康文娟，姜哲浩，師尚禮

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

與植物相關(guān)的細(xì)菌大多存在于土壤、植物根際、表面或組織內(nèi)。定殖在植物內(nèi)部組織并不對植物造成傷害的一類細(xì)菌稱為內(nèi)生細(xì)菌(Endophytic bacteria)[1-2]。內(nèi)生細(xì)菌定殖性強(qiáng)，不易受外界環(huán)境影響，能夠促進(jìn)植物生長[3-4]，增強(qiáng)植株的生物和非生物[5-6]抗性，產(chǎn)生植物生長促進(jìn)激素IAA和溶解磷元素[7]，對宿主植物有穩(wěn)定、直接而有益的影響。內(nèi)生細(xì)菌幾乎在已研究的所有植物中都有發(fā)現(xiàn)，分離自豆科植物根瘤的內(nèi)生細(xì)菌已超過129個種(54個屬)，其中Bacillus，Pseudomonas，Paenibacillus，Agrobacterium，Enterubacterium是優(yōu)勢屬[8]。有關(guān)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性[9]、生防效果[10]和促生能力[11]方面的研究已有很多報道。與內(nèi)生細(xì)菌相對，存在于根際和土壤的細(xì)菌稱為非內(nèi)生細(xì)菌(Non-endophytic bacteria)。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是重要的豆科牧草，其環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，粗蛋白含量豐富。紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌能夠不同程度地拮抗多種病原真菌，抑制尖孢鐮刀對紫花苜蓿造成的萎蔫作用，具有較強(qiáng)的生防效果[12-13]；有些內(nèi)生細(xì)菌能夠產(chǎn)嗜鐵素、HCN、幾丁質(zhì)酶和羧甲基纖維素酶等[14]；部分紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌也因其促生能力在生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用[15]。根瘤菌是有益的土壤細(xì)菌，能夠在土壤中與苜蓿共生結(jié)瘤固氮，也能夠在植物組織內(nèi)定殖[16-18]。已有大量內(nèi)生根瘤菌分離自紫花苜蓿的種子[19-20]、花、葉、莖和根[21-22]。

目前，對紫花苜蓿內(nèi)生細(xì)菌(來自根瘤、種子、根、莖、葉和花等)和非內(nèi)生細(xì)菌(來自土壤)種群的遺傳多樣性進(jìn)行綜合研究較少。通過分離和鑒定甘肅省3個不同栽培區(qū)域5個紫花苜蓿品種的內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌，并對其遺傳多樣性和促生能力進(jìn)行研究，旨在從整體水平上闡明內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌種群之間的聯(lián)系和多樣性差異。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)地概況 2014年5月和8月，分別在甘肅省武威市涼州區(qū)黃羊鎮(zhèn)牧草試驗(yàn)站、白銀市會寧縣會師鎮(zhèn)牧草試驗(yàn)基地和甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)蘭州牧草試驗(yàn)站進(jìn)行采樣。樣地基本概況見表1。

1.1.2 苜蓿品種 5個供試紫花苜蓿品種均已生長2年，分別為國內(nèi)選育品種甘農(nóng)3號(M.sativacv.Gannong No.3)和甘農(nóng)9號(M.sativacv.Gannong No.9)、地方品種隴中(M.sativacv.Longzhong)和清水(M.sativacv.Qingshui)、引進(jìn)美國品種WL168HQ(M.sativacv.WL168HQ)(表1)。

1.1.3 培養(yǎng)基和營養(yǎng)液 菌株培養(yǎng)采用YMA培養(yǎng)基，活化采用TY培養(yǎng)基。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 于2014年5月(初花期)在各樣地隨機(jī)采集5份植株、根際土壤和田間土壤，8月(成熟期)田間收集種子，并清選。分別裝于自封袋，標(biāo)記，冰桶冷藏條件下帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 菌株分離及純化 用無菌剪刀將植株分為花、莖、葉、根瘤、根表皮和根中柱，將種子及以上組織分別置于50 mL無菌三角瓶，用0.45%～0.55%(w/v)碘伏滅菌3 min，無菌水沖洗5次，無菌濾紙吸干表面明水后研磨至勻漿；制備根際土壤和田間土壤懸浮液；采用稀釋涂抹法分別分離組織研磨勻漿中的內(nèi)生細(xì)菌和土壤懸浮液中的非內(nèi)生細(xì)菌。每個處理4個重復(fù)。分離和純化后的菌株于YMA培養(yǎng)基4℃保存。操作參考Miao[23]的方法。

