張麗萍 許麗衛(wèi) 王久榮* 袁紅朝 賀珍

摘? 要：為了提高土壤樣品全磷含量的檢測(cè)效率，研究了電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（inductively coupled plasma-optical emission spectrometer，ICP-OES）、多功能酶標(biāo)儀在土壤全磷含量檢測(cè)的應(yīng)用，并與國(guó)標(biāo)法的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，利用ICP-OES、多功能酶標(biāo)儀測(cè)定土壤全磷結(jié)果可信，檢測(cè)線性范圍為0～100 mg/L、0～2 mg/L，r2>0.995，較國(guó)標(biāo)法的0～1mg/L拓寬了檢測(cè)范圍;檢出限為0.000015mg/L、0.0085mg/L，回收率介于95%～108%，這2種方法的測(cè)定結(jié)果與國(guó)標(biāo)方法無(wú)顯著性差異。本文為土壤全磷的檢測(cè)提供了2種快速、高效的檢測(cè)方法，對(duì)快速測(cè)試大量土壤樣品的全磷含量，及時(shí)指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。

關(guān)鍵詞：電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP-OES）;多功能酶標(biāo)儀;紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì);土壤全磷

中圖分類號(hào)：X142? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.11974/nyyjs.20181032006

磷元素（P）是植物生長(zhǎng)發(fā)育的必需營(yíng)養(yǎng)元素，它以多種方式參與土壤系統(tǒng)內(nèi)的各種代謝過(guò)程，為不可再生的礦質(zhì)資源，是評(píng)價(jià)土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)之一 [1-3]。傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)方法采用鉬銻抗紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法檢測(cè)，存在樣品pH、溫度、顯色時(shí)間、儀器無(wú)自動(dòng)進(jìn)樣器等因素影響，對(duì)分析大量樣品操作較復(fù)雜，耗時(shí)且工作量大[4-5]。隨科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，檢測(cè)儀器日漸豐富，拓寬了磷素的測(cè)定技術(shù)[6-9]。本文依據(jù)磷素測(cè)定原理和儀器硬件原理，研究了ICP-OES、多功能酶標(biāo)儀、測(cè)定隨機(jī)選取不同地區(qū)土壤的全磷含量，比較了三者準(zhǔn)確度、回收率、精密度和重復(fù)性，旨在為實(shí)驗(yàn)室日漸豐富的儀器拓寬檢測(cè)項(xiàng)目提供技術(shù)性支持，增加磷元素含量檢測(cè)手段，加快分析速度，減少試劑的使用，保護(hù)環(huán)境。

1? ? ?材料與方法

1.1? ? ?試驗(yàn)材料及主要試劑

供試土壤樣品1-2號(hào)采自湖南桃源;3-4號(hào)采自廣西環(huán)江;5-7號(hào)采自湖南洞庭湖濕地;8-37號(hào)采自湖南長(zhǎng)沙近郊金井，樣品經(jīng)風(fēng)干后過(guò)60目篩待用。供試儀器為紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（Lambda 25，美國(guó)，PerkinElmer）、多功能酶標(biāo)儀（Infinite M200 PRO，瑞士，TECAN）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（720 ICP-OES，美國(guó)，Agilent）。試驗(yàn)主要試劑：去離子水，無(wú)水乙醇、98%濃硫酸、NaOH、KH2PO4、酒石酸銻鉀、鉬酸銨、抗壞血酸等，所有的試劑均為分析純。

1.2? ? ?磷素顯色原理和儀器測(cè)定原理

磷素顯色檢測(cè)原理：在酸性介質(zhì)中，正磷酸鹽與鉬酸銨反應(yīng)，在銻鹽存在下生成磷鉬雜多酸后，立即被抗壞血酸還原，生成藍(lán)色的絡(luò)合物，在一定波長(zhǎng)下，比色測(cè)吸光度定量。

紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀測(cè)定原理：紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)與酶標(biāo)儀工作原理基本相同，在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)量一定濃度樣品溶液吸光度，根據(jù)朗伯比爾定律算出樣品溶液的濃度。 酶標(biāo)儀因取樣量少現(xiàn)被廣泛用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

