測定鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量前處理條件的優(yōu)化

◎ 朱飛如，馮俊富

（北海市食品藥品檢驗所，廣西 北海 536000）

孔雀石綠（Malachite green，MG）是人工合成的有機化合物，在魚體內(nèi)可代謝為隱色孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）。MG是有毒的三苯甲烷類化合物，既是染料也是藥物，長期超量使用有潛在致畸、致癌和致突變等副作用。若在生物體內(nèi)長期蓄積,食用者身體健康將會受到危害[1]。

目前，文獻報道的MG、LMG相關(guān)的檢測主要方法有液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜方法，國內(nèi)檢測此類藥物的標(biāo)準(zhǔn)有GB/T 19857-2005、SN/T 1479-2004、SC/T 3021-2003。目前檢測的方法雖多，但前處理過程中試劑消耗大，步驟麻煩，成本較高。近年不斷發(fā)展起來比較成熟的一種高效的檢測技術(shù)是高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS），可以同時發(fā)揮液相色譜的分析速度快、分離度高與串聯(lián)質(zhì)譜的高靈敏度、高選擇性的極大優(yōu)勢，并且是采用多反應(yīng)檢測掃描方式，較好的對目標(biāo)化合物進行定量和定性分析。本實驗在借鑒標(biāo)準(zhǔn)、文獻的基礎(chǔ)上，旨在建立測定的簡便方法。同時按照GB/T 19857-2005方法處理樣品，與之做相應(yīng)比較。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 6460液質(zhì)聯(lián)用儀（美國安捷倫科技有限公司）；Agilent 1290高效液相色譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；3-18KS高速臺式冷凍離心機（SIGMA實驗室離心機有限公司）；N-EVAP112氮吹儀（美國organomation公司）；CPX5800H-C超聲波清洗機（美國必能信超聲（上海）有限公司）；QL-901渦旋混合器；GM200刀式研磨儀（法國萊馳）。

1.2 試劑

標(biāo)準(zhǔn)溶液：孔雀石綠草酸鹽溶液（A Chemtek，101.5 μg·mL-1）；隱色孔雀石綠溶液標(biāo)準(zhǔn)樣品（農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所，100 μg·mL-1）；孔雀石綠-D5苦味酸鹽溶液（A Chemtek，99.0 μg·mL-1）；隱色孔雀石綠 -D6溶液（A Chemtek，107.2 μg·mL-1）。

乙腈、甲酸均為色譜純，其他試劑為分析純；水為超純水；中性氧化鋁（100～200目）。

2 方法

2.1 色譜及質(zhì)譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18RRHD色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈∶5 mmol/L乙酸銨（75∶25），使用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5；流速為0.2 mL·min-1；柱溫 35 ℃；進樣量 10 μL。

電噴霧離子源（正離子模式）；多反應(yīng)監(jiān)測模式；電噴霧電壓4 000 V；離子源流速8 L·min-1；霧化氣壓力206.85 kPa；離子源溫度300 ℃，其他參數(shù)見表1。

表1 2種待測物質(zhì)和2種內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件表

2.2 溶液的制備

2.2.1 內(nèi)標(biāo)儲備液的制備

精密量取D5-MG和D6-LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，置于25 mL容量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)儲備液。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)工作溶液的制備

精密取內(nèi)標(biāo)儲備液1 mL，置于20 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備

精密量取MG和LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 mL，置于25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

精密量標(biāo)準(zhǔn)儲備液0.1 mL，置20 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.2.5 5 mmol·L-1乙酸銨溶液

準(zhǔn)確稱取0.385 g乙酸銨，用超純水溶解并定容至1 L，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH至4.5。復(fù)溶溶液：5 mmol·L-1乙酸銨溶液和乙腈按照1∶1(V∶V)混合4 ℃冷藏備用。

2.2.6 供試品的制備

稱取已勻漿的樣品2 g（精確到0.01 g），置于50 mL具塞離心管中，加入50 μL內(nèi)標(biāo)溶液，加入5 mL乙腈，渦旋2 min，超聲波振蕩提取10 min后，以10 000 r·min-1離心3 min，將上清液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中；向殘渣加入4 mL乙腈重復(fù)提取1次，用玻棒搗碎離心管的殘渣，旋渦混合器上振蕩30 s，超聲波振蕩提取5 min，以10 000 r·min-1離心5 min，上清液合并至15 mL離心管中，用乙腈定容至10 mL，搖勻，加入2 g中性氧化鋁，渦旋2 min，以10 000 r·min-1離心2 min，精密取上清液5 mL置于10 mL量瓶中，加5 mmol·L-1乙酸銨（pH=4.5）定容到刻度，搖勻，過0.22 μm有機濾膜，作為供試品溶液。

