張輝，白晨，張惠忠，李曉東，付增娟，趙尚敏，鄂圓圓，張自強，王良，張必周

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，呼和浩特 010031）

0 引言

甜菜作為重要的糖料作物，分布在全世界除大洋洲和南極洲外的其他大陸約43個國家和地區(qū)。世界上甜菜種植面積大約能占到糖料作物的40%。叢根病是影響甜菜生產(chǎn)的重要病害，能導致甜菜的產(chǎn)量和含糖率嚴重下降。因此在選育品種過程中，品種的叢根病抗性是很重要的指標。上世紀自發(fā)生甜菜叢根病以來，國內(nèi)科技人員對甜菜叢根病進行了積極的研究，近幾年雖引進HYB-74等一些叢根病抗性新品種[1]，選育了農(nóng)大甜研6號[2]、ZT-6[3]和XJT9907[4]抗耐叢根病甜菜品種，但總體對甜菜叢根病的基礎(chǔ)性研究相對不足，遠沒有國外活躍[5-6]。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，利用分子手段輔助常規(guī)育種已經(jīng)成為育種研究工作的一項新手段。因此本文概述了近年來利用分子方法對叢根病致病機理及相關(guān)抗性研究的較新進展，以期為我國甜菜叢根病的深入研究、快速發(fā)展提供參考和借鑒。

1 甜菜叢根病類型及發(fā)病機理研究

1.1 甜菜叢根病類型研究進展

甜菜叢根病是一種由甜菜壞死黃脈病毒（BNYVV）引起的嚴重甜菜病害。這種病害是由甜菜多粘菌通過土壤傳播的，現(xiàn)在許多甜菜種植的國家都有發(fā)現(xiàn)，是甜菜產(chǎn)業(yè)在全球范圍面臨的嚴重危害。Chiba等在全球范圍的BNYVV分離菌株中發(fā)現(xiàn)了不同類型的基因序列變異，這些基因變異分別發(fā)生在RNA3-p25、RNA4-p31、RNA2-CP和RNA5-p26，其中RNA3-p25基因編碼的致病因子是病毒產(chǎn)生致病性的關(guān)鍵因素。在意大利發(fā)現(xiàn)的BNYVV分離菌株中p25具有最強的陽性選擇，能夠不同程度地克服宿主的Rz1抗性基因，而其他地域的分離菌株則不能克服抗性基因的影響，不發(fā)病。p25蛋白第67位和第68位的氨基酸的變異會導致致病性發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn)，BNYVV病毒最初是在東亞地區(qū)發(fā)生進化，近年來已成為栽培甜菜品種的病原體，進而形成了新的抗性突變體[7]。多粘菌是許多作物病毒傳播的介質(zhì)。Laufer等研究了BNYVV和甜菜土傳花葉病毒（BSBMV）熒光標記技術(shù)在煙草共侵染和重疊侵染試驗中的應用。共侵染實驗表明，在接種后，同一種和不同種Benyvirus的不同標記種群在空間上是分離的。采用差異標記技術(shù)對煙草脆裂病毒（TRV）進行聯(lián)合感染，獲得了相同的觀察結(jié)果。在BNYVV和BSBMV的復合侵染試驗中，二者不能在其先前感染BNYVV或BSBMV的植株中建立二次侵染[8]。Galein等采用大量田間取樣和室內(nèi)試驗相結(jié)合的方法。以不同類型抗性甜菜品種為材料，對BNYVV多樣性的進化進行了評價。從1 000多個野生樣品中，證實了不同A、B和P型BNYVV的同時存在，在p25四分體的67～70位鑒定了21個變異體。第一種變體AYHR最常見，其次是SYHG。大量混合感染（占樣本的9.93%），大多為B型和P型，也已得到證實。與A型或B型相關(guān)的四分體也與已知的RNA5基因組相關(guān)聯(lián)，從而使BNYVV對甜菜根具有更強的侵略性。具有Rz1和Rz2抗性基因的品種，即使BNYVV效價較高，也沒有表現(xiàn)出明顯的根部癥狀。盡管BNYVV的RNA 3序列具有較廣的多樣性，但這些品種在生長季末土壤中的病毒侵染潛力也較低。Rz1和Rz2品種的甜菜土傳病毒（BSBV）也較低。在田間感染線蟲的品種中，Rz1和抗病基因的BNYVV滴度均低于Rz1或同時具有Rz1和Rz2的品種。而且法國甜菜的BNYVV的群體類型往往不同于世界其他地區(qū)[9]。關(guān)于BNYVV在中國的遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)的信息卻相對較少。Zhuo等對中國4個基因組區(qū)（CP、RNA3、RNA4和RNA5）的BNYVV分離株進行了測序，通過序列比較分析發(fā)現(xiàn)不同基因型和p25的四分體結(jié)構(gòu)異變體一起混合組成的這幾種病毒分離株。在中國BNYVV病毒群體總共發(fā)現(xiàn)了12種不同類型的p25四分體，其中有4種是之前未見報道的?；?個基因（CP、RNA3-p25、RNA4-p31和RNA5-p26）的系統(tǒng)發(fā)育分析揭示中國地區(qū)存在2～4個類群。從p25和p26株中國分離株中分別鑒定出兩個新亞組和一個新類群。篩選壓力分析表明，中國分離株的p25存在正選擇壓力，而其他3種蛋白則處于負選擇壓力下。不同省份的BNYVV種群間存在著頻繁的基因流動，這意味著不同省份的BNYVV種群沒有地理上的差異[10]。