ICP-OES測(cè)定原理：樣品經(jīng)處理制成溶液后，經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣器引入霧化器，經(jīng)霧化室被載氣帶入溫度達(dá)6000～10000K的等離子體焰矩，試樣中組分被原子化、電離、激發(fā)，當(dāng)這些激發(fā)態(tài)的粒子回到穩(wěn)態(tài)時(shí)放出一定的能量（表現(xiàn)為一定波長(zhǎng)的光譜）， 測(cè)定每種元素特有的譜線和強(qiáng)度，與標(biāo)準(zhǔn)溶液相比，就可對(duì)樣品進(jìn)行定性與定量分析。

1.3? ? ?試驗(yàn)方法

1.3.1? ? ?樣品的消解

土壤樣品按照國(guó)標(biāo)方法（LY/T 1232-1999 森林土壤全磷的測(cè)定）消解，將所含磷素化合物全部氧化成正磷酸鹽， 轉(zhuǎn)移定容至50mL的容量瓶，混合均勻后，作為待測(cè)溶液。

1.3.2? ? ?紫外可見(jiàn)分光度計(jì)、酶標(biāo)儀測(cè)定土壤全磷

吸取待測(cè)液5～50mL容量瓶，加入少量水，滴入2滴2，4二硝基酚后，用稀堿調(diào)pH至微黃，再加入5mL鉬銻抗顯色劑，室溫下（25℃）放置 30h顯色后，每份顯色樣品另取200uL至96孔酶標(biāo)板;標(biāo)準(zhǔn)系列按50mL容量瓶中先分別加入0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL濃度為50mg/L的PO43--P標(biāo)準(zhǔn)溶液，各加5mL鉬銻抗顯色劑，去離子水定容，配制成濃度為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液。在882nm 波長(zhǎng)下，紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)、酶標(biāo)儀按照1.2中測(cè)定原理分別比色測(cè)吸光度定量。

1.3.3? ? ?ICP-OES測(cè)定土壤全磷

用去離子水稀釋待測(cè)液10倍（0.5mL 待測(cè)液加4.5mL去離子水）直接上機(jī)進(jìn)行測(cè)試。標(biāo)準(zhǔn)樣品系列按50mL容量瓶中先分別加入0、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6和10 mL濃度為50 mg/L的PO43--P標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入與樣品同等背景離子強(qiáng)度的對(duì)照溶液，后用去離子水定容。按照1.2 中ICP的測(cè)定原理，選擇波長(zhǎng)（214.914nm，178.222nm）下測(cè)定其響應(yīng)值。

1.3.4? ? ?紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)、酶標(biāo)儀和ICP-OES測(cè)定土壤全磷的方法驗(yàn)證

1-7號(hào)樣品的消解液，分別用標(biāo)準(zhǔn)加入法做回收率測(cè)定;用標(biāo)準(zhǔn)土樣GBW07403、GBW07404、GBW07454、GBW07457同時(shí)處理3份做重復(fù)性試驗(yàn)，評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確度同一樣品待測(cè)液分別在3臺(tái)儀器上運(yùn)行儀器上連續(xù)運(yùn)行7次，評(píng)價(jià)方法的精密度。

2? ? ?結(jié)果與分析

2.1? ? 紫外-可見(jiàn)光分光度計(jì)、酶標(biāo)儀和ICP-OES標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及檢測(cè)范圍的確定

配制好用于土壤全磷測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液后分別經(jīng)3臺(tái)儀器運(yùn)行后， PO43--P濃度與儀器響應(yīng)值（吸光度或離子強(qiáng)度）呈良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2? ?紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)、酶標(biāo)儀和ICP-OES儀分析結(jié)果比較