表1 菌株和樣地概況Table 1 Details of bacteria and sampling sites

1.2.3 細(xì)菌DNA提取和PCR擴(kuò)增 用上海生工生物工程有限公司細(xì)菌DNA提取試劑盒(SK8256)提取內(nèi)生菌基因組DNA，方法參見試劑盒說明書。采用引物P1 (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG AAC GCT-3′)和P6 (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)[24]、nodC540 (5′-TGATYGAYA TGGARTAYTGGYT-3′)和nodC1160 (5′-CGYGACARCCARTCGCTRTTG-3′)[25]、nifHF(5′-TAC GGNAARGGSGGNATCGGCAA-3′)和nifHR(5′-AGCATGTCYTCSAGYTCNTCCA-3′)[26]分別對細(xì)菌的16S rRNA、nodC和nifH基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。25 μLPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為13 μL 2 ×TaqMaster Mix,1 μL上游和下游引物,2 μL純化的DNA,8 μL ddH2O。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)的94℃變性30 Sec，58℃退火1 min，72℃延伸2 min，以及72℃終延伸10 min[24]。結(jié)瘤基因nodC擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)的94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，以及72℃終延伸5 min[25]。固氮基因nifH擴(kuò)增反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，30個循環(huán)的94℃變性1 min，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，以及72℃終延伸5 min[26]。1.5%瓊脂糖凝膠(TAE) 100 V電泳30 min，UV檢測16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小和產(chǎn)量；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于-20℃保存。

1.2.4 16S rRNA基因PCR-RFLP 選用4種限制性內(nèi)切酶HinfⅠ、AluⅠ、HaeⅢ和MspⅠ對16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切[27]。酶切反應(yīng)體系為3 μL 16S rRNA基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，5 U內(nèi)切酶，1 μL緩沖液，ddH2O補(bǔ)足至10 μL，于37℃水浴酶切反應(yīng)12 h。3%瓊脂糖凝膠(TAE) 200 V電泳40 min，UV檢測酶切結(jié)果，TIFF格式保存。

1.2.5 序列測定分析 供試菌株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海生工生物有限公司進(jìn)行測序。通過EzBioCloud鑒定服務(wù)網(wǎng)站 ( https://www.ezbiocloud.net/)[28]獲得與目的序列同源性最高的模式菌株16S rRNA序列；通過NCBI數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly)選擇與目的序列同源性最高的模式菌株nodC和nifH序列。用MEGA 6.0軟件中的ClustalW進(jìn)行序列相似性比對[29]，選用Neighbor-joining法進(jìn)行UPGMA分析生成系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap法(1 000次重復(fù))檢驗(yàn)發(fā)育樹。

1.2.6 菌株溶磷和分泌IAA能力測定 采用有機(jī)磷蛋黃卵磷脂EYPC和無機(jī)磷Ca3(PO4)2固體培養(yǎng)基溶磷圈法測定菌株溶磷能力[30]，28℃培養(yǎng)7 d后測定根瘤菌菌落溶磷透明圈直徑與菌落直徑的比值(D/d)。參照文獻(xiàn)[31]的方法分析菌株分泌IAA的能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2010制表；Shannon-Weiner多樣性指數(shù)計算參考柯春亮的方法[32]。用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，用平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示測定結(jié)果，分別對不同菌株D/d值進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離的菌株

從甘肅省3個地理區(qū)域的5個紫花苜蓿品種不同部位分離到103株細(xì)菌(表1)。73株內(nèi)生細(xì)菌分別分離自根瘤(41)、根表皮(18)、根中柱(9)、莖(2)、花(2)和種子(1)，30株非內(nèi)生根瘤菌來自田間土壤(19)和根際土壤(11)。葉片中沒有分離到內(nèi)生細(xì)菌。

2.2 16S rRNA基因PCR-RFLP

為了闡明103株細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和分類地位，用4種限制性內(nèi)切酶對菌株16S rRNA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，得出16S rRNA RFLP分型組合(表2,3)。103株純化的菌株經(jīng)4種內(nèi)切酶反應(yīng)共產(chǎn)生34種酶切組合。內(nèi)生細(xì)菌中共產(chǎn)生27種酶切組合，非內(nèi)生細(xì)菌中共產(chǎn)生16種酶切組合。Enisifermeliloti種內(nèi)有7個酶切類型，Rhizobiumradiobacter種內(nèi)有12個酶切類型，其余所有細(xì)菌種內(nèi)均僅存在1個酶切組合。

