.16 lgLD50，低的則不致病[9]。

本文就篩選到的一株對(duì)小鼠腦內(nèi)無(wú)致病性的CTN181-3株和另一株毒力較強(qiáng)的CTN181-12克隆株進(jìn)行毒力和全基因序列對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1毒種和細(xì)胞 狂犬病毒減毒株CTN181[10]、CTN181-3和CTN181-12為本室篩選并保存；BHK-21細(xì)胞由美國(guó)泛特里軍事醫(yī)學(xué)研究所贈(zèng)送，用含10%牛血清的MEM 37 ℃培養(yǎng)。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明鼠，SPF級(jí)，10日齡/14日齡/21日齡，由本院動(dòng)物所提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)許可證編號(hào)為SCXK(京)009-0017，操作遵守《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》動(dòng)物福利要求。

1.3小鼠腦內(nèi)毒力測(cè)定 將CTN181-3和CTN181-12病毒分別接種于10、14和21日齡的小鼠腦內(nèi)，觀察14 d，記錄小鼠的發(fā)病情況，利用Reed-Muench法計(jì)算LD50。

1.4病毒空斑實(shí)驗(yàn)[8]在六孔板中制備單層BHK21細(xì)胞，將病毒稀釋至10-1～10-7系列，每孔接種0.2 mL，每個(gè)稀釋度做復(fù)孔，并加兩孔稀釋液作空白對(duì)照，輕輕搖晃，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，每孔加入4 mL含有1%甲基纖維素和2%HEPES的覆蓋物，置于35 ℃，在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后，棄覆蓋物。在每孔加入2 mL結(jié)晶紫染料溶液。染色15 min后棄掉染料，計(jì)算空斑形成單位(PFU/mL)。

1.5菌株、質(zhì)粒及主要試劑 感受態(tài)DH5α購(gòu)自天根生化科技北京有限公司；克隆載體pGEM-T Easy Vector system購(gòu)自Promega公司；QIAamp Viral RNA試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑GoScript Reverse Transcription System,購(gòu)自Promega公司；Phusion超保真DNA聚合酶Kit,購(gòu)自New England Biolabs；QIA quick Gel Extraction Kit試劑盒，購(gòu)自QIAGEN公司。

1.6引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)GenBank中登錄號(hào)為FJ959397的CTN-1株設(shè)計(jì)8對(duì)引物，用于CTN181-3株和CTN181-12株的全基因組分段擴(kuò)增和序列測(cè)定，見(jiàn)表1。

表1 狂犬病病毒CTN-1克隆株全基因組分段擴(kuò)增用引物Tab.1 Primers for whole genome amplification of rabies virus CTN-1 clone

注：引物名稱(chēng)中的“F”表示正向引物，引物名稱(chēng)中的“R”表示反向引物。

1.7病毒RNA的提取及病毒基因組的分段PCR擴(kuò)增 用QIAamp Viral RNA分別提取狂犬病毒克隆株CTN181-3和CTN181-12的基因組RNA。采用GoScript Reverse Transcription System將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,以其為模板，用表1中引物進(jìn)行分段PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：5×Phusion HF緩沖液10 μL，10 mmol/L dNTP 1 μL,10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL，DMSO 1.5 μL,DNA聚合酶0.5，cDNA 2 μL,去離子水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件：初始變性98 ℃ 30 s; 98 ℃ 10 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 90 s,共30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，采用QIA quick Gel Extraction Kit純化回收。

1.8PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆、序列測(cè)定及序列拼接與分析 將PCR純化產(chǎn)物分別與pGEM-T Easy Vector system連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑選陽(yáng)性克隆并通過(guò)菌落PCR鑒定，由上海立菲生物技術(shù)有限公司(北京)測(cè)序，每個(gè)片段發(fā)送至少3個(gè)陽(yáng)性克隆用于雙向測(cè)序。使用DNAstar MegAlign軟件剪接測(cè)序結(jié)果并進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1CTN181-3株和CTN181-12株的空斑形成情況 CTN181-3株和CTN181-12株在BHK21細(xì)胞上可形成空斑，形成的空斑均為針尖大小，大小均勻(見(jiàn)圖1)。

圖1 狂犬病毒CTN181-3株(a)和CTN181-12株(b)在BHK21細(xì)胞上形成空斑Fig.1 Plaque in BHK21 of CTN181-3 and CTN181-12

2.2CTN181-3株和CTN181-12株毒力比較 當(dāng)測(cè)定減毒株的毒力LD50時(shí)，同時(shí)測(cè)定病毒滴度(PFU)。毒力高低以二者對(duì)比lgPFU/lgLD50表示，即引起動(dòng)物死亡的LD50的病毒量(PFU)越大，毒力越低，反之毒力越高。結(jié)果顯示，在病毒感染量相差不多(6.6～7.3 lgPFU/mL)的情況下，CTN181-3對(duì)21日齡小鼠的腦內(nèi)接種未致死，而CTN181-12的LD50高達(dá)6.26 lgLD50/mL。對(duì)14 d和10 d齡小鼠的LD50，CTN181-3亦較CTN181-12低。若以PFU和LD50的差值比較，則CTN181-3和CTN181-12二株對(duì)10、14和21 d 日齡小鼠的lgPFU/lgLD50差值分別為0.07、3.40，>5.1和<-0.9、<-0.6，1.04。前者明顯大于后者，表明CTN181-3株的毒力明顯低于CTN181-12株(見(jiàn)表2)。

