徐 凱，魏永鴿，郝海軍

(1.黃河科技學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450005；2.上海雷允上藥業(yè)有限公司 技術(shù)中心，上海 201401；3.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 鄭州 450052)

隨著核磁共振儀性能的不斷提高及傅立葉變換技術(shù)的應(yīng)用，近年來核磁共振技術(shù)越來越多地應(yīng)用于定量分析領(lǐng)域[1-3]。目前，核磁共振定量法(qNMR)在食品、藥品、農(nóng)藥等領(lǐng)域日益得到關(guān)注。中國(guó)、美國(guó)、日本及英國(guó)等各國(guó)藥典均收載了qNMR法。在藥物研發(fā)過程中，qNMR法不僅可準(zhǔn)確測(cè)定原料藥、中間體及制劑中的藥物含量，還可同時(shí)鑒別假冒、偽劣產(chǎn)品，在藥品質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用[4-6]。

黃藤素即鹽酸巴馬汀，是從防己科植物黃藤FibrurearecisaPierre.的根莖中提取得到的一種季銨型生物堿，具有良好的清熱解毒效果，臨床上主要用于婦科炎癥、腸炎、呼吸道及泌尿道感染等。黃藤素片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部[7]，該標(biāo)準(zhǔn)采用高效液相色譜法測(cè)定黃藤素片中的鹽酸巴馬汀含量，薄層色譜法進(jìn)行鑒別、檢定，但操作過程較為復(fù)雜，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。近年來市場(chǎng)上出現(xiàn)黃藤素片假冒偽劣產(chǎn)品[8]，因此迫切需要建立一種簡(jiǎn)單、快速測(cè)定黃藤素片中鹽酸巴馬汀含量及鑒別假冒偽劣產(chǎn)品的分析方法。在前期研究的基礎(chǔ)上[9]，本文首先采用NMR法(1H NMR、13C NMR和HSQC譜)對(duì)黃藤素片提取物進(jìn)行定性鑒別，進(jìn)一步采用qNMR法對(duì)提取物進(jìn)行含量測(cè)定。將qNMR法用于黃藤素片的質(zhì)量控制，可實(shí)現(xiàn)定量分析與定性鑒別同時(shí)進(jìn)行，且操作簡(jiǎn)單，省時(shí)省力，為推廣qNMR法應(yīng)用于藥品質(zhì)量控制提供了經(jīng)驗(yàn)，也為其他藥品的質(zhì)量控制提供了有價(jià)值的參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

Bruker AVANCE Ⅲ400型核磁共振儀(瑞士布魯克公司)；分析天平(十萬分之一天平，德國(guó)Sartorius公司)；PS-40A型超聲儀(菏澤儀器儀表有限責(zé)任公司)；氘代甲醇(CD3OD，氘代度99.8%，美國(guó)Sigma-Aldrich公司)；黃藤素片(批號(hào)：20180216、20180422、20180717，云南植物藥業(yè)有限公司)；鹽酸巴馬汀(批號(hào)：H-015-130626，含量>98%，成都瑞芬思生物科技有限公司)；馬來酸對(duì)照品(含量為99.7%，批號(hào)：190015-201302，中國(guó)食品藥品檢定研究院)。

1.2 內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱取馬來酸10mg置于10mL容量瓶中，加入約7mL氘代甲醇超聲3min后放至室溫，用氘代甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為1.0g/L的馬來酸內(nèi)標(biāo)溶液，密封備用。

1.3 樣品溶液的配制

精密稱取鹽酸巴馬汀對(duì)照品100mg，置于10mL容量瓶中，加入約7mL氘代甲醇超聲3min后放至室溫，用氘代甲醇定容至刻度，即得質(zhì)量濃度為10g/L的對(duì)照品溶液。

取15片黃藤素片，于研缽中研磨成細(xì)粉。精密稱取約5mg(以鹽酸巴馬汀計(jì))置于5mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液約4mL，超聲5min后放置至室溫，以馬來酸內(nèi)標(biāo)溶液定容至刻度。過0.45μm微孔濾膜后轉(zhuǎn)移至核磁管中，即得黃藤素片供試品溶液。

1.4 測(cè)試條件

采用zg30脈沖序列，恒溫測(cè)定溫度為300K，譜寬(SWH)為8012Hz，中心頻率(O1)設(shè)為2503Hz，采集時(shí)間(AQ)為4.01s，弛豫時(shí)間(D1)為15s，樣品掃描次數(shù)(NS) 為64次，空掃次數(shù)(DS)為2次。

