臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞與卵巢早衰中顆粒細(xì)胞交互作用的研究進(jìn)展

李慧，陳曦，昌曉紅

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在 40 歲之前出現(xiàn)的以卵巢功能過早衰竭（如月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、不孕等）為主要臨床表現(xiàn)的綜合征[1]。雌激素水平低和不孕是對育齡婦女的兩大威脅。近年來，癌癥在育齡期女性中的發(fā)病率逐漸增加，雖然化療可延長癌癥患者生存時間，但也會出現(xiàn)一些副作用，其中化療引起的 POF 越來越受到關(guān)注。有研究報道化療藥物主要通過損害卵巢顆粒細(xì)胞 DNA 及激活細(xì)胞凋亡通路等誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞凋亡，繼而引起卵泡閉鎖，降低卵巢功能[2]。

顆粒細(xì)胞是一種卵巢合成和分泌抑制素、雌激素的主要功能細(xì)胞，在女性卵泡的生長、發(fā)育和成熟，黃體生成等方面發(fā)揮著重要作用。顆粒細(xì)胞在卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育中起到支持雌激素介導(dǎo)的調(diào)節(jié)作用，并維持卵巢的激素平衡，以通過自分泌和旁分泌機(jī)制促進(jìn)卵母細(xì)胞成熟。顆粒細(xì)胞生長的好壞對卵泡的發(fā)育、成熟及激素的分泌具有至關(guān)重要的作用。顆粒細(xì)胞功能失調(diào)時，常常引起卵泡發(fā)育障礙和激素分泌異常，最終導(dǎo)致卵泡閉鎖。

目前，POF 的治療方法主要為激素替代療法，該療法主要以改善癥狀為主，長期使用可引發(fā)心血管疾病、腫瘤等患病風(fēng)險。大量研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）可以抑制顆粒細(xì)胞凋亡，改善卵巢早衰動物卵巢儲備功能，增加卵泡數(shù)和排卵[3-5]，這些證據(jù)表明間充質(zhì)干細(xì)胞治療 POF 具有潛在的臨床應(yīng)用價值。MSCs 可從多種組織中分離出來，包括骨髓、神經(jīng)組織、脂肪組織、羊水、胎盤和臍帶等，具有自我更新及多系分化潛能，可分化成不同的祖細(xì)胞[6]。現(xiàn)就間充質(zhì)干細(xì)胞對卵巢顆粒細(xì)胞影響方式進(jìn)行綜述。

1 MSCs 對 POF 中顆粒細(xì)胞干細(xì)胞特性的影響

顆粒細(xì)胞并不是終末分化的細(xì)胞，它們可以進(jìn)一步發(fā)生黃素化，或者轉(zhuǎn)變?yōu)?Sertoli 細(xì)胞，在分裂方式及增殖方面雖然不具有干細(xì)胞的生物學(xué)特點，但其可表達(dá)多種具有多潛能分化功能的基因，該現(xiàn)象得到了大量研究支持。2009年，Kossowska-Tomaszczuk 等[7]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中長期存在白血病抑制因子（leukemia-inhibiting factor，LIF）時，顆粒細(xì)胞表面標(biāo)志物 FSHR 表達(dá)逐漸消失，分泌激素的功能逐漸降低，同時出現(xiàn)干細(xì)胞標(biāo)志 POU5F1、CD29、CD44、CD90、CD105 表達(dá)，體外培養(yǎng)時可分化成骨、軟骨及神經(jīng)元細(xì)胞等，該研究表明人卵巢中黃素化顆粒細(xì)胞具有干細(xì) 胞的特性，為后續(xù)顆粒細(xì)胞干細(xì)胞研究打下了基礎(chǔ)。Dzafic 等[8]發(fā)現(xiàn)從廢棄的卵泡液里分離出的顆粒細(xì)胞表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志物，如 OCT-4、NANOG 和 SOX-2，顯示出高端粒酶活性，同時在體外可分化成其他細(xì)胞類型。也有研究報道，顆粒細(xì)胞表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志物，包括 Nanog、Sox-2 和 TERT 等[9]，與上述結(jié)果一致。Yousefi 等[10]比較了兩種不同的體外培養(yǎng)條件，即卵泡液與胎牛血清對顆粒細(xì)胞多能性的影響，結(jié)果顯示在體外培養(yǎng)不超過 14 d 時，卵泡液更有利于顆粒細(xì)胞多能性的維持，可為后續(xù)用于誘導(dǎo)人顆粒細(xì)胞中干細(xì)胞特異性因子表達(dá)的培養(yǎng)基添加物提供依據(jù)。Maleki 等[11]比較了人體各種組織來源 MSCs 樣細(xì)胞表面特異性干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，其中顆粒細(xì)胞與臍帶來源 MSCs 均表達(dá) CD44、CD90、CD105、CD106、CD146、CD166 和 Stro-1 等常見的間充質(zhì)干細(xì)胞的特征抗原，其中 CD44 的高表達(dá)有助于細(xì)胞的干性功能維持。Dzafic 等[12]應(yīng)用 RT2 Profiler PCR array 技術(shù)，分析了 87 種與干細(xì)胞 MCSs 相關(guān)的基因表達(dá)譜，同時與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞能夠表達(dá) 57 種與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相同的基因，其中 16 種基因表達(dá)上調(diào)，20 種基因表達(dá)下調(diào)。而其中優(yōu)勢生長的顆粒細(xì)胞則能夠分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和胰腺細(xì)胞。盡管目前的研究表明顆粒細(xì)胞具有干細(xì)胞的特性，然而大多數(shù)研究僅局限在顆粒細(xì)胞與間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況的比較，干細(xì)胞能否影響顆粒細(xì)胞干性特征仍未明確，需進(jìn)一步研究。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞對 POF 中顆粒細(xì)胞凋亡的調(diào)控