2.2.7 空白溶液的制備

除不加樣品外，其他與2.2.6步驟一致。

2.3 線性關(guān)系考察

精密取標(biāo)準(zhǔn)工作液0.025、0.05、0.1、0.25、0.5、1.0 mL和2.5 mL分別置于10 mL量瓶中，分別精密加入內(nèi)標(biāo)工作溶液25 μL，加復(fù)溶溶液稀釋至刻度，混勻，得到質(zhì)量濃度d1至d7依次為0.5、1、2、5、10、20、50 μg·kg-1的標(biāo)準(zhǔn)系列濃度。按2.1項下的條件進行測定，記錄色譜圖。以標(biāo)準(zhǔn)液的質(zhì)量線性濃度（μg/kg）作為橫坐標(biāo)（X），以MG和LMG的標(biāo)準(zhǔn)峰面積與內(nèi)標(biāo)D5-MG和D6-LMG的峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y）。MG的線性回歸方程為Y=0.068 393X+0.007 885，相關(guān)系數(shù)為0.999 96；LMG的線性回歸方程為Y=0.203 102X-0.004 221，相關(guān)系數(shù)為0.999 97。結(jié)果表明，MG和LMG的標(biāo)準(zhǔn)峰面積與內(nèi)標(biāo)D5-MG和D6-LMG的峰面積比值與檢測濃度呈良好的線性關(guān)系。

2.4 最低檢出限

稱取已勻漿的陰性樣品1份，置于50 mL具塞離心管中，加入標(biāo)準(zhǔn)工作液0.05 mL，按照“步驟2.2.6”同步操作，以基線噪音的3倍計算，得到MG和LMG的最低檢出濃度分別為 0.16 μg·kg-1和 0.10 μg·kg-1。

2.5 重復(fù)性實驗

精密取標(biāo)準(zhǔn)工作液0.25 mL，置于10 mL量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液25 μL，加復(fù)溶溶液稀釋至刻度，混勻，按本方法條件進樣6次，記錄色譜圖，其中MG的RSD為1.39%，LMG的RSD為1.54%。結(jié)果表明，本法的重復(fù)性良好。

2.6 加標(biāo)回收及精密度試驗

稱取已均質(zhì)好的陰性樣品，分別添加0.5、1.5、5 μg·kg-13個水平濃度MG、LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.2.6”進行制備，按“2.1”條件進行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品加標(biāo)回收率以及精密度表（n=3）

2.7 按照GB/T 19857-2005方法測定

稱取已均質(zhì)好的陰性樣品，分別添加0.5、1.5、5 μg·kg-1MG、LMG3個水平濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，按GB/T 19857-2005方法進行測定，結(jié)果見表3。

表3 樣品加標(biāo)回收率及精密度表（n=3）

2.8 樣品測定

取已勻漿的淡水魚（羅非魚、草魚、大頭魚、鯽魚）、海水魚（大眼魚、龍利魚、泥猛魚、花棍魚、鮮活泥魚）、蝦（南美對蝦、明蝦、彈蝦）、螺（紅螺、花螺、白螺、圣子螺、玉米螺）和螃蟹（花蟹、花麻蟹、青蟹）各6批次，樣品來源于抽檢樣品，按本方法處理測定，有2批有檢出MG和LMG，其余均未檢出MG和LMG。

3 討論

3.1 提取和凈化的選擇

MG在水產(chǎn)品中主要以隱色代謝物L(fēng)MG的形式存在，具有很強的親脂性，水產(chǎn)品基質(zhì)復(fù)雜，脂肪含量高，并不利于對目標(biāo)化合物的提取和檢測。目前各種氧化鋁小柱可以去除樣品中的脂肪。按照GB/T 19857-2005一直用乙腈活化后的中性氧化鋁固相萃取凈化，達到清除油脂，去雜質(zhì)的作用。經(jīng)過實驗比較，發(fā)現(xiàn)用適量中性氧化鋁進行除雜，可以達到消除油脂和基體的影響的良好效果。在同時達到消除雜質(zhì)和油脂的影響，保護色譜柱和質(zhì)譜儀的前提下，使用中性氧化鋁小柱成本高，步驟多，而使用中性氧化鋁成本較低，而且操作簡便，適于大批量處理樣品。

3.2 與GB/T 19857-2005方法比較

由實驗結(jié)果可知，本法MG、LMG的回收率在84.1%～98.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.1%～2.2%；國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005方法MG、LMG的回收率在84.7%～108.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.5%～1.7%。對比兩個方法的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相差不大。

當(dāng)陽性樣品分別按本方法和GB/T 19857-2005處理并測定，兩個測定結(jié)果相差并不大。陽性樣品按照本方法處理測定，MG、LMG的平均回收率分別為101.3%、98.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%、0.4%。按GB/T 19857-2005方法進行處理測定，MG、LMG的平均回收率分別為100.7%、98.5%，對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.6%、0.8%。比較兩者的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差相差不大，符合方法檢測的要求。

3.3 結(jié)論

本方法在參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005基礎(chǔ)上，采用了HPLC-MS/MS同時檢測鮮活水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物殘留量。同時參考最近MG和LMG檢測的文獻[2]可知，其中檢測的前處理過程，用到中性氧化鋁小柱，柱子成本高，或需要進行氮吹步驟，耗時長，或需用到二氯甲烷，毒性大。本實驗樣品MG和LMG直接用乙腈提取，加中性氧化鋁（100～200目）凈化，簡化前處理過柱步驟并節(jié)約實驗耗材，省去氮吹步驟，縮短時間。在3個添加水平下的回收率、精密度良好，檢出限低。用兩個方法對陽性樣品進行含量測定，測定結(jié)果相差不大，符合方法檢測的要求。同時發(fā)揮液相色譜與串聯(lián)質(zhì)譜的優(yōu)勢，較好的對目標(biāo)化合物進行定量和定性分析，達到高效、快速、操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的效果，滿足日常大批量樣品檢測的要求。