1.5 含量計(jì)算方法

將測(cè)得的1H NMR進(jìn)行相位校正，對(duì)定量峰和內(nèi)標(biāo)峰積分5次，求取平均值，按照下式計(jì)算鹽酸巴馬汀含量：Wu=WsAuEu/(AsEs)，式中：Wu為鹽酸巴馬汀的質(zhì)量(mg)；Au為鹽酸巴馬汀的定量峰面積；As為馬來酸內(nèi)標(biāo)的峰面積；Ws為馬來酸內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量(mg)；Eu為鹽酸巴馬汀的質(zhì)子當(dāng)量(鹽酸巴馬汀相對(duì)分子質(zhì)量與定量峰代表的質(zhì)子數(shù)之比)；Es為馬來酸的質(zhì)子當(dāng)量(馬來酸相對(duì)分子質(zhì)量與內(nèi)標(biāo)峰代表的質(zhì)子數(shù)之比)。

圖1 黃藤素片提取物的1H NMR(A)、13C NMR(B)與HSQC(C)圖譜Fig.1 1H NMR(A),13C NMR(B)and HSQC(C) spectra of the extract of Huangtengsu tablet

2 結(jié)果與討論

2.1 黃藤素片提取物的鑒別

取適量黃藤素片粉末加入氘代甲醇，超聲后放至室溫，測(cè)定其1H NMR、13C NMR和HSQC譜(圖1)。1H NMR譜(圖1A)顯示22個(gè)質(zhì)子[9]，包括低場(chǎng)區(qū)6個(gè)芳香質(zhì)子，5位和6位的2個(gè)亞甲基質(zhì)子，2、3、9、10位的4個(gè)甲氧基質(zhì)子。13C NMR譜(圖1B)顯示21個(gè)碳信號(hào)，對(duì)應(yīng)于結(jié)構(gòu)中的21個(gè)碳原子。HSQC譜(圖1C)顯示12個(gè)相關(guān)點(diǎn)(見表1)，9個(gè)季碳無相關(guān)點(diǎn)。綜上，1H NMR、13C NMR和HSQC譜的基本信息與鹽酸巴馬汀分子式(C21H22ClNO4)相符。

2.2 氘代溶劑與內(nèi)標(biāo)的選擇

考察了氘代甲醇和氘代二甲基亞砜作為提取溶劑時(shí)對(duì)黃藤素片中鹽酸巴馬汀含量測(cè)定的影響。結(jié)果顯示，以氘代二甲基亞砜為提取溶劑時(shí)，1H NMR的雜質(zhì)成分較多，這可能是由于氘代二甲基亞砜溶解了片劑輔料所致[10]。另外，氘代二甲基亞砜樣品溶液在冬季室溫配制時(shí)極易凝固，需加熱溶解后才可測(cè)定，而加熱處理會(huì)導(dǎo)致溶液體積發(fā)生變化，對(duì)測(cè)定結(jié)果造成一定影響，且樣品溶液粘度較高。而以氘代甲醇作為提取溶劑時(shí)，不僅無片劑輔料雜質(zhì)成分干擾，且樣品溶液狀態(tài)不受季節(jié)影響，操作簡(jiǎn)單方便。綜合考慮，最終選用氘代甲醇作為提取溶劑。

內(nèi)標(biāo)物一般選擇易于識(shí)別且不干擾樣品定量的尖銳單峰。本實(shí)驗(yàn)選擇氘代甲醇為溶劑，馬來酸為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，混合物的1H NMR譜圖見圖2。馬來酸溶劑峰在δ6.31處呈尖銳的單峰，與鹽酸巴馬汀的1H NMR峰不重疊，專屬性較高。因此，選擇馬來酸作為內(nèi)標(biāo)物。由于鹽酸巴馬汀在δ7.07處為一尖銳、獨(dú)立的單峰，附近無其他雜質(zhì)干擾，因此選擇該處信號(hào)作為定量峰。

2.3 方法學(xué)研究

前期對(duì)qNMR采集時(shí)間、弛豫時(shí)間和樣品掃描次數(shù)等基本測(cè)試參數(shù)的研究[9]表明，當(dāng)采集時(shí)間大于4.01s時(shí)可保證FID信號(hào)衰減完全，得到的1H NMR譜基底無震蕩，因此確定采集時(shí)間為4.01s。當(dāng)弛豫時(shí)間大于15s時(shí)，樣品定量峰與內(nèi)標(biāo)峰的比值基本保持不變，為節(jié)約測(cè)試時(shí)間，確定弛豫時(shí)間為15s。同理，樣品掃描次數(shù)確定為64次。另外，定量峰與內(nèi)標(biāo)峰的積分區(qū)域?qū)y(cè)試結(jié)果影響也較大，本文選取峰形輪廓線與水平基線交叉處作為積分區(qū)域，測(cè)得待測(cè)物定量峰的積分區(qū)域?yàn)棣?.01～7.13，內(nèi)標(biāo)峰的積分區(qū)域?yàn)棣?.27～6.35。本實(shí)驗(yàn)在此條件下進(jìn)行方法學(xué)研究。