由下表2可以看出，土壤樣品經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)、酶標(biāo)儀和ICP-OES分析儀檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定值均落在可信范圍內(nèi)（GBW07403其全磷含量為320±18mg/kg、GBW07404其全磷含量為695±28mg/kg、GBW07454其全磷含量為857±39mg/kg、GBW07457其全磷含量為493±27 mg/kg），3種儀器測(cè)定平均結(jié)果的相對(duì)偏差小于3%，按國(guó)標(biāo)法方要求絕對(duì)偏差小于0.05%。結(jié)果表明，3臺(tái)儀器的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異。

2.3? ? ?準(zhǔn)確度與精密度、回收率及檢出限的測(cè)定

在不同土壤及土壤含量存在低中高差異情況下，通過(guò)外添加0.1、0.35、0.60 mg/L（0.70 mg/L）磷濃度（n=3）進(jìn)行回收率測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果表明， ICP-OES和酶標(biāo)儀測(cè)定7個(gè)待測(cè)土壤樣品的平均回收率為95%～108%，與紫外-可見(jiàn)光分光度計(jì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。選擇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW07403、GBW07404、GBW07454、GBW07457，按照傳統(tǒng)前處理方法做3份重復(fù)（n=3）待測(cè)液，分別經(jīng)過(guò)3臺(tái)儀器檢測(cè)做重復(fù)性，一份進(jìn)行7次測(cè)定做精密度及檢測(cè)限，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，ICP-OES和酶標(biāo)儀測(cè)定4個(gè)標(biāo)準(zhǔn)土樣待測(cè)液中磷濃度的重復(fù)性和精密性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別小于3.58%和3.81%，略差于國(guó)標(biāo)法，這可能是與硫酸基質(zhì)有關(guān);檢出限為0.000015～0.0085 mg/L，優(yōu)于國(guó)標(biāo)法。

2.4? ? ?實(shí)際樣品方法驗(yàn)證

隨機(jī)采取長(zhǎng)沙近郊30個(gè)土壤樣品，按照國(guó)標(biāo)法前處理，經(jīng)紫外-可見(jiàn)分光度計(jì)、酶標(biāo)儀和ICP-OES分析儀檢測(cè)，經(jīng)比較ICP-OES、酶標(biāo)儀測(cè)定結(jié)果與紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，絕對(duì)偏差均<0.05%，結(jié)果見(jiàn)表5。

3? ? ?討論

3.1? ? ?氫氧化鈉熔融法測(cè)定土壤全磷的注意事項(xiàng)

由于不同地區(qū)土壤樣品的pH以及金屬元素含量存在差異，在采用氫氧化鈉熔融后，某些樣品按照標(biāo)準(zhǔn)方法加入7mL 1：3 硫酸轉(zhuǎn)移，定容后溶液中仍會(huì)存在大量絮狀物，這時(shí)要求續(xù)加硫酸，保證絮狀物完全溶解，如若轉(zhuǎn)移酸度不夠，存在絮狀物，會(huì)造成土壤全磷檢測(cè)結(jié)果偏低，如廣西環(huán)江部分堿土樣品就存在這個(gè)問(wèn)題。在利用磷素顯色原理檢測(cè)時(shí)，由于轉(zhuǎn)移酸度不一致，需先對(duì)樣品逐一調(diào)整pH，再加入鉬銻抗顯色劑顯色檢測(cè)。若是同一批次土壤轉(zhuǎn)移酸度一致，有文獻(xiàn)報(bào)道可以將鉬銻抗顯色劑的酸度調(diào)整為4.5N硫酸[10];磷素的顯色反應(yīng)受環(huán)境溫度及顯色時(shí)間相關(guān)性很大，冬天檢測(cè)時(shí)需控制環(huán)境溫度，提前開(kāi)空調(diào)，或放入烘箱中保證顯色溫度達(dá)到25℃，可加快顯色;為避免系統(tǒng)誤差，標(biāo)線制作與樣品的顯色pH、溫度、時(shí)間需保持一致。

