陳貞年，王曉清

（1.湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南 長沙 410128；2.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 常德 415000）

性別決定與性別分化機制一直是動物學領域的熱門課題，人們不間斷地在動物性別控制領域投入大量精力，探索如何更加高效地控制其性別。近三十年來，隨著分子遺傳學和現(xiàn)代分子生物技術的迅速普及、發(fā)展、完善。人們對性別決定機制的認識逐漸深入到細胞水平，發(fā)現(xiàn)了與性別控制有直接關系的染色體——性染色體，這使得從基因水平上研究和控制動物的性別成為可能。

1 爬行動物性別決定研究進展

在脊椎動物中，人和哺乳類的性別決定機制已經(jīng)做了大量研究，也取得了一些成果。但迄今，仍未解析出很多動物的性別決定機制，龜鱉類就是一例。

爬行動物的胚胎在發(fā)育過程中，要經(jīng)歷性別決定和性別分化這兩個階段。性別決定是指胚胎原始生殖腺受體內遺傳物質影響而向精巢或卵巢發(fā)育的過程[1]，而性別分化則是指建立起次級特征的全部形態(tài)變化及生理變化差異。目前，爬行動物的性別決定類型可劃分為兩大類：一類是基因型性別決定（Genetic sex determination,GSD），指源于性染色體上的性別決定基因先導調控并誘導相關性別決定基因級聯(lián)反應的過程，最終調控原始生殖腺朝精巢方向或卵巢方向定向發(fā)育的過程。爬行動物的基因型類型可分為：①XY型，XY表現(xiàn)為雄性，XX表現(xiàn)為雌性；②ZW型，ZZ表現(xiàn)為雄性，ZW表現(xiàn)為雌性。另一類是環(huán)境型性別決定（Environmental sex determination，ESD），指后代的性別分化不依賴遺傳物質的組成，而是受控于胚胎發(fā)育時的環(huán)境因子（如溫度、光照、濕度、類固醇激素等），最典型的環(huán)境型性別決定是溫度依賴型性別決定（Temperature-dependent sex determination，TSD）。

自從1962年Becak首次在爬行動物中發(fā)現(xiàn)異型染色體之后，人們也漸漸地在其他爬行動物中發(fā)現(xiàn)了性染色體的存在，其中分化程度最為明顯的是蛇類，屬于ZW/ZZ型。Schartl[2]調查發(fā)現(xiàn)，蜥蜴目7科70多種都存在性染色體，一部分屬于ZW型，一部分屬于XY型。在龜鱉目中，北美泥龜科十字龜屬中的兩種（S.valvini、S.tripocatus）具有 XX/XY 型性染色體[3]。

2 溫度對性別決定的研究

在爬行類、兩棲類和少數(shù)魚類中普遍存在溫度依賴型性別決定[4-6]。Charmier[7]在1966年首次報道爬行動物性別受孵化溫度的影響，Pieau[8]在后續(xù)研究中發(fā)現(xiàn)溫度是影響性別決定的主要因子，并提出了溫度依賴型性別決定類型。Bull等[9,10]研究了5種龜類的性別后提出了TSD機制。Ewert等[11]將溫度依賴型性別決定分為三種：①MF（TSDⅠa）型，指低溫產(chǎn)雄性，高溫產(chǎn)雌性；②FM（TSDⅠb）型，指高溫產(chǎn)雄性，低溫產(chǎn)雌性；③FMF（TSDⅡ）型，指低溫和高溫均會產(chǎn)雌性，而中間溫度則產(chǎn)雄性。而朱新平等[12]的研究則表明，黃喉擬水龜Mauremys mutica Cantor的性別決定屬于TSD機制，為TSDⅠ型，其臨界溫度值為29℃。與黃喉擬水龜相同，珍珠鱉Apalone ferox Schneider的性別決定也屬于TSD機制，為TSDⅠa型，即高溫產(chǎn)雌性，低溫產(chǎn)雄性，其臨界溫度值為28℃[13]。

近年來，隨著分子遺傳學和分子生物學技術的普及與發(fā)展，龜鱉類性別決定的關鍵基因漸漸被發(fā)現(xiàn)與克隆，在龜鱉類的TSD機制研究上也取得了新進展[14,15]。研究發(fā)現(xiàn)，龜鱉類性腺中的Dmrt1、Sox9、Mis、Sf1、Amh、Dax1、Wt1 和 Foxl2 等性別決定基因受溫度因子的調控。當溫度改變時，這些關鍵調控因子也會做出相應的變化[16-18]。

