林嘉潤(rùn) 廖聯(lián)明

急性心肌梗死多發(fā)生在冠狀動(dòng)脈粥樣硬化后狹窄，由于某些誘因致使斑塊破裂脫落或血小板聚集形成血栓阻塞冠狀動(dòng)脈，或誘發(fā)冠狀動(dòng)脈痙攣，導(dǎo)致心肌急性缺血壞死，形成梗死。梗死區(qū)心肌收縮單位大量喪失，形成纖維性瘢痕，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭。

心肌梗死后心力衰竭目前尚無病因性有效治療方法，因此成為基礎(chǔ)與臨床醫(yī)學(xué)研究多年來持續(xù)關(guān)注的熱點(diǎn)。心肌球源性細(xì)胞（cardiosphere-derived cell，CDC）是心肌組織在體外培養(yǎng)后長(zhǎng)出的球狀細(xì)胞團(tuán)中分離而來的細(xì)胞[1]，具有干細(xì)胞的特征，在體外可以分化為心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，為梗死后心肌再生提供一條可能途徑。目前CDC治療心力衰竭已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。本文對(duì)CDC促進(jìn)心肌細(xì)胞再生的機(jī)制和臨床研究進(jìn)展作一綜述。

一、CDC的分離和特征

2007年Smith等[1]首次報(bào)道了CDC的分離方法。首先采用經(jīng)皮心肌組織活檢的方法獲得少量組織塊。將組織塊在優(yōu)化的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，直到有細(xì)胞爬出。這些細(xì)胞在體外增殖后可形成球狀細(xì)胞團(tuán)，因此命名為CDC。將細(xì)胞團(tuán)消化后獲得的細(xì)胞接種在包被f i bronectin的培養(yǎng)瓶上即可進(jìn)行大量擴(kuò)增。CDC具有干細(xì)胞的特征，如克隆性生長(zhǎng)、分化成心肌細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。CDC表達(dá)CD105（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β亞基），但不表達(dá)CD45（造血細(xì)胞標(biāo)記）。大約25%～ 60%的CDC表達(dá)CD90（間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記）。CDC不表達(dá)成纖維細(xì)胞的表面標(biāo)記蛋白，也不表達(dá)肌小節(jié)蛋白。

剛剛死亡的機(jī)體心肌組織中也可以獲取CDC。Sun等[2]報(bào)道，無論人和小鼠，死亡后24 h內(nèi)可以從心肌組織培養(yǎng)得到CDC。這些CDC移植到擴(kuò)張型心臟病的小鼠心臟后能改善射血分?jǐn)?shù)。心室肌細(xì)胞外基質(zhì)能促進(jìn)植入心肌梗死組織內(nèi)的CDC向心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮及血管平滑肌細(xì)胞分化，改善心肌梗死后的心臟結(jié)構(gòu)及功能[3]。CDC和骨髓干細(xì)胞以及脂肪干細(xì)胞的平行對(duì)照試驗(yàn)表明，CDC對(duì)改善心肌功能和減少細(xì)胞凋亡更有效[4]。c-kit+/f l k-1+/islet-1+CDC的數(shù)量以及CDC的總數(shù)量在新生兒和嬰兒中最高，然后在成年期下降。此外，新生兒心臟來源的CDC相比成年心臟來源的CDC擁有更好的促進(jìn)心肌功能康復(fù)和血管生成的功能，向心肌細(xì)胞分化的能力也更強(qiáng)[5]。

二、細(xì)胞給予途徑

經(jīng)何途徑給予CDC最為安全和有效，臨床一直存在不同意見。選擇最佳給予途徑的時(shí)候需要綜合考慮不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)、移植細(xì)胞在心臟的停留時(shí)間以及療效。冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射CDC可以和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療同時(shí)進(jìn)行。冠狀動(dòng)脈和外周血管注入心球細(xì)胞都可以減小瘢痕、促進(jìn)血管新生和改善心功能[6-7]。通過使用含有無鈣磷酸鹽緩沖鹽、肝素和硝酸甘油改良的CDC注射液可以降低微栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

有兩種不同的技術(shù)用于冠狀動(dòng)脈注射CDC，分別為停頓注射（stop fl ow）和連續(xù)注射。注射途徑也分為單血管途徑和多血管途徑。與常規(guī)的停頓注射和心肌內(nèi)注射相比，持續(xù)小劑量冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注可以減少CDC結(jié)團(tuán)，降低微栓塞的風(fēng)險(xiǎn)[9]。