2.3 根瘤菌16S rRNA測序分析

根據(jù)16S rRNA基因PCR-RFLP分析結(jié)果(表2，3)，選擇34個代表菌株(R-strains)進(jìn)行16S rRNA基因部分序列測定。結(jié)果表明，34株代表菌株屬于15個屬，根據(jù)16S rRNA基因核酸序列相似性，所有菌株都可以被劃分為特定的種(圖1)。其中3個屬的菌株屬于根瘤菌：Rhizobiumradiobacter(與ATCC 19358T序列97%～98%相似，12個酶切類型，20株)、R.hizobiumrosettiformans(與W3T序列100%相似，1個酶切類型，1株)、Ensifermeliloti(與LMG 6133T序列99%～100%相似，7個酶切類型，32株)和Phyllobacteriumcatacumbae(與CSC19T序列98%相似，1個酶切類型，2株)；12個屬的菌株屬于非根瘤菌：Sphingomonaskyeonggiensis(與THG-DT81T序列97%相似，1個酶切類型，1株)、Lysinibacillusfusiformis(與NBRC 15717T序列99%～100%相似，1個酶切類型，15株)、Bacillustoyonensis(與BCT-7112T序列99%相似，1個酶切類型，2株)、Psychrobacillussoli(與NHI-2TT序列97%相似，1個酶切類型，7株)、Exiguobacteriummexicanum(與8NT序列97%相似性，1個酶切類型，1株)、Variovoraxparadoxus(與NBRC 15149T序列99%相似，1個酶切類型，1株)、Pseudomonassimiae(與OLiT序列99%相似，1個酶切類型，2株)、P.granadensis(與F-278770T序列99%相似，1個酶切類型，5株)、Acinetobacterpittii(與CIP 70.29T序列100%相似，1個酶切類型，1株)、Erwiniagerundensis(與EM595T序列99%相似，1個酶切類型，2株)、Enterobacterasburiae(與JCM 6051T序列99%相似，1個酶切類型，1株)、Leclerciaadecarboxylata(與NBRC 102595T序列98%相似，1個酶切類型，2株)和Enterobacterludwigii(與EN-119T序列99%相似，1個酶切類型，8株)。

表2 代表菌株16S rRNA PCR-RFLP和不同種在栽培區(qū)域和苜蓿品種的分布Table 2 RFLP analysis of PCR-amplified 16S rRNA and distribution of different species of representative strains in cultural region and alfalfa varieties

注：a 基于16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹的種名；b字母組合(A-J,a-z) 代表由4種內(nèi)切酶AluⅠ,HaeⅢ,HinfⅠ 和MspⅠ反應(yīng)產(chǎn)生的16S rRNA RFLP基因型

表3 代表菌株不同種在各部位組織的分布Table 3 Distribution of different species of representative strains in plant tissues

注：a 基于16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹的種名；b 種內(nèi)16S rRNA RFLP條帶類型

圖1 代表菌株16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 1 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequences of representative isolates

2.4 細(xì)菌在栽培區(qū)域、苜蓿品種和組織部位的分布

2.4.1 細(xì)菌種內(nèi)不同酶切類型的分布 細(xì)菌種內(nèi)16S rRNA PCR-RFLP類型在不同區(qū)域、苜蓿品種和部位組織的分布表示菌株遺傳變異程度(表2，3)。E.meliloti種內(nèi)存在7個酶切類型，EM1(24)豐度最高，在3個栽培區(qū)域、5個苜蓿品種以及根瘤、表皮、中柱和田間土壤均有分布。EM2～EM7中除EM4代表3個菌株并分布在武威甘農(nóng)9號苜蓿根瘤外，其余5個酶切類型僅代表1個菌株，如EM2，EM6和EM7分布于武威甘農(nóng)3號根瘤，EM3和EM5分別分布于會寧隴中苜蓿根表皮和根瘤。R.radiobacter種內(nèi)存在12個酶切類型，RR6(5)和RR9(5)豐度最高，前者分布在武威甘農(nóng)9號田間土壤和會寧隴中苜蓿根表皮，后者分布于蘭州WL168HQ苜蓿的根瘤、中柱和莖。其余10種酶切類型僅代表1個菌株并具有分布部位專一性，如RR1、RR2、RR3、RR4和RR5分別分布于武威甘農(nóng)3號苜蓿的中柱、中柱、根瘤、根表皮和根際土壤，RR7和RR8均存在于會寧隴中苜蓿的根際土壤，RR10、RR11和RR12分別分布于蘭州WL168HQ苜蓿根瘤、種子和田間土壤。

