尹 昕，陳 宸

（天津師范大學電子與通信工程學院，天津300387）

生物體的疾病是細胞病變和細胞失去程序性調(diào)控的綜合反應[1].在胚胎的發(fā)育過程中，細胞在特定化學物質(zhì)的誘導下定向運動，如果未能正確控制細胞的運動，將導致發(fā)育成的生物體產(chǎn)生嚴重的疾病或缺陷.追蹤胚胎細胞的運動軌跡，研究其運動特性，進而檢測其趨化特征，進行運動模式的預測和控制，將有助于醫(yī)學研究人員治療具有高度擴散性的疾病以及進行有針對性的藥理學研究.因此，對于胚胎細胞運動過程的實時追蹤和分析已成為當前國際上生命科學研究的一個熱點，眾多學者在此方面進行了探索.文獻[2-4]通過顯微圖像采集系統(tǒng)自動捕獲雞胚胎細胞顯微圖像，采用顯微鏡的形態(tài)觀察方法觀察雞胚胎細胞的運動過程和細胞簇的運動趨勢，其中多個感興趣追蹤區(qū)域間的切換由手動完成，這種追蹤方式需要多個有實際相關(guān)知識和經(jīng)驗的操作者交替工作，如果細胞的運動變化發(fā)生在操作者交替的過程中，則相關(guān)的變化信息就無法捕捉到，因而無法實現(xiàn)長期的實時追蹤.文獻[5]采用基于Boyden Chamber的方法進行細胞運動特性的自動檢測，該方法利用染色，人工統(tǒng)計細胞數(shù)目來評估細胞的遷移，但無法得到動態(tài)同步監(jiān)控細胞的顯微圖像.文獻[6]通過建立細胞集落劃痕的方法間接評估個體細胞的運動特性，這種方法雖然操作簡單，但無法適用于胚胎細胞整體運動趨勢的追蹤研究.

綜合生物研究者的關(guān)注點和胚胎細胞自身的特點，一個比較完善的胚胎細胞追蹤與分析系統(tǒng)應具備如下功能：首先，考慮到胚胎細胞的生理特點及其定向運動的特征，在追蹤細胞簇整體運動的同時，應能夠?qū)崟r觀測胚胎細胞單粒子的形態(tài)；其次，為了獲得細胞簇整體的運動趨勢，必須同時追蹤批量胚胎細胞；再次，考慮到胚胎細胞的活體特性，應盡可能減少追蹤的處理時間，加強追蹤算法的實時性；最后，為了避免人工操作造成的誤差，上述工作應自動完成[7-8].然而，胚胎細胞整體運動趨勢的獲取與單粒子高分辨率細微結(jié)構(gòu)的觀測是一對矛盾.在顯微視覺系統(tǒng)中，視野采集放大倍數(shù)越大，視野目標有效圖像的分辨率越高，視野圖像分析結(jié)果越精確；但對于非均勻分布的追蹤目標，視野放大倍數(shù)的提高將導致可觀測空間變小，進而帶來較大的視野抽樣誤差.反之，如降低采樣倍率，可以減小視野抽樣誤差，但目標的有效圖像分辨率也會同時降低，加大顯微圖像處理與分析的難度.此外，暗場顯微環(huán)境利用丁達爾光學效應提高觀測物體本身與背景的對比，這雖然有利于觀察運動的物體，但無法獲取物體的細節(jié)信息[9].因此，為了獲得胚胎細胞簇精確的運動趨勢，需要在低倍暗場顯微鏡下進行觀察；而為了得到單個胚胎細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，又必須使用高倍明場顯微鏡.

針對以上問題，本文提出基于MR-6的批量胚胎細胞的自動追蹤算法，該算法將微操作機器人系統(tǒng)引入胚胎細胞的遷移追蹤與分析，根據(jù)顯微系統(tǒng)的光學特性，實現(xiàn)快速追蹤胚胎細胞，獲取全局信息，并實現(xiàn)胚胎細胞感興趣區(qū)域細節(jié)信息獲取的自動化.在實驗部分，將雞胚胎的原腸胚形成過程作為模型，利用該算法完成雞胚胎細胞遷移的自動追蹤，并同時自動獲取細胞整體運動趨勢及感興趣區(qū)域，以驗證算法的有效性.

1 批量胚胎細胞的自動追蹤算法

本研究算法流程如圖1所示.

圖1 胚胎細胞追蹤自動化系統(tǒng)框架Fig.1 Framework of embryonic cell tracking automation system

1.1 胚胎細胞整體運動趨勢分析的自動化

胚胎細胞整體運動趨勢的分析在低倍率物鏡下進行，對胚胎細胞全局顯微圖像中的批量胚胎細胞進行追蹤，獲取全局顯微圖像中批量胚胎細胞的個數(shù)及結(jié)構(gòu)分布圖，進而得到批量胚胎細胞的運動軌跡及運動速度，并形成感興趣區(qū)域.