CADUCEUS臨床試驗(yàn)和早期的豬模型中，使用停頓注射方法可以使CDC更多地停留在梗死組織周邊，減少瘢痕形成，但心臟射血分?jǐn)?shù)沒有明顯改善。然而，采用3個(gè)主要冠狀動(dòng)脈連續(xù)輸注后心肌收縮力顯著改善，心肌細(xì)胞增殖增加。此外，和單個(gè)冠狀動(dòng)脈輸注相比，3個(gè)冠狀動(dòng)脈同時(shí)輸注產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)較輕微，纖維化減小程度、血管密度增加程度以及心臟功能和結(jié)構(gòu)改善程度都更加理想[10]。DYNAMIC臨床試驗(yàn)的同種異體心臟細(xì)胞治療擴(kuò)張型心肌病的臨床研究也采用3個(gè)主要冠狀動(dòng)脈連續(xù)輸注的方法[11]。比起冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射，將CDC直接注射到梗死區(qū)周圍，左心射血分?jǐn)?shù)有顯著的提高[12]，但要注意的是注射細(xì)胞存活率與注射細(xì)胞劑量成反比。心肌內(nèi)注射需要開胸，手術(shù)成本高，風(fēng)險(xiǎn)大是其局限性，而通過冠狀動(dòng)脈內(nèi)導(dǎo)管注射或經(jīng)心內(nèi)膜注射則可避免這兩個(gè)缺點(diǎn)。此外心肌內(nèi)注射的作用部位主要在注射周圍的組織，而缺血性心肌病可能累及廣泛的心肌組織損傷。心包注射也可以將CDC廣泛分布到心臟，但需要患者體征足夠穩(wěn)定后才能實(shí)施[13]。為了增強(qiáng)CDC治療的靶向性，可將CDC進(jìn)行磁珠標(biāo)記后輸注[14]。

在急診手術(shù)下，冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注可以在搭橋手術(shù)過程中進(jìn)行。然而冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注的CDC很快會(huì)隨血流流走，而且可能造成微血管閉塞。心肌注射的CDC則具有較高的組織內(nèi)停留率，但因?yàn)槿狈τ行У难汗?yīng)生存率較低。

三、提高相比在組織內(nèi)的停留率

CDC給以后在心臟的低停留率是影響療效的重要因素。大多數(shù)細(xì)胞在24 h內(nèi)離開心臟。由透明質(zhì)酸和豬明膠組成的可聚合水凝膠制成的CDC細(xì)胞薄片是一種可能的解決方案，可使移植細(xì)胞的保留率增加10倍[15]。和直接的心肌內(nèi)注射相比，當(dāng)CDC通過細(xì)胞片的方式進(jìn)行治療時(shí)LVEF的改善也顯著增加。

把CDC在低氧環(huán)境下預(yù)處理后再移植也可增強(qiáng)療效。低氧誘導(dǎo)的CDC細(xì)胞片與在正常條件下的CDC的細(xì)胞片相比可以顯著改善左心室功能，增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生，并減少纖維化。低氧環(huán)境可能通過激活PI3/Akt信號(hào)通路來增強(qiáng)CDC的抗纖維化和促血管生成潛能，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)[16]。

另一種增強(qiáng)細(xì)胞植入和功能的方法是用堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子進(jìn)行預(yù)處理。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子可提高CDC的移植率和促進(jìn)CDC向心肌細(xì)胞分化，進(jìn)一步改善心室功能，減少瘢痕大小，增強(qiáng)局部室壁運(yùn)動(dòng)[17]。同樣，表皮生長(zhǎng)因子預(yù)處理也能增強(qiáng)CDC的傷口愈合功能和心肌細(xì)胞的增值[18]。