2.4.2 細(xì)菌不同種的分布 除E.meliloti和R.radiobacter以外的所有細(xì)菌種內(nèi)均僅存在1種酶切組合，每個酶切組合代表1種細(xì)菌(15種)。其中根瘤菌有2個種：R.rosettiformans(蘭州WL168HQ苜蓿田間土壤)和P.catacumbae(會寧隴中苜蓿根瘤和清水苜蓿根表皮)；非根瘤菌有13個種：E.ludwigii(武威甘農(nóng)3號苜蓿根表皮、根中柱、田間土壤以及蘭州WL168HQ苜蓿田間土壤)、V.paradoxus(武威甘農(nóng)3號苜蓿根中柱)、P.soli(武威甘農(nóng)9號苜蓿根中柱、會寧隴中苜蓿根表皮和清水苜蓿根瘤、根表皮和田間土壤)、B.toyonensis(武威甘農(nóng)9號苜蓿根瘤)、L.adecarboxylata(武威甘農(nóng)9號苜蓿根表皮和田間土壤)、L.fusiformis(武威甘農(nóng)9號苜蓿根表皮、根中柱和根際土壤、會寧隴中苜蓿根瘤、根表皮、根際土壤和花、清水苜蓿根瘤和根際土壤以及蘭州WL168HQ苜蓿根表皮和根際土壤)、P.granadensis(武威甘農(nóng)3號田間土壤和甘農(nóng)9號苜蓿根際土壤以及蘭州WL168HQ苜蓿根瘤、莖和田間土壤)、P.simiae(會寧清水苜蓿根表皮和蘭州WL168HQ苜蓿根際土壤)、E.gerundensis(會寧清水苜蓿花和田間土壤)、A.pittii(武威甘農(nóng)3號苜蓿根瘤)、E.asburiae(蘭州WL168HQ苜蓿田間土壤)、E.mexicanum和S.kyeonggiensis(會寧隴中苜蓿根中柱和田間土壤)。

2.5 細(xì)菌遺傳多樣性

紫花苜蓿內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性豐富，在各栽培區(qū)域、苜蓿品種和部位存在差異(表4)。區(qū)域以甘肅武威細(xì)菌多樣性最豐富，多樣性(H=4.198)和豐富度(S=10)指數(shù)最高；其次為會寧和蘭州，多樣性指數(shù)分別為4.029和3.758。品種以WL168HQ苜蓿多樣性最豐富(H=1.807)，甘農(nóng)3號苜蓿多樣性指數(shù)最低(H=1.388)。由于種子內(nèi)只有1株菌，所以此部位未列入多樣性計算中。田間土壤多樣性(H=1.882)和豐富度(S=9)指數(shù)最高，多樣性最豐富；其次為根表皮和根中柱，多樣性指數(shù)均為1.831；花和莖內(nèi)細(xì)菌多樣性最低(H=0.693)。紫花苜蓿非內(nèi)生細(xì)菌種的多樣性(H=1.997)比內(nèi)生細(xì)菌(H=1.885)更豐富。種內(nèi)16S rRNA PCR-RFLP類型多樣性而言，R.radiobacter菌株比E.meliloti菌株多樣性更豐富，前者多樣性(H=2.191)，豐富度(S=12)和均勻度(E=5.444)指數(shù)明顯大于后者。