在TSD類型的爬行動物中，性腺發(fā)育有個特殊的溫度敏感期（Temperature sensitive period，TSP），指動物胚胎發(fā)育到某特定階段時，孵化的溫度對性別起到?jīng)Q定性作用，這是動物胚胎性別出現(xiàn)逆轉的特殊時期[19,20]。溫度敏感期一般是在整個胚胎孵化周期的前1/3時期（第14～21期內）。動物溫度敏感期存在種間差異，同一種動物的溫度敏感期也存在性別差異。例如，淡水龜鱉類的胚胎發(fā)育周期可分為27期，海龜?shù)呐咛グl(fā)育周期可分為31期[21]；紅耳龜Trachemys scripta雄性周期在16～21期，雌性周期在 17～19 期[22]；Tokita 等[23]將中 華 鱉 Pelodiscus sinensis從神經(jīng)胚到出殼期劃分為23期，劃分從孵化的第2d（第5期）開始，至孵化的第48d（第27期）結束；錦龜Chrysemys picta的敏感溫度期在第16～22期，若孵化溫度低于25℃，溫度敏感期可能在16期前并影響性腺的分化[24]；謝萬奎[25]研究發(fā)現(xiàn)，歐洲甲魚的性別分化對溫度的敏感度特高，不同的孵化溫度直接影響子代的性別，孵出不同性別的稚鱉。

3 溫度對中華鱉性別決定的影響

目前對孵化溫度與中華鱉性別決定的關系做了很多研究，但結果仍存在較大爭議。朱道玉和孫西寨[26]研究發(fā)現(xiàn)，在24～34℃時，隨孵化溫度的上升雌性率降低，雄性率升高，溫度24℃時，雌性率最大，溫度32℃時，雄性率最大。孫西寨[27]和唐瑤[28]的實驗也得到相同的結果，認為中華鱉屬于溫度依賴型，而不依賴于遺傳物質決定。阮成旭和袁重桂[29]發(fā)現(xiàn)，在32℃下孵化的中華鱉雄性率高達72.1%，而在27℃下孵化，雄性率只有42.3%，調控孵化溫度可以改變中華鱉的性別比例。巫旗生等[30]發(fā)現(xiàn)，調控孵化溫度可以調控中華鱉胚胎的性別分化，子代雄性率隨溫度升高而上升，雌性率隨著溫度升高而降低。高麗麗[31]根據(jù)360枚中華鱉卵孵化的結果推斷中華鱉屬于溫度依賴型性別決定機制。

而聶劉旺等[32]的研究結果卻與朱道玉等的結果相反，他發(fā)現(xiàn)中華鱉的性別分化受孵化溫度影響為MF型，即隨著溫度的升高，雌性率上升，雄性率降低。羅曼等[33]發(fā)現(xiàn)孵化溫度在24～26℃時，孵出稚鱉的雄雌比大于1，而孵化溫度在27～29.5℃時，孵出稚鱉的雄雌比小于1，觀察體細胞沒有發(fā)現(xiàn)異型染色體。任少亭等[34]的實驗結果也驗證了羅曼等的觀點。

研究表明，龜鱉類中存在TSD性別決定機制[35-39]。賀斌等[40]研究發(fā)現(xiàn)，溫度影響 Sf1、Mis、Sox9、Dax1、W t1和Dmrt1等參與龜鱉類的性別分化基因的表達。而李慧君[41]則認為中華鱉中有些基因的表達受溫度因子調控，但孵化溫度與性別決定之間的聯(lián)系、以及溫度調控相關性基因表達的機制還有待進一步研究證實。

4 雌雄激素對龜鱉類性別分化的影響

龜鱉類胚胎隨著發(fā)育，雙向潛能性腺在經(jīng)歷髓質的發(fā)育和皮質的退化后形成精巢；而雙向潛能性腺在皮質的發(fā)育和髓質的退化后則形成卵巢[42]。雌激素對整個胚胎發(fā)育過程起重要作用，雌激素能促進性腺皮質發(fā)育，抑制髓質發(fā)育，影響胚胎的性腺分化[43,44]。研究表明，在雄性孵化溫度條件下，將雌二醇激素注入菱斑龜Malaclemys terrapin、密河鱷Alligator mississippiensis、恒河鱷 Gavialis gangeticus的胚胎，可誘導胚胎性腺朝向卵巢方向分化[45]。葉玉珍等[46]實驗發(fā)現(xiàn)，甲基睪丸素具有促使中華鱉胚胎性別趨向雄性轉化，而唐瑤[28]則認為甲基睪酮并不能改變中華鱉個體自身性別分化方向，更不能使仔稚鱉發(fā)生性逆轉，可能只對個體的生長發(fā)育有一定的促進作用。胡增高[47]研究了中華鱉血漿中性激素含量的季節(jié)性變化，發(fā)現(xiàn)雄中華鱉在發(fā)情高峰期血漿中性激素含量最高；烏龜、黃喉擬水龜和中華鱉的性激素季節(jié)性變化比較發(fā)現(xiàn)，雌性中華鱉血漿中雌二醇含量隨卵巢卵泡的增長和發(fā)育而逐漸提高，當卵巢發(fā)育成熟時血漿中雌二醇含量達到最大值，而雄性中華鱉在繁殖期血漿睪酮含量高，說明睪酮對精子的形成與成熟至關重要。雄黃喉水龜中睪酮激素含量最高，中華鱉中含量最低；雌中華鱉中雌二醇激素含量最高，烏龜中含量最低[48]。于文萍[49]的研究也發(fā)現(xiàn)，中華鱉睪酮與生精作用和卵泡生長密切相關，而卵黃的形成和精原細胞、精母細胞以及精子的發(fā)育成熟均離不開雌二醇的作用。在整個胚胎性腺發(fā)育過程中，AR、ERα和芳香化酶的表達貫穿始終，說明在性腺分化前，雄激素、雌激素和芳香化酶就已經(jīng)開始發(fā)揮作用[49]。Parker等[50]在分子水平上發(fā)現(xiàn)，Sf1能控制細胞表達性腺類固醇激素發(fā)生酶，其中包括芳香化酶在內。王莉等[51]發(fā)現(xiàn)，雌激素一方面是通過抑制Dmrt1和Sox9這兩個雄性因子表達來抑制胚胎向雄性分化，又促進卵巢的生長發(fā)育，促使胚胎向雌性發(fā)育，揭示雌激素對中華鱉胚胎性別分化的調控作用。