2.3CTN181-3株和CTN181-12株的全基因組序列比較 狂犬病病毒CTN181-3株和CTN181-12株全基因組序列全長(zhǎng)均為11 924nt，其中CTN181-3株已被GenBank收錄，登錄號(hào)為KU946961。

CTN181-3株和CTN181-12株相比，P基因和M基因各存在1個(gè)核苷酸位點(diǎn)不同，G基因存在4個(gè)位點(diǎn)不同，L基因有2個(gè)位點(diǎn)不同。這8個(gè)核苷酸位點(diǎn)導(dǎo)致2株病毒共6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的不同，即P蛋白和M蛋白各1個(gè)位點(diǎn)、G蛋白2個(gè)位點(diǎn)、L蛋白2個(gè)位點(diǎn)，如表3所示。

以上P、M、G和L區(qū)內(nèi)的6個(gè)氨基酸突變應(yīng)該是CTN181-3株毒力較CTN181-12株低的分子基礎(chǔ)。

表2 2株狂犬病毒克隆株對(duì)不同日齡小鼠的毒力比較Tab.2 Virulence comparison of CTN181-3 and CTN181-12 in different age mice

注：“-”未測(cè)

3 討 論

狂犬病病毒屬于Rhabdovirus家族的彈狀病毒屬。它是一條單鏈負(fù)鏈RNA。病毒RNA中每個(gè)基因的順序是：3′UTR-NPMGL-5′UTR，每個(gè)基因組由3個(gè)部分組成：3′非編碼區(qū)、編碼區(qū)和5′非編碼區(qū)。3′非編碼區(qū)以UUGU序列開(kāi)始，5′非編碼區(qū)以U7結(jié)束。病毒基因組大小約12 kb，其中約91%的核苷酸參與編碼5種已知蛋白，即核蛋白N、磷蛋白P、基質(zhì)蛋白M、糖蛋白G和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶L。N、P、L蛋白和基因組RNA形成核糖核蛋白復(fù)合物(RNP)，M和G蛋白被包裹在RNP的外部并與RNP相互作用。

糖蛋白G是一種跨膜蛋白，在病毒表面構(gòu)成1個(gè)突出物，它是狂犬病病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的配體，介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的結(jié)合及其在神經(jīng)系統(tǒng)中的分布，以及病毒的毒性，這與疾病是密切相關(guān)的。糖蛋白的總長(zhǎng)度為524個(gè)氨基酸，N-末端19個(gè)氨基酸構(gòu)成疏水信號(hào)肽，誘導(dǎo)新生蛋白通過(guò)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜。成熟糖蛋白含有505個(gè)氨基酸殘基，分為膜外區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)區(qū)。

表3 CTN181-3、CTN181-12株核苷酸和氨基酸位點(diǎn)差異Tab.3 Site differences of nucleotide and amino acid between CTN181-3 and CTN181-12

注：括號(hào)內(nèi)為三聯(lián)體遺傳密碼，括號(hào)外為一位氨基酸編碼

G蛋白中333的精氨酸或賴(lài)氨酸是狂犬病病毒致病的決定因素[11-12]，當(dāng)G333精氨酸或賴(lài)氨酸突變?yōu)楣劝滨０贰⒔z氨酸等其他氨基酸時(shí)，病毒的神經(jīng)毒性顯著降低。許多現(xiàn)有的狂犬病弱毒株，如SAG2，F(xiàn)lury HEP、ERA等，這個(gè)位點(diǎn)都突變?yōu)槠渌被醄13-15]。另有研究表明，G194位點(diǎn)由天冬酰胺突變?yōu)橘?lài)氨酸[16]會(huì)引起毒力的回升。本文中雖然CTN181-3株和CTN181-12株G333位點(diǎn)均為谷氨酰胺，G194位點(diǎn)也均為天冬酰胺，但CTN181-3株的毒力完全減弱，而CTN181-12株雖較其他狂犬病野毒株的毒力弱，但仍保留一定的毒力。如該二株的原始株CTN-1和攻擊毒CVS株對(duì)3周齡小鼠的lgPFU/lgLD50值分別為-1.0和-1.1[17]，而CTN181-12株為1.04。

狂犬病病毒G蛋白存在3個(gè)中和抗原位點(diǎn)，其中抗原位點(diǎn)Ⅱ位于34～200位氨基酸區(qū)段，是一個(gè)典型的空間構(gòu)象位點(diǎn)。根據(jù)T細(xì)胞的線性表位分析，糖蛋白上的18-44、244-291、292-323和336-452的氨基酸片段是必不可少的[10]。本文中CTN181-3株和CTN181-12株的G150位點(diǎn)存在不同，該位點(diǎn)位于抗原位點(diǎn)Ⅱ；另一關(guān)鍵位點(diǎn)G276也存在差異，該位點(diǎn)位于T細(xì)胞線性表位。兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)的差異應(yīng)是二者毒力不同的關(guān)鍵因素。

本研究通過(guò)CTN181-3株和CTN181-12株的全基因組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，P、M、G、L蛋白發(fā)生了8個(gè)核苷酸突變，導(dǎo)致6個(gè)位點(diǎn)的氨基酸變化，其中G150和G276氨基酸的不同，是毒力減弱的2個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)，認(rèn)為這6個(gè)氨基酸位點(diǎn)的不同是2株病毒毒力不同的分子基礎(chǔ)。