2.6 根瘤菌結(jié)瘤基因和固氮基因序列分析

對55株根瘤菌株進(jìn)行nodC和nifH基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，僅有30株內(nèi)生E.meliloti菌株能夠擴(kuò)增nodC和nifH基因并進(jìn)行測序，所有R.radiobacter、R.rosettiformans(WTT6)、P.catacumbae(LL3和QP2)以及E.meliloti菌株G3T2和LL1未擴(kuò)增到nodC和nifH基因。在nodC基因序列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中(圖2a)，30株E.meliloti菌株聚在一個分支，其nodC基因序列100%相似。與nodC基因系統(tǒng)發(fā)育樹相比，菌株在nifH基因序列拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中分散在不同的分支。除菌株G9L5、G3L6、G3L11、LL11、G9L8、G3L2、G3L7和G3L5沒有與參比菌株聚群外，其余菌株的nifH基因序列分別與E.melilotiSMX23-1(QL5、G9L4、QL2、LL10)、CCBAU 75245(G9L7)、SMX12-1(G3L10、LL5、LL8)、M2MS01(G9L3)、SMX10-4(G9L6)、KH21(LL6)、CCBAU 65135(G3L13)、CCBAU 83493(G3L3、LP3、G3L8、G3L9)、RP254(LL2、G3L12)、CCBAU 05047(WLG1)和CCBAU 15508(G3L4、QL4、WLP2)相似性最近(大于97%)(圖2b)。E.meliloti菌株nifH基因多樣性高于nodC基因。

圖2 根瘤菌株nodC基因和nifH基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on sequences of nodC (a) and nifH (b) genes of rhizobial isolates

2.7 根瘤菌株促生能力

溶磷和分泌生長素IAA能力測定表明，部分菌株(18/38)具有2種促生能力(表5)。內(nèi)生和非內(nèi)生根瘤菌分泌生長素能力較強(qiáng)，27/38的菌株能產(chǎn)生IAA。5株E.meliloti菌(G3L3、G3T2、G9L8、LL2、WLP2)和7株R.radiobacter菌(G3G2、G3T1、G9TT4、G9TT5、LP4、LT3、WTT1)分泌IAA能力最強(qiáng)，5株E.meliloti菌(G3L5、G9L6、LL5、LL6和LL10)分泌IAA能力中等，10株E.meliloti菌(G3L4、G3L6、G3L8、G3L10、G3L12、G9L3、G9L4、LL11、QL4、QL5)分泌IAA能力低。

溶磷能力是根瘤菌株第2普遍的促生屬性(24/38)，其中22/24和13/24的菌株分別具有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力。菌株LL11和WLL3具有最強(qiáng)和最弱的溶解有機(jī)磷能力，溶磷圈D/d分別為4.01和1.01。這2株菌以及菌株G3L11、G9L5、G9TT5、LL1、LL2、LL6、LP4、LT3和WLG1僅能溶解有機(jī)磷，沒有溶解無機(jī)磷的能力。在具有無機(jī)磷溶解能力的菌株中，除菌株QL2和WTT1不能溶解有機(jī)磷外，其余所有菌株既能溶解有機(jī)磷又能溶解無機(jī)磷。其中QL2溶解無機(jī)磷能力最強(qiáng)，溶磷圈D/d值(1.91)顯著大于其余所有菌株。

表4 菌株遺傳多樣性Table 4 Genetic diversity of bacterial strains

表5 細(xì)菌溶磷和分泌IAA能力Table 5 Phosphate solubilization and IAA production capacity of different strains

注：D表示溶磷圈直徑，d表示菌落直徑；同列不同小寫字母表示菌株處理間差異顯著水平(P<0.05)；N代表菌株沒有溶磷能力；-沒有分泌IAA能力；+ 分泌IAA能力低，++ 分泌IAA能力中等，+++ 分泌IAA能力強(qiáng)

3 討論

3.1 不同來源紫花苜蓿內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性

以甘肅省3個栽培區(qū)域5個紫花苜蓿品種為寄主植物，旨在揭示紫花苜蓿內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌的遺傳多樣性。細(xì)菌種群多樣性受到土壤類型和植物基因型的影響[33]。從土壤類型分析，武威和會寧地區(qū)的菌株遺傳多樣性最豐富，蘭州地區(qū)菌株遺傳多樣性最低；從植物基因型分析，生長于蘭州地區(qū)的WL168HQ苜蓿菌株遺傳多樣性最豐富，生長于武威地區(qū)的甘農(nóng)3號苜蓿菌株多樣性指數(shù)最低。說明土壤類型和植物基因型對細(xì)菌種群多樣性的影響并不是一致的。