（1）暗視場圖像采集

為了實現(xiàn)多細胞的快速精確追蹤定位，需要提高胚胎細胞輪廓與背景之間的對比.在光的傳播過程中，光線照射到粒子，當粒子尺寸小于入射光波長時，光波將環(huán)繞微粒而向其四周放射散射光.結(jié)合顯微鏡光學成像原理，使用暗視場完成對低倍率胚胎細胞全局顯微圖像的獲取.

（2）胚胎細胞遷移的追蹤策略

細胞的匹配是批量胚胎細胞遷移追蹤的關(guān)鍵，考慮到細胞的運動具有群體性[10-11]，本文提出基于群體細胞追蹤獲取單一細胞運動信息的追蹤策略，該策略降低了識別的難度，同時能保證識別的正確率，其基本思想如下：

①設追蹤的任意連續(xù)2幀圖像為Ti、Ti+1，設C1為Ti中的任意一個細胞，圍繞C1在Ti和Ti+1中分別選擇一個診斷窗口wi和wi+1，對診斷窗口wi用多波段頻率特征進行標識，并根據(jù)標識特征在Ti+1中定位相應的wi+1.

②以wi+1的中心為圓心、R為半徑作一圓，則圓內(nèi)的所有細胞C1j（j=1，2，3，…，m）都是C1所要配對的候選細胞，m為候選細胞的總數(shù)目.以每一個細胞C1j為中心，取與診斷窗口wi大小相同的診斷窗口，設為wij′（j=1，2，3，…，m）.

③ 計算 2 個診斷窗口 wi與 wij′（j=1，2，3，…，m）的相關(guān)系數(shù) Cij：

其中：f和g分別為診斷窗口wi和wij′的灰度分布函數(shù)，fm和gm分別為診斷窗口wi和wij′的的灰度平均值.

④在Ti+1中取得最大相關(guān)系數(shù)值的細胞C1j被認為與Ti中的細胞C1為同一細胞.

⑤記錄C1細胞在Ti+1中的位置信息，位置信息由下式計算

其中： i、 j為圖像像素的橫、縱坐標位置；h（i，j）為坐標（i，j）處的灰度值；Ω為屬于同一細胞的像素集合.

進一步，在細胞整體運動趨勢的自動追蹤策略中，細胞能夠正確匹配的關(guān)鍵是準確標識診斷窗口的多波段頻率特征.模擬人類視覺系統(tǒng)的并行多通道性[12-13]，利用顯微鏡的光學特性，本算法采用基于光學特性的多波段頻率特征獲取的追蹤策略，其基本思想如下：

①基于空間非相干照明的消象差成象系統(tǒng)，其光學傳遞函數(shù)的規(guī)范化傅里葉變換為

其中：fx、fy為空間頻域，xi、yi為時間域，Hi（fx，fy）為點脈沖強度，?1（fx，fy）為光學傳遞函數(shù).

設顯微系統(tǒng)的光學傳遞函數(shù)為Hlp（u，v），為了削弱細胞的細節(jié)成分，構(gòu)造基于光學特性的高通濾波器：

②為了避免高通濾波時，圖像的平均值降為零，進行高通濾波補償，構(gòu)造高頻強調(diào)濾波器的傳遞函數(shù)為

其中：a為校正偏移；b為高頻突出系數(shù)，b＞1.

③設診斷窗口圖像為f（x，y），其傅里葉變換為G（u，v），則診斷窗口的多波段頻率特征為

（3）批量細胞運動軌跡分析與感興趣區(qū)域的確定

根據(jù)追蹤結(jié)果建立細胞運動軌跡并獲取細胞運動動力學模型的參數(shù).設細胞位置為{（x1，y1），（x2，y2），…，（xn，yn）}，則第i個細胞的運動方向和曲率分別為

根據(jù)多波段頻率特征的獲取方法來統(tǒng)計頻率特征的能量分布，以確定感興趣區(qū)域.

1.2 胚胎細胞遷移中感興趣區(qū)域細節(jié)信息的自動化獲取

本系統(tǒng)根據(jù)顯微鏡齊焦合軸的特點在明視場下實現(xiàn)了低倍率物鏡[14-16]下顯微圖像感興趣區(qū)域細節(jié)信息的自動獲取.顯微圖像感興趣區(qū)域細節(jié)信息的自動獲取策略如下：

首先根據(jù)顯微圖像的恒定窗口（1 024×768像素），得出中心點的像素空間坐標（512×384）.在低倍鏡下選擇感興趣區(qū)域，利用所選區(qū)域的左下角點的坐標A（x1，y1），求得其與中心點坐標之差（512-x1，384-y1）.在4倍物鏡下測量得每個像素大約為2.996μm，因此中心點到所選區(qū)域左下角點的x、y方向的距離為XA=2.996（512-x1），YA=2.996（384-y1）.