目前 POF 的病因仍未明確，可能與遺傳、內(nèi)分泌、代謝、線粒體障礙、DNA 損傷等影響卵泡的發(fā)育相關(guān)。有研究報道 POF 發(fā)生最重要的機(jī)制是卵泡功能障礙和卵泡耗竭[13]。卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡是影響卵巢儲備和功能下降的重要機(jī)制。因此，抑制卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡，避免卵泡閉鎖，就有可能延緩或避免卵巢早衰的發(fā)生。一些研究表明，MSCs 可抑制 POF 動物模型中和體外顆粒細(xì)胞的凋亡。Yin 等[14]將人胎盤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hPMSCs）用于 POF 小鼠后，小鼠卵巢功能得到明顯改善，性周期、卵泡發(fā)育及激素 分泌均恢復(fù)正常，顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) hPMSCs 可能通過 Treg 細(xì)胞和細(xì)胞因子等改善小鼠卵巢功能。Xia 等[15]將竇前卵泡與間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)，一段時間后發(fā)現(xiàn)，MSCs 以劑量依賴方式改變卵泡存活率，增加卵泡生長速度，改善竇前卵泡的生存能力。進(jìn)一步分析顯示，MSCs 可促進(jìn)卵母細(xì)胞 GDF9 和 BMP15 的表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞抑制素 β 和 TGFβ 的表達(dá)。該研究提示：MSCs 可促進(jìn)竇前卵泡的發(fā)育，通過促進(jìn)體外卵泡生長，為生育力保護(hù)和保存提供很好的策略。Ding 等[16]將人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSCs）與自然衰老的人顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)，培養(yǎng)一周后發(fā)現(xiàn)，顆粒細(xì)胞增殖率明顯增加，細(xì)胞表面 AMH、FSHR、FOXL2、CYP19A1 的表達(dá)明顯增加，提示 hAMSCs 可能通過改善顆粒細(xì)胞的功能阻止人自然年齡卵巢功能的減退。Manshadi 等[17]建立 POF 小鼠模型，分為人子宮內(nèi)膜間充質(zhì)干細(xì)胞（HuMenSCs）治療組和對照組，HuMenSCs 治療組顆粒細(xì)胞表面 AMH、FSHR 的表達(dá)明顯增加，雌激素分泌增加，卵巢功能明顯改善。通過標(biāo)記 HuMenSCs，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞主要定位在卵泡周圍顆粒細(xì)胞層，該研究認(rèn)為 HuMenSCs 能夠分化顆粒細(xì)胞，同時具有分泌激素的能力。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 BMSCs 同樣具有改善顆粒細(xì)胞生長，恢復(fù) POF 模型卵巢功能的能力[18-19]。Fu 等[20]在體外培養(yǎng) BMSC 時，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞分泌 VEGF、HGF、IGF-1 等生長因子，同時發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞可抑制顆粒細(xì)胞凋亡和 Bcl2 蛋白的表達(dá)。BMSCs 可以改善圍絕經(jīng)期和順鉑誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的凋亡[21]。有研究者將自體 BMSCs 治療特發(fā)性 POF 患者，結(jié)果顯示，2 例（20%）在移植后 3 個月恢復(fù)月經(jīng)，其中一例（10%）懷孕并分娩了一個健康的嬰兒，提示間充質(zhì)干細(xì)胞可用于 POF 的治療，具體的作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索[22]。采用熱休克 HS 技術(shù)預(yù)處理大鼠骨髓 MSCs，提高干細(xì)胞抗凋亡能力，保證用于移植干細(xì)胞的數(shù)量和活力。將 HS 預(yù)處理的細(xì)胞與化療藥物預(yù)處理的顆粒細(xì)胞 1:1 共培養(yǎng)，檢測顆粒細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn) HS 預(yù)處理可抑制化療誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞凋亡。同時將 HS 預(yù)處理 MSCs 注射到 POF 大鼠雙側(cè)卵巢，發(fā)現(xiàn)可進(jìn)一步改善化療期間的卵巢結(jié)構(gòu)和內(nèi)分泌功能，且該組顆粒細(xì)胞凋亡數(shù)明顯少于 POF 模型組及 MSCs 治療組。顆粒細(xì)胞的凋亡與卵泡閉鎖密切相關(guān)。隨著顆粒細(xì)胞的凋亡減少，卵泡閉鎖也減少。該研究認(rèn)為，HS 預(yù)處理增強(qiáng) MSCs 修復(fù)作用的能力與抑制顆粒細(xì)胞的凋亡有關(guān)[23-25]。Xiao 等[26]研究發(fā)現(xiàn)羊水干細(xì)胞（amniotic fluid stem cells，AFSCs）來源外泌體可在體外預(yù)防環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的凋亡。同時 AFSCs 來源外泌體可通過 miR-146a 和 miR-10a 抑制顆粒細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠模型的卵泡閉鎖。Sun 等[27]通過提取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，huMSCs）來源的外泌體處理順鉑誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活力增加，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因 Bcl2、caspase3 表達(dá)上調(diào)，Bax、cleaved caspase3、cleaved PARP 的表達(dá)下調(diào)。該研究認(rèn)為 huMSCs 來源的外泌體可在體外預(yù)防順鉑 誘導(dǎo)的顆粒細(xì)胞的損傷，為后續(xù)干細(xì)胞治療 POF 提供了新的證據(jù)。