5 有關性別遺傳決定機制的研究

近年來，已有研究表明，中華鱉存在微小性染色體（Z/W），屬于GSD機制[17,52-55]。在中華鱉33對染色體中，1～6號為大型染色體，其余均為小型染色體。各種實驗也證實了這一發(fā)現(xiàn)，Kawai等[53]運用熒光原位雜交（FISH）定位技術，在中華鱉中發(fā)現(xiàn)了異性染色體；Badenhorst等[56]通過同源染色體配對表明，中華鱉和刺鱉Apalone spinifera均存在異性染色體（ZZ/ZW）。Literman等[57]通過實時定量PCR來鑒定中華鱉性染色體型。唐偉等[58]采用秋水仙素處理和核型分析驗證中華鱉性染色體型為ZZ/ZW型（ZZ型為雄性；ZW型為雌性），并得出其核型公式為2n=66=4m+4st+34sm+22T+ZZ/ZW。

在性別調控關鍵基因的研究中，孫偉等[59]和蔡晗等[60]通過慢病毒介導鑒定了Dmrt1和Amh基因為中華鱉雄性分化的關鍵基因。包海聲等[61]實驗發(fā)現(xiàn)，在中華鱉性腺分化前Cyp19a1在雌性中特異性表達，經(jīng)過芳香化酶抑制劑（AI）處理及Cyp19a1-shRNA處理后，ZW型的胚胎性腺皮質區(qū)漸漸退化，而髓質區(qū)卻高度發(fā)育，最終形成原始性索結構，表現(xiàn)出由雌性向雄性發(fā)育的性逆轉現(xiàn)象。認為Cyp19a1是調控卵巢早期分化的重要因子，在啟動雌性分化通路中起關鍵作用。Matsumoto等[62,63]發(fā)現(xiàn)，Cyp19a1在雌紅耳龜性腺分化關鍵時期中大量特異性表達。轉錄因子結合位點分析發(fā)現(xiàn)，Dmrt1和Foxl2與Cyp19a1密切聯(lián)系，Dmrt1和Foxl2可直接調控Cyp19a1。Shoemaker等[64]發(fā)現(xiàn)，在巴西龜?shù)臏囟让舾性缙?，胚胎的性腺中都檢測到Sox9的表達。但到了溫度敏感的中后期就出現(xiàn)了表達差異，表現(xiàn)為在雄性性腺中Sox9表達顯著上升，在雌性中顯著下降。這表明Sox9對于胚胎精巢的生長發(fā)育至關重要，對胚胎的性別分化有一定的影響。在八孔海龜Lepidochelys olivacea的性別決定中后期，Sox9在雄性性腺中高度特異性表達，被認為是雄性性別分化的關鍵基因之一[65]。Barske等[66]用β-雌二醇處理巴西龜胚胎，使在雄性溫度下形成的胚胎發(fā)生性逆轉，對比發(fā)現(xiàn)，Sox9在雌性中的表達水平顯著降低。實驗結果表明，內源性雌激素抑制了Sox9的表達，促使性腺向雌性發(fā)育。Matsumoto等[67]用芳香化酶抑制劑誘導雌性溫度下的胚胎向雄性發(fā)育，并檢測到Sox9的表達水平顯著上調。Dmrt1在紅耳龜Trachemys scripta和太平洋麗龜Lepidochelys olivavea等龜鱉類胚胎中的表達存在顯著差異[68,69]，即在雄性中的表達顯著高于雌性。牟毅[70]發(fā)現(xiàn)，孵化溫度對中華鱉的性別無顯著影響，比較基因組雜交結果顯示，在兩個爭議種群的雌性成體中具異型性染色體，表明這兩個種群的性別決定為GSD且屬ZZ/ZW系統(tǒng)；并提出了新的假說——有效雌二醇積累（sumeE2）閥值假說，合理的闡釋了溫度對爬行動物胚胎性別的決定作用。

6 小結

爬行動物的性別決定過程是一個復雜的、多個性別相關基因精確調控以及有多種激素參與的過程，性別調控關鍵基因的篩選和功能鑒定是解析性別決定分子機制的關鍵。目前龜鱉類性別決定相關基因功能的研究還較薄弱，尚未建立溫度、激素以及基因三者的級聯(lián)作用模型。隨著分子遺傳學和分子生物學技術的普及、進步、完善，相信不久的將來一定可以解析其性別決定分子機制。