根據(jù)距離不變原則，當換用高倍物鏡時，微操作平臺可以根據(jù)所選區(qū)域左下角到中心點的x、y方向的距離進行相應的移動，從而將4倍物鏡下的左下角點移到高倍物鏡下的中心點上.然后再根據(jù)所選區(qū)域右下角點的坐標C（x2，y2）計算C點和A點之間x、y方向的距離： XAC=2.996（x2-x1），YAC=2.996（y2-y1），C點和A點在x、y方向的距離即為所選區(qū)域的寬和高，根據(jù)寬和高可計算出在高倍物鏡下，x、y方向的掃描范圍為Sx=XAC/s，Sy=YAC/s，從而實現(xiàn)高倍物鏡下感興趣區(qū)域的自動定位，其中s為電動載物平臺每次移動的距離.

2 自動化實驗研究

實驗采用MR-6微操作機器人系統(tǒng)平臺，該系統(tǒng)機械手臂的運動范圍為2 cm×2 cm×2 cm，電動平臺的運動范圍為10 cm×10 cm，在保證平穩(wěn)運動的前提下，運動速度的范圍為0.75～1500μm/s，運動精度可達1μm，同時，該系統(tǒng)還具有自動物鏡轉(zhuǎn)換與自動調(diào)焦功能.

雞因其獨特的生物學特性成為許多問題研究的重要模式生物，雞的胚胎發(fā)育可以為人類和其他模式生物研究提供許多啟示.自動化實驗中以雞胚胎的原腸胚形成作為研究模型，將追蹤胚胎細胞遷移的自動化追蹤方法應用于雞胚胎細胞的遷移追蹤實驗中.考慮到細胞移動特性[2]，利用微操作機器人系統(tǒng)每隔20 ms采集一幀雞胚胎細胞圖像并進行追蹤分析，獲取雞胚胎細胞遷移的動力學模型參數(shù).

在4倍物鏡下經(jīng)調(diào)焦得到點光源的衍射圖像，即點擴散函數(shù)，如圖2所示.

圖2 點擴散函數(shù)Fig.2 Point spread function

在暗視場下采集到的細胞圖像具有背景黑色、輪廓信息突出的特點，與明場顯微圖像相比，暗視場顯微圖像削弱了背景的干擾信息，使目標信息更加清晰，有利于觀察細胞的運動過程.暗視場下的雞胚胎顯微圖像示例見圖3.

圖3 暗視場下的雞胚胎顯微圖像Fig.3 Microscopic image of chicken embryos under dark field

利用上述算法追蹤圖像序列中從第2幀（Timelapse GFPeggs R005_3-0002.tif，標號 02）到第21幀（Time-lapse GFPeggs R005_3-0021.tif，標號21）的41個細胞，其中部分顯微圖像見圖4.

圖4 追蹤的顯微圖像序列示例Fig.4 Examples of tracking microscopic image sequence

多細胞追蹤實驗結(jié)果見圖5.圖5中，粉色標識塊代表每個被追蹤細胞的開始位置，藍色路徑形成了每個被追蹤細胞的運動軌跡.

圖5 雞胚胎細胞圖像序列中的多細胞追蹤Fig.5 Multicell tracking in chicken embryonic cell image sequence

以圖5中某個被追蹤細胞為例，表1給出了圖像序列中該細胞的位置信息，圖6為該細胞的運動軌跡.

表1 被追蹤圖像序列中特定細胞的位置信息Tab.1 Location information of a specific cell in a tracking image sequence

圖6 被追蹤細胞的運動軌跡Fig.6 Trajectories of the tracked cell

由圖5和圖6可見，本算法能夠在圖像采集間隔20 ms內(nèi)完成追蹤分析任務，在雞胚胎細胞顯微圖像序列中自動追蹤細胞運動軌跡，獲取運動細胞整體運動趨勢，驗證了算法的有效性.

3 結(jié)語

將微操作機器人系統(tǒng)引入胚胎細胞的遷移追蹤與分析研究，在MR-6型微操作機器人系統(tǒng)平臺上，根據(jù)顯微鏡成像原理，基于顯微系統(tǒng)的光學特性，提出批量胚胎細胞的自動追蹤算法，解決了整體運動趨勢追蹤與微細結(jié)構(gòu)觀測的矛盾，并通過自動化實驗進行驗證，實現(xiàn)了胚胎細胞遷移追蹤的自動化.本文算法對于虛擬細胞建模具有重要意義，可用于以微生物為載體的運輸機制、微細胞的分割技術(shù)和高速運動追蹤等研究，在生物醫(yī)學以及微機電系統(tǒng)等領域具有廣闊的應用前景.