從部位組織分析，根瘤中菌株最多(39%)，其次為田間土壤(18%)、根表皮(17%)和根中柱(9%)，根際土壤(11%)中菌株數(shù)量幾乎是根瘤的1/4。有研究報道根瘤、根表皮和根中柱以及地上組織內(nèi)生菌株種群多樣性豐富[19]，并且相比土壤和根瘤，植物根系表面尤其是表皮和中柱的細(xì)菌在種和種內(nèi)水平上多樣性要更豐富[34]。而研究田間土壤細(xì)菌遺傳多樣性最豐富，根際土壤的細(xì)菌多樣性也高于根瘤、花和莖；內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性明顯低于非內(nèi)生細(xì)菌，說明植物組織微環(huán)境對菌株在各種生態(tài)位中存在的影響小于土壤環(huán)境[35]。來自花和莖的菌株數(shù)量和多樣性指數(shù)相同，共占總菌株的4%，來自種子的菌株最少(1%)。雖然植物地上組織尤其是葉片包含復(fù)雜并高度多樣化的細(xì)菌種群[36]，但是此次研究沒有從植物葉片中分離到內(nèi)生細(xì)菌。這可能與非生物和生物環(huán)境因子[7]、不同植物組織中微環(huán)境的差異[34]以及試驗(yàn)地樣本采集和室內(nèi)細(xì)菌分離之間的較長時間延誤等因素有關(guān)。

3.2 α-變形菌綱是紫花苜蓿內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌的主要組成

研究的所有菌株分別屬于α-變形菌綱(Alphaproteobacteria)的2個目3個科4個屬5個種、芽孢桿菌綱的1個目3個科4個屬4個種、Γ-變形菌綱的2個目3個科6個屬7個種和β-變形菌綱的1個目1個科1個屬1個種。其中α-變形菌綱在根瘤中占優(yōu)勢(占總菌株的33%)，在根際土壤、根表皮、田間土壤、根中柱、莖和種子內(nèi)也有發(fā)現(xiàn)(20%)。芽孢桿菌綱(Bacilli)在根表皮特別豐富，同時在根瘤、田間土壤、花、根際土壤、中柱中也有分布(24%)。Γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)存在于根際土壤、根表皮、根瘤、田間土壤、莖、中柱和花(18%)。β-變形菌綱(Betaproteobacteria)僅在中柱中發(fā)現(xiàn)，但是也不能排除其生態(tài)位中少量存在的可能性(1%)。定殖于紫花苜蓿各部位組織的內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌種群中α-變形菌綱占優(yōu)勢，且細(xì)菌種群在科、屬、種水平上有鮮明的特征[37]。同時細(xì)菌種群多樣性與部位組織沒有直接關(guān)聯(lián)，說明細(xì)菌基因組的結(jié)構(gòu)和功能也會造成本地細(xì)菌種群內(nèi)部多樣化[38]。

3.3 Ensifer meliloti和Rhizobium radiobacter是甘肅省紫花苜蓿內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌的優(yōu)勢種

除Phyllobacteriaceae和Sphingomonadaceae以外，α-變形菌綱中同一個種的根瘤菌株遺傳多樣性豐富。其中豐度最大的種為E.meliloti(32株)，數(shù)量占所有菌株的31%。就16S rRNA RFLP酶切類型而言，E.meliloti在根瘤中高度多樣化，在根表皮、根中柱和田間土壤內(nèi)多樣性較差。對E.meliloti非內(nèi)生和內(nèi)生[19，39]根瘤菌種群結(jié)構(gòu)的研究已有報道。試驗(yàn)中E.meliloti菌株主要分布在地下(根際土壤、根瘤、根表皮和根中柱)而不是地上(花、莖、葉和種子)組織，并且種內(nèi)16S rRNA RFLP類型多樣性比R.radiobacter低，說明E.meliloti在各微環(huán)境內(nèi)(土壤、根瘤、根表皮、根中柱和其他地上組織)的定殖互作相對比較簡單，遺傳物質(zhì)的隨機(jī)漂移對種群結(jié)構(gòu)的影響較小[19]。

R.radiobacter是此次研究α-變形菌綱中第2豐富的種(20株)，數(shù)量占總菌株的19%，在除葉以外的所有部位和組織均有分布。R.radiobacter種內(nèi)16S rRNA RFLP類型多樣性最豐富，共有12種RFLP類型分布在根瘤(3種)、根中柱(3種)、田間土壤(3種)、根表皮(2種)、根際土壤(2種)、莖(1種)和種子(1種)。R.radiobacter在紫花苜蓿各部位組織的廣泛分布和多樣化說明這種微生物似乎能很好的適應(yīng)甘肅省生境。