2.3.1線性關(guān)系以“1.2”的內(nèi)標(biāo)溶液配制1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 g/L的鹽酸巴馬汀對(duì)照品系列溶液。以鹽酸巴馬汀與馬來酸的定量峰面積之比(As/Ar)為橫坐標(biāo)(x)，鹽酸巴馬汀與馬來酸的質(zhì)量比(ms/mr)為縱坐標(biāo)(y)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=3.820 4x-0.092 2(r=0.999 3)，線性范圍為1.00～10.00 g/L。

2.3.2儀器精密度取供試品溶液，按“1.4”條件連續(xù)測(cè)定6次，獲取1H NMR并積分(5次積分結(jié)果取平均值)，計(jì)算鹽酸巴馬汀定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。結(jié)果顯示，6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.39%。

表1 黃藤素片提取物的結(jié)構(gòu)解析Table 1 Structural analysis of the extract of Huangtengsu tablet

圖2 黃藤素片提取物與馬來酸混合物的1H NMR圖譜Fig.2 1H NMR spectrum of the extract of Huangtengsu tablet and maleic acid mixture

2.3.3樣品穩(wěn)定性取同一份樣品分別于0、2、4、8、12 h進(jìn)行測(cè)定，獲取1H NMR并積分(5次積分結(jié)果取平均值)，計(jì)算鹽酸巴馬汀定量峰與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值。結(jié)果顯示，5次測(cè)定結(jié)果的RSD為0.65%，因此樣品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.4重復(fù)性按照“1.3”方法平行配制6份樣品溶液，獲取1H NMR并積分(5次積分結(jié)果取平均值)，計(jì)算黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量。結(jié)果顯示，6份樣品測(cè)定結(jié)果的RSD為1.7%。因此，qNMR法測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性良好。

2.3.5檢出限與定量下限取對(duì)照品溶液逐步進(jìn)行稀釋，按照“1.4”測(cè)試條件分別進(jìn)樣測(cè)定，以鹽酸巴馬汀的峰高與基線波動(dòng)高度比值作為信噪比(S/N)，以S/N為3時(shí)的鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度作為檢出限(LOD)，S/N為10時(shí)的鹽酸巴馬汀質(zhì)量濃度作為定量下限(LOQ)[3-4]。得到所建立qNMR方法的LOD為8.5 mg/L，LOQ為25.0 mg/L。

2.3.6回收率試驗(yàn)按照“1.3”方法配制供試品溶液，分別加入低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的鹽酸巴馬汀對(duì)照品溶液，每個(gè)濃度平行配制3份，采用建立的qNMR法進(jìn)行測(cè)試并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為98.5%～104%，RSD為1.4%～2.3%。

表2 片劑中鹽酸巴馬汀的回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Recoveries of hydrochloride palmatine in tablets

表 3 不同方法對(duì)片劑中鹽酸巴馬汀含量的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination result of hydrochloride palmatine in tablets by different methods

2.4 與高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果的比較

參考《中國(guó)藥典》2015年版一部的方法對(duì)黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示(表3)，高效液相色譜法與核磁共振波譜法的測(cè)定含量較為接近。黃藤素片的標(biāo)示量為100 mg/片，按照《中國(guó)藥典》2015年版的要求，黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量應(yīng)為標(biāo)示量的90.0%～110%，因此兩種測(cè)定方法的結(jié)果均符合《中國(guó)藥典》要求。

3 結(jié) 論

本研究采用qNMR法測(cè)定了黃藤素片中鹽酸巴馬汀的含量，測(cè)定無需對(duì)照品和分離過程，樣品配制過程簡(jiǎn)單，可有效減小樣品前處理對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。建立的qNMR法同時(shí)實(shí)現(xiàn)了黃藤素片中鹽酸巴馬汀的定量分析與定性鑒別，且操作簡(jiǎn)單、快速、省時(shí)省力，測(cè)定結(jié)果與高效液相色譜法基本一致。由于qNMR法集定性鑒別與定量測(cè)定于一體，在藥物質(zhì)量控制包括有效成分鑒別、雜質(zhì)檢查及有效成分含量測(cè)定等中的應(yīng)用將日益廣泛，不僅有助于制藥企業(yè)控制產(chǎn)品質(zhì)量，也為我國(guó)打擊假冒偽劣藥品提供了一種非常有力的監(jiān)測(cè)手段。