1.2 叢根病檢測方法研究進展

目前BNYVV的檢測方法有很多，其中比較常用的有表型鑒定法、解剖學鑒定法、酶聯(lián)免疫吸附法以及RT-PCR法。酶聯(lián)免疫吸附法和RT-PCR法在實際試驗中應用較多，目前以酶聯(lián)免疫吸附法為基礎(chǔ)又衍生出效果更佳的雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法（DAS-ELISA）。Mehrvar和Decro?s等分別利用RT-PCR方法對不同地區(qū)和不同類型的叢根病病毒進行檢測，對不同類型叢根病病毒進行了分類研究[11-12]。國內(nèi)劉大麗等利用RT-PCR技術(shù)檢測BNYVV病毒，在待檢測的甜菜塊根中檢測到了324 bp的叢根病病毒片段[13]。Uhde-Holzem等開發(fā)了特異性單克隆抗體方法檢測BNYVV病毒，對以病毒樣品顆粒（VLPs）作為合成抗原的表達系統(tǒng)進行了相關(guān)評價[14]。Yardimci等開發(fā)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附方法（DAS-ELISA），在土耳其的主要甜菜種植區(qū)檢測BNYVV病毒，并比較了RT-PCR法和DAS-ELISA法的檢測效果，發(fā)現(xiàn)RT-PCR法比較適用于BNYVV的檢測[15]。Almasi等開發(fā)一種新型BNYVV檢測方法，通過逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導等溫擴增（RT-LAMP）方法鑒定BNYVV病毒[16]。Nouayti等比較了幾種不同甜菜根部BNYVV根病病毒RNA檢測方法，發(fā)現(xiàn)采用氯化鋰技術(shù)、工業(yè)試劑盒、直接和膜點滴粗提法提取的RNA與其它方法相比，具有較高的純度和較高的RNA濃度。此6種方法，氯化鋰技術(shù)和瓊脂試劑盒是檢測BNYVV前從甜菜樣品中提取病毒RNA最合適的方法[17]。目前隨著各種新技術(shù)的發(fā)展，眾多新型的方法被用于BNYVV病毒的檢測中。

1.3 叢根病的發(fā)病機理研究進展

甜菜壞死黃脈病毒基因組由1～5正鏈RNA組成，病毒RNA1和RNA2編碼的基因及復制，與蛋白組裝和細胞移動有關(guān)。RNAl包含6 746個核苷酸，有1個開放閱讀框，編碼p237蛋白自身催化切割成兩個蛋白（p66和p150），其中p66包括全部的聚合酶，而p150蛋白包含甲基轉(zhuǎn)移酶、解旋酶和類木瓜蛋白酶。RNA2含有 4 612 個核苷酸，它編碼 6 個蛋白：運動蛋白（MP）p13、p15 及 p42，外殼蛋白（CP）p21，通讀蛋白（RT）p75和1個具有調(diào)控功能的蛋白p14[18]。Chiba等對BNYVV和BSBMV中富含半胱氨酸的p14蛋白的RNA沉默抑制特性開展了相關(guān)研究工作。發(fā)現(xiàn)病毒的p14蛋白與其他病毒致病因子是彼此獨立的，一般聚集在核仁和細胞質(zhì)中。而BNYVV VSR表達則與長距離運動之間存在一定的相關(guān)性[19]。p13、p15和p42這3種運動蛋白相互作用促進RNA細胞間運動，其中p42能夠和RNA或者DNA捆綁到一起，將病毒包住，而p13和P15可以為p42病毒復合體于胞間連絲處提供一個停泊位點，通過改變胞間連絲的大小，從而使病毒RNA在細胞間進行傳遞[20-21]。