四、異體CDC

同種異體CDC可以從不適合移植的供體心臟中獲得，并大批量生產(chǎn)儲(chǔ)存，以備臨床隨時(shí)中使用，某些情況可以避免心肌活檢的風(fēng)險(xiǎn)[19]。同種異體CDC表達(dá)MHCI分子，但不表達(dá)MHCⅡ分子和共刺激分子；當(dāng)和淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，淋巴細(xì)胞沒有增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明移植CDC時(shí)不需要免疫抑制。由于同種異體CDC通過旁分泌機(jī)制間接發(fā)揮其對(duì)心臟再生的作用，而那些很輕微的排斥反應(yīng)也是在這些修復(fù)機(jī)制啟動(dòng)后才發(fā)生的，因此CDC有足夠的時(shí)間發(fā)揮作用。多個(gè)臨床前研究表明，同種異體CDC移植到梗死動(dòng)物后心肌瘢痕減少、心功能增加、血管生成增加[20-21]。Kanazawa等[22]表明CDC在大動(dòng)物急性心肌梗死再灌注30 min后移植也有效。與安慰劑相比，CDC治療后肌鈣蛋白Ⅰ水平降低，心肌細(xì)胞凋亡減少，梗死面積減小。不過沒有研究對(duì)異體和自體CDC的療效差異進(jìn)行比較。

為了保證大批量生產(chǎn)出來異體CDC的質(zhì)量，有必要確定用于檢測(cè)同種異體干細(xì)胞效價(jià)的可靠指標(biāo)。目前建議的指標(biāo)包括基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1（在再生和募集內(nèi)源心肌祖細(xì)胞方面起主要作用），CD90（和CDC效價(jià)成反比關(guān)系），外泌體（在心肌保護(hù)、血管生成和再生起到作用），或PD-L1（涉及CDC發(fā)揮免疫抑制作用）。其次，必須證明體外批量生產(chǎn)過程和存儲(chǔ)是否會(huì)改變它們的再生潛能、免疫抑制作用或分泌旁分泌因子的能力。現(xiàn)已有兩項(xiàng)Ⅱ期臨床研究在評(píng)估異體CDC的療效，分別是ALLSTAR研究 和 DYNAMIC研究，前者針對(duì)急性心肌梗死，后者針對(duì)擴(kuò)張型心肌病。

五、臨床試驗(yàn)

1.自體CDC逆轉(zhuǎn)心室功能障礙：CADUCEUS臨床試驗(yàn)已經(jīng)顯示出了自體CDC治療心力衰竭的美好前景。這項(xiàng)研究募集了31例心肌梗死2到4周后左室功能不全的患者。該Ⅰ期臨床試驗(yàn)的目的是觀察冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注自體CDC的安全性和有效性。首先對(duì)治療組患者進(jìn)行心內(nèi)膜心肌活檢。85%的患者活檢組織培養(yǎng)后能夠獲得目標(biāo)數(shù)量的CDC（平均培養(yǎng)36 d）。CDC的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是CD105+細(xì)胞超過95%，CD45+細(xì)胞少于5%。CDC通過導(dǎo)管輸注到梗死組織相關(guān)的冠狀動(dòng)脈。注射CDC后瘢痕組織減少，心臟收縮力增加，局部心肌壁增厚。治療后1年心臟磁共振成像發(fā)現(xiàn)心臟組織有生理意義的再生[10]。

盡管自體CDC治療有許多益處，但仍存在諸多局限性：（1）自體移植需要心內(nèi)膜心肌活檢。這種侵入性活檢的風(fēng)險(xiǎn)雖然較小，但無法避免。CDC的分離培養(yǎng)可能失敗。在CADUCEUS試驗(yàn)中有3個(gè)患者（15%）CDC受到細(xì)菌污染、有細(xì)胞遺傳學(xué)異常和細(xì)胞總量不足。在TICAP試驗(yàn)中，10%的患者組織沒有培養(yǎng)出CDC。（2）在CADUCEUS試驗(yàn)中，研究人員需要4 ～ 6周才能從心內(nèi)膜心肌活檢組織培養(yǎng)出足夠的CDC，因此這個(gè)方法不能用于急性心肌梗死的患者的治療。

2.自體CDC治療左心發(fā)育不全綜合征：TICAPI期臨床研究選擇左冠狀動(dòng)脈3支主要分支為注射途徑，為左心發(fā)育不全綜合征患兒輸注自體CDC，結(jié)果心臟MRI檢查顯示右心室EF、心臟組織再生和心力衰竭均有顯著臨床改善[23]。