在利用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)樣品時(shí)，由于酶標(biāo)板是微量測(cè)定，所以樣品與標(biāo)樣的微小體積不一致，對(duì)結(jié)果都會(huì)影響比較大。樣品板本身有背景吸收，所以建議先做空白板的檢測(cè)，再加入樣品進(jìn)行檢測(cè);檢測(cè)為垂直檢測(cè)，酶標(biāo)板加入待測(cè)液時(shí)盡量一個(gè)方向緩慢打入，減少晃動(dòng)及液體掛壁，保持液體厚度與標(biāo)準(zhǔn)系列一致。多功能酶標(biāo)儀要求測(cè)試體積小于250uL，使用該方法可以減少試劑的使用及廢液產(chǎn)出，有利于保護(hù)環(huán)境。

在利用感耦合等離子體質(zhì)譜儀測(cè)定樣品時(shí)，由于土壤樣品經(jīng)過(guò)氫氧化鈉熔融，硫酸溶液轉(zhuǎn)移，直接上機(jī)存在鹽濃度大，硫酸密度大易積存矩管，基底背景干擾大，引起火焰抖動(dòng)，因而需要將待測(cè)液稀釋10倍后上機(jī)，由于存在鈉離子的干擾且稀釋后磷素濃度變低，因而儀器需重新延長(zhǎng)積分時(shí)間從1s延長(zhǎng)至3s，且配置的標(biāo)準(zhǔn)系列需要添加與檢測(cè)樣品一致背景的試劑空白。這也是影響ICP-OES測(cè)定土壤全磷精密度的主要原因，如若用濕法消解，RSD可以得到極大改善。

3.2? ? ?3種儀器各自優(yōu)勢(shì)

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)是標(biāo)準(zhǔn)方法要求的測(cè)定儀器，使用該方法工作量大，但精密度、重復(fù)性、準(zhǔn)確度良好;酶標(biāo)儀由于樣品厚度容易變化，其精度沒(méi)有紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)高，需要多做平行，取平均值;但其少于2min就可以將一塊96孔酶標(biāo)板上的所有樣品檢測(cè)完，效率更高，而測(cè)定的待測(cè)液少于250uL，更加節(jié)約試劑，產(chǎn)出廢液更少，更保護(hù)環(huán)境。ICP-OES分析儀在樣品熔融轉(zhuǎn)移后，稀釋10倍可以直接上機(jī)檢測(cè)，減少了顯色反應(yīng)這一步驟，儀器帶有自動(dòng)進(jìn)樣器，大大減少了工作量，且可以同時(shí)檢測(cè)其他元素，如鉀等，該方法可以用于大量樣品快速測(cè)定。從數(shù)據(jù)結(jié)果看，其由于存在背景干擾及稀釋因素的影響，RSD較紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)法大，但如若改變樣品前處理方式，如應(yīng)用微波消解或硝酸高氯酸混酸濕法消煮等樣品前處理方式，這個(gè)問(wèn)題就迎刃而解，且同時(shí)可以快速檢測(cè)更多元素，ICP-OES是現(xiàn)行大量元素測(cè)定的主要方式。

4? ? ? 結(jié)論

本文按照國(guó)標(biāo)法對(duì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)土樣及實(shí)際土壤樣品進(jìn)行氫氧化鈉熔融前處理，經(jīng)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、多功能酶標(biāo)儀、ICP-OES測(cè)定，結(jié)果表明：酶標(biāo)儀、ICP-OES法測(cè)定土壤全磷的結(jié)果， 線性、精度、重復(fù)性、回收率、準(zhǔn)確性良好，與國(guó)標(biāo)法紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的測(cè)定結(jié)果基本能符合，無(wú)顯著性差異，其結(jié)果均能滿足全磷分析的準(zhǔn)確度要求。因此，酶標(biāo)儀、ICP-OES可以成為土壤全磷的分析檢測(cè)儀器，與傳統(tǒng)方法比較，這2種方法準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、快速。鑒于植物樣品硝酸高氯酸消解基質(zhì)更簡(jiǎn)單， 酶標(biāo)儀、ICP-OES也可以測(cè)定植物樣品的全磷及其他元素。

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