RNA3包括1 775個核苷酸，從N端起編碼3個不同的蛋白：P25蛋白、N蛋白（59個氨基酸）和1個4.6 kDa蛋白，RNA3的存在可以使病毒通過載體傳遞的效率更高[22]。Flobinus等發(fā)現(xiàn)BNYVV在甜菜中的系統(tǒng)運動依賴于病毒RNA3，RNA3含有20個核苷酸組成的核心蛋白基序，這些對于穩(wěn)定非編碼RNA3（ncRNA3）和在物種間的長距離運動起著重要作用[23]。Peltier等研究發(fā)現(xiàn)BNYVV RNA3在非寄主轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中表達時，并不積累35 S啟動子。而在轉(zhuǎn)基因煙草中進行的瞬時表達中發(fā)現(xiàn)了一種3′-衍生物。這3′-衍生物的物種類似于以前報道的在病毒感染期間產(chǎn)生的亞基因組RNA3[24]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)BNYVV RNA3的內(nèi)源缺失突變體是在系統(tǒng)感染過程中自發(fā)產(chǎn)生的，內(nèi)源缺失并不影響RNA3的有效復制，但可提高RNA3在系統(tǒng)宿主中的穩(wěn)定性和致病性[25]。Flobinus等發(fā)現(xiàn)BNYVV非編碼RNA的產(chǎn)生依賴于5′→3′Xrn外顯子酶的活性。野生型或突變型RNA3在釀酒酵母中的表達有利于ncRNA3種的積累。對釀酒酵母核糖核酸酶突變體的篩選表明，5′→3′外顯子酶Xrn1是RNA3加工過程中的關(guān)鍵酶，在體外和昆蟲細胞提取物中都進行了重組。Xrn1以類似黃病毒Xrn1抗性結(jié)構(gòu)（sfRNA）的方式在含有ncRNA3的RNA底物上停滯。用sfRNA序列替代BNYVV RNA3核心序列，可使酵母中ncRNA在體外積累，而不是在植物中積累，且無病毒長距離發(fā)生。有趣的是，Xrn4基因的敲除減少了BNYVV RNA的積累，表明核糖核酸酶在病毒循環(huán)中具有雙重作用[26]。Kozlowska-Makulska等利用轉(zhuǎn)錄后基因沉默（PTGS）技術(shù)驗證RNA3的功能[27]。Bornemann等發(fā)現(xiàn)p25蛋白特異性突變的Rb株會影響到抗病性。野生型（WT）和Rb特性的種群通過p25深度測序進行分析，發(fā)現(xiàn)分析種群的p25變異水平與Rb性質(zhì)無關(guān)[28]。Thiel H等對BNYVV致病因子p25與含有未知功能F盒家族蛋白（FBK）的甜菜蛋白相互作用展開了研究，證實了甜菜FBK-p25在體內(nèi)和體外的相互作用，通過酵母雙雜交橋聯(lián)試驗，證實了p25對ASK1蛋白SCF復合物的直接作用，研究結(jié)果支持了p25參與甜菜病毒致病性的觀點[29]。Peltier等將p25蛋白轉(zhuǎn)染到模式生物擬南芥中，通過Southern雜交對轉(zhuǎn)基因植株進行了鑒定，篩選出攜帶轉(zhuǎn)基因單拷貝和多拷貝的獨立株系。發(fā)現(xiàn)其對BNYVV感染不敏感，但在表達p25蛋白的植株上出現(xiàn)了不正常的分歧現(xiàn)象[30]。Thiel和Acosta-Leal等也對RNA3的p25蛋白開展了一系列研究，發(fā)現(xiàn)p25可以進入到宿主細胞的細胞核和細胞質(zhì)，進而可以引起宿主葉片發(fā)生嚴重的壞死反應[31-32]。