3 干細(xì)胞可發(fā)生顆粒細(xì)胞樣改變

卵巢皮質(zhì)中的卵泡數(shù)量和質(zhì)量、卵泡生長能力、卵巢發(fā)育和卵母細(xì)胞的形成決定卵巢儲備和功能。而卵巢儲備和功能是衡量女性生殖內(nèi)分泌功能和生育潛力的指標(biāo)。卵母細(xì)胞的質(zhì)量直接影響卵巢的儲備和功能，而顆粒細(xì)胞質(zhì)量差，最終可能導(dǎo)致 POF 的發(fā)生。有研究報道，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可在體外多種因子的作用下分化成卵巢顆粒樣細(xì)胞，細(xì)胞可表達(dá) AMH、inhibin α、inhibin β 及 FSH 受體分子，但不表達(dá) OCT-4、Nanog 等干細(xì)胞標(biāo)志物。當(dāng)這些顆粒樣細(xì)胞注入 POF 小鼠體內(nèi)時，可改善小鼠卵巢顆粒樣細(xì)胞的生長，修復(fù)卵巢損傷，維持卵巢結(jié)構(gòu)的完整性，以及促進(jìn)卵泡的生長和發(fā)育[28]。Lan 等[29]在體外培養(yǎng)條件下將胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為有功能的顆粒樣細(xì)胞，該細(xì)胞可分泌 AMH 和雌激素等，該研究為卵泡形成和激素分泌提供了可能，為后續(xù)深入研究提供了方向。以上研究表明，干細(xì)胞可在體外誘導(dǎo)分化為顆粒樣細(xì)胞，具有顆粒細(xì)胞內(nèi)分泌功能，可改善卵泡的生長和發(fā)育，為 POF 的治療提供了新方向。

綜上所述，MSCs 在體內(nèi)外與顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)時，可能通過影響顆粒細(xì)胞干細(xì)胞潛能、調(diào)控顆粒細(xì)胞凋亡或誘導(dǎo)分化為顆粒細(xì)胞來發(fā)揮各種生物學(xué)功能，從而促進(jìn)卵泡的生長和發(fā)育，改善卵巢儲備和功能，逆轉(zhuǎn) POF。MSCs 具有高增殖潛力，自我更新潛力和多重分化潛能，大量研究表明 MSCs 可改善 POF 動物模型的卵巢結(jié)構(gòu)和功能，這些都預(yù)示著 MSC 在 POF 治療方面具有光明的臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用前景。然而，MSCs 對卵巢早衰中顆粒細(xì)胞具體作用機(jī)制仍未明確，仍需進(jìn)一步研究。