3.同種異體CDC治療心肌梗死：ALLSTAR試驗(yàn)是1 項(xiàng)多中心、雙盲、安慰劑對(duì)照的Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)，目的是評(píng)估冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射同種異體CDC對(duì)一年內(nèi)發(fā)生前壁心肌梗死患者的療效。在Ⅰ期試驗(yàn)中納入了14例患者，是一個(gè)劑量遞增安全試驗(yàn)。這一階段的結(jié)果非常令人鼓舞，沒有發(fā)生免疫反應(yīng)。治療組1年后心臟MRI顯示梗死面積相對(duì)減少了15%。但在2017年11月15日美國(guó)心臟病學(xué)會(huì)（AHA 2017）上發(fā)布的6個(gè)月結(jié)果顯示，在減少心肌梗死疤痕組織上，治療組與安慰劑組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.同種異體CDC治療擴(kuò)張型心肌?。篋YNAMIC試驗(yàn)觀察冠狀動(dòng)脈內(nèi)輸注異體CDC對(duì)擴(kuò)張型心肌?。ㄈ毖院头侨毖裕┑陌踩浴?4例心臟衰竭患者通過3個(gè)主要冠狀動(dòng)脈接受CDC注射。1年后的隨訪顯示LVEF明顯改善[11]。

六、作用機(jī)制

目前認(rèn)為CDC通過激活心肌細(xì)胞增殖和保護(hù)心肌細(xì)胞兩條途徑誘導(dǎo)心臟組織再生。然而，其中哪一個(gè)更重要仍是一個(gè)有爭(zhēng)論的研究課題。

心肌梗死后心肌細(xì)胞增殖的速率會(huì)增加，新細(xì)胞形成率在CDC移植后進(jìn)一步加快，可達(dá)正常的3倍[24]。CDC移植后雖然可以觀察到祖細(xì)胞直接分化為心肌細(xì)胞，但與心肌細(xì)胞直接復(fù)制的效果相比，新分化的心肌細(xì)胞占比很小，不是心肌再生的主要機(jī)制。新生成的心肌細(xì)胞比較小，主要位于梗死區(qū)周圍（約90%），有縫隙連接，分布均勻。除了刺激心肌細(xì)胞復(fù)制和內(nèi)源祖細(xì)胞分化外，CDC也有保護(hù)心臟的作用，包括減少細(xì)胞凋亡和抗炎作用。

CDC釋放的旁分泌因子可促進(jìn)心肌細(xì)胞分裂。CDC分泌的因子包括肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和胰島素樣生長(zhǎng)因子-1。此外CDC并沒有分化為內(nèi)皮細(xì)胞，但通過促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的生成，可導(dǎo)致血管生成增加，血管密度增加。

輸注CDC來源的外泌體可發(fā)揮CDC的心臟保護(hù)作用，包括抑制細(xì)胞凋亡[25]。CDC來源的外泌體富含microRNA。其中miR-146a有心臟保護(hù)和再生作用，而miR-210具有抗凋亡作用。miR-132則促進(jìn)凋亡。

七、展望

CDC條件培養(yǎng)液也有抗凋亡、促血管生成和保護(hù)心臟的作用。這些可溶性介質(zhì)稱為干細(xì)胞釋放分子，擁有干細(xì)胞約80%的治療潛力。涉及保護(hù)心臟的干細(xì)胞釋放分子包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、血小板衍生生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、白介素-1B、白介素-10和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，其中基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1的量和CDC在體內(nèi)的效力相關(guān)性最大。SRM可以促進(jìn)血管生成，通過激活bcl-2/bax通路抑制心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)循環(huán)祖細(xì)胞募集到受損心?。▍⑴c的因子包括基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1，胰島素樣生長(zhǎng)因子-1，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子和色素上皮衍生因子）；改善心臟傳導(dǎo)和減少瘢痕形成（參與的因子包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑、金屬蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和絲氨酸蛋白酶抑制劑）[26-27]。

同CDC移植相比，無細(xì)胞療法有許多優(yōu)點(diǎn)。自體CDC在短時(shí)間內(nèi)快速分離和獲取是不可能的，而SRM不但在實(shí)驗(yàn)室條件下可以大量生產(chǎn)。此外，冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射異體和自體 CDC植入率低，直接心肌內(nèi)注射的并發(fā)癥風(fēng)險(xiǎn)較大，而無細(xì)胞療法SRM能避免許多與CDC移植過程相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)。理論上SRM可在急性心肌梗死后立即使用，從而避免了自體干細(xì)胞治療的局限性。能否將SRM靶向傳送到心肌可能是未來重點(diǎn)研究的方向之一。