RNA4含有兩個開放閱讀框，其中一個開放閱讀框編碼多粘菌傳遞病毒不可缺少的p31蛋白[33]。Fan等利用聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）分析，將RNA4編碼p31蛋白融合到紅色熒光蛋白（RFP），發(fā)現(xiàn)RNA4引起的重度癥狀可能與p31轉(zhuǎn)錄修飾有關(guān)。BNYVV的RNA4表達過程中的RNA沉默基因表達的修飾，泛素-蛋白酶體途徑、纖維素的合成，以及內(nèi)源赤霉素代謝可能有助于引發(fā)嚴重癥狀表現(xiàn)[34]。Wu等發(fā)現(xiàn)在BNYVV感染過程中，只有整個p31才能誘導PR-10上調(diào)，富含半胱氨酸的p31中的所有色氨酸和6個半胱氨酸（C174、C183、C186、C190、C197和C199）對PR-10的表達有顯著影響，這與BNYVV感染的巴氏桿菌嚴重癥狀的出現(xiàn)密切相關(guān)[35]。RNA5有一個開放閱讀框，編碼p26蛋白，不是所有RNA病毒都有的[18]。McGrann等研究了BNYVV的組成，RNA5僅限于亞洲和歐洲的某些地區(qū)，而且這些分離物往往更具有侵略性[36]。還有相關(guān)報道在日本、中國和法國的分離物中發(fā)現(xiàn)該類型。一般含有RNA5的病毒較僅含有RNA1～4的病毒，被認為能引起更嚴重的病害[18，37]。

2 甜菜叢根病分子輔助育種研究

2.1 甜菜基因工程研究進展

近年來基因工程在各種作物上都有大量應用，在甜菜上也有迅速的發(fā)展。Jahromi等克隆了BNYVV的主要外殼蛋白 （CP21），并在大腸桿菌中表達，從PCR擴增的免疫球蛋白庫中構(gòu)建噬菌體抗體庫，對重組CP21抗原進行了4輪篩選，獲得了幾條特異性單鏈FV片段，并對其進行了鑒定[38]。Acosta-Leal等探討B(tài)NYVV群體的遺傳寄主效應，將野生型病毒的分離物接種到具有部分抗性的基因Rz1、Rz2以及感病的甜菜品種中，并且克隆了病毒RNA3部分序列，發(fā)現(xiàn)病毒的多樣性與宿主的抗性強度成正比[39]。PavliO I分別于2011和2012年利用轉(zhuǎn)基因的方法對甜菜進行了轉(zhuǎn)化，發(fā)現(xiàn)獲得的轉(zhuǎn)化植株對甜菜叢根病具有一定的抗性[40-41]。Delbianco等利用農(nóng)桿菌接種的方法將含有全長cDNA病毒基因組拷貝質(zhì)粒的懸浮農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入到宿主細胞，通過cDNA的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒基因組的拷貝RNA，從而引發(fā)感染[42]。Jiang等建立了花椰菜花葉病毒35 S啟動子控制下的BNYVV全長感染性cDNA克隆。進一步開發(fā)了一套基于BNYVV的載體，可在模式植物和甜菜植株中高效表達4種重組蛋白，其中包括一些長度可達880個氨基酸的大蛋白。這些載體可用于研究系統(tǒng)侵染植物葉片、根和莖組織中多種蛋白的亞細胞共定位。此外，以BNYVV為載體的NBPDS引導RNA在表達CaS 9的轉(zhuǎn)基因植株上進行基因組編輯，基于BNYVV的載體將促進甜菜和相關(guān)植物中多種蛋白質(zhì)的基因組研究和表達[43]。Laufer等開展了BSBMV和BNYVV cDNA克隆的生物學特性研究，通過等溫體外重組，構(gòu)建了適合兩種病毒基因組接種的載體。發(fā)現(xiàn)BNYVV和BSBMV的RNA1、RNA2重組子能進行長距離傳播[44]。

國內(nèi)將分子方法應用于甜菜育種中也較為普遍。劉大麗等利用基因克隆的方法對兩類真菌抗性基因At Chitinase1和At Glucanase2的功能域進行了克隆，獲得兩個抗病基因功能片段[45]；2018年將編碼谷胱甘肽合成酶的StGCS-GS基因轉(zhuǎn)化到甜菜體內(nèi)，共獲得7個轉(zhuǎn)基因甜菜株系[46]。魯振強等將草甘膦靶基因At EPSPs的功能域進行克隆獲得了抗草甘膦除草劑基因功能片段[47]；2018年采用同源克隆及cDNA末端快速擴增（RACE）的方法，首次從甜菜M14品系中克隆了與生殖相關(guān)的基因BvMARB的全長cDNA序列[48]。國內(nèi)關(guān)于甜菜叢根病的相關(guān)研究仍很有限。而國外Strausbaugh等研究了甜菜壞死黃脈病毒和冷凍溫度對甜菜根貯藏的影響。發(fā)現(xiàn)BNYVV不僅會導致感病甜菜品種的產(chǎn)量和蔗糖損失，而且當溫度降至-2.2℃以下時，還會產(chǎn)生更多的凍根組織。根據(jù)這些觀察，整個冬季用于非凍糖甜菜堆根冷卻的氣溫不應低至-2.2°C以下，以最大限度地保持蔗糖[49]。

2.2 組學研究和m iRNA在甜菜叢根病上的研究進展

轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組的方法也大量應用于甜菜研究中。Webb等研究了感病材料在病毒侵染后蛋白質(zhì)水平出現(xiàn)哪些變化，通過脅迫處理后取葉片提取總蛋白，用質(zhì)譜技術(shù)進行定量分析。以闡明病毒與宿主植物互作過程中表達的蛋白類型。通過蛋白組學方法鑒定出203種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)功能蛋白主要是光合作用、能量代謝、新陳代謝以及與刺激反應相關(guān)的蛋白。這些蛋白與一般植物防御反應的系統(tǒng)獲得性抗性有關(guān)[50]。張輝等利用蛋白組學的方法研究了BNYVV侵染后不同材料的蛋白質(zhì)差異蛋白反應，發(fā)現(xiàn)不同材料對病毒脅迫處理產(chǎn)生的反應有所不同，抗性材料表達的差異蛋白主要是光合作用蛋白、糖代謝蛋白、呼吸抗氧化作用蛋白、信號轉(zhuǎn)導蛋白以及脂代謝等蛋白；感病材料表達的蛋白主要是光合作用蛋白和呼吸抗氧化蛋白，即自身反應表達的蛋白[51]。Fan等對BNYVV接種后的甜菜提取了總RNA，通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得重新組裝的基因序列數(shù)據(jù)75 917個SNP，平均長度為1 054 bp，通過BLAST比對，獲得39 372個SNP注釋。預測了4 834個簡單序列重復序列（SSRs），通過轉(zhuǎn)錄序列的比較分析，發(fā)現(xiàn)261個基因在感染的植物中差異表達，128個基因上調(diào)，133個基因下調(diào)[52]。

植物微RNA（miRNAs）是一類在植物發(fā)育、防御和癥狀發(fā)展中起重要作用的非編碼RNA。近年來在不同作物上開展了大量的研究。Liu等利用測序的方法鑒定了547個miRNAs，其中包括129個miRNA家族，發(fā)現(xiàn)282個新miRNAs。差異表達分析后，對BNYVV感染相關(guān)的miRNAs進行微陣列分析和RT-qPCR確證。發(fā)現(xiàn)38個miRNA家族包括103個已知miRNAs和45個新miRNAs。而這些具有表達差異的miRNAs參與激素的生物合成和信號轉(zhuǎn)導，進而可以促進腋芽的發(fā)育和植物的防御[53]。

3 展望

甜菜叢根病能對甜菜生產(chǎn)造成嚴重的危害，導致甜菜根產(chǎn)量和含糖率的嚴重下降。目前，國外科研人員通過長時間的努力培育出了一些具有叢根病抗性資源的品種。國內(nèi)科研人員在叢根病抗性選擇上也付出了很大努力，通過長年的選育工作也取得了一定的成績，培育出了叢根病抗性品種。但對其育種材料的抗病機理并未研究清楚。因此著眼于國內(nèi)自育的抗性材料，期望從分子水平對其抗病機理展開一系列研究是我們未來的研究方向。利用現(xiàn)代分子技術(shù)方法實現(xiàn)甜菜叢根病抗性品種的快速選育，以建立我國甜菜分子育種創(chuàng)新研究體系，對加快甜菜抗叢根病品種的培育工作有著重要的理論和實踐意義。