3.4 內(nèi)生和非內(nèi)生根瘤菌E.meliloti共生基因多樣化程度不同

55株內(nèi)生和非內(nèi)生根瘤菌中僅有30株E.meliloti內(nèi)生菌能夠擴(kuò)增到nodC和nifH基因，菌株間基因序列相似性達(dá)到97%～100%，說明nodC和nifH基因均是從單一祖先水平轉(zhuǎn)移而來。研究表明E.meliloti所屬α-根瘤菌的共生基因是與攜帶這類基因的共生質(zhì)粒操縱子共同進(jìn)化的[40]，因此E.meliloti種內(nèi)共生基因的水平轉(zhuǎn)移可能是菌株共生能力傳播的重要機(jī)制。5個苜蓿品種的內(nèi)生E.meliloti根瘤菌在nodC基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹中形成了一個明顯分離的集群，在nifH基因系統(tǒng)發(fā)育拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中與不同的參比菌株聚群，說明E.meliloti種內(nèi)nifH基因多樣性高于nodC基因，nifH基因更適合用于根瘤菌株共生特性的遺傳基礎(chǔ)研究[41]。

Estrella[40]和Aserse[13]等的報道，由于菌株間共生基因差異較大，所以即使應(yīng)用了各種不同的引物組合，也不能從Rhizobium屬、Mesorhizobiumsp.ERR6和Rhizobiumsp.IAR30根瘤菌中擴(kuò)增到nodC和nifH基因。試驗(yàn)R.rosettiformans(WTT6)、P.catacumbae(LL3和QP2)以及E.meliloti菌株G3T2和LL1未擴(kuò)增到共生基因，原因可能是這些菌株與其他根瘤菌株在結(jié)瘤基因和固氮基因方面存在差異。早期的分類體系將R.radiobacter歸于Agrobacterium屬，因此R.radiobacter菌株不能結(jié)瘤固氮，不能擴(kuò)增到nodC和nifH基因，與此次研究結(jié)果一致。

3.5 內(nèi)生和非內(nèi)生根瘤菌E.meliloti和R.radiobacter促生能力有差異

植物生長激素吲哚乙酸(IAA)，能夠促進(jìn)細(xì)胞伸長，有效增加植物根系長度[42]。磷元素能夠促進(jìn)作物根系生長，并參與光合作用，是植物不可缺少的營養(yǎng)元素[13]。研究內(nèi)生和非內(nèi)生根瘤菌株具有分泌IAA、溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力，與Li等[43]的研究結(jié)果一致。E.meliloti菌株分泌IAA能力最普遍，R.radiobacter菌株次之。內(nèi)生根瘤菌株中21/45的菌株能夠分泌IAA，分泌能力中等或較低(尤其是根瘤中菌株)；非內(nèi)生根瘤菌株中5/10的菌株能分泌IAA，且能力較強(qiáng)。IAA能夠促進(jìn)植物修復(fù)，使得細(xì)菌容易通過植物防御機(jī)制[13]，這也是內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌能夠普遍分泌IAA的原因。

在不同根瘤菌種內(nèi)，R.radiobacter菌株溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷能力最強(qiáng)，其次為E.meliloti菌株。溶磷能力以非內(nèi)生根瘤菌株溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷能力比內(nèi)生根瘤菌株更普遍。研究表明存在本土豆科植物的區(qū)域含有生理特征差異明顯的根瘤菌種群[44-45]，這可能是此次試驗(yàn)R.radiobacter和E.meliloti菌株分泌IAA和溶磷能力不同的原因。Silva等[46]報道內(nèi)共生環(huán)境與土壤的多樣化是維持代謝能力巨大差異的一個主要原因。試驗(yàn)內(nèi)生和非內(nèi)生根瘤菌株促生能力分析說明遺傳多樣性豐富的非內(nèi)生根瘤菌株分泌IAA能力更強(qiáng)，溶解有機(jī)磷、無機(jī)磷能力更普遍，這與以上研究結(jié)果一致。

4 結(jié)論

分離自紫花苜蓿不同栽培區(qū)域、品種、部位和組織的內(nèi)生和非內(nèi)生細(xì)菌種群遺傳多樣性豐富，其中以E.meliloti和R.radiobacter為代表的α-變形菌綱占優(yōu)勢。與內(nèi)生細(xì)菌相比，非內(nèi)生細(xì)菌遺傳多樣性較豐富，固氮和結(jié)瘤基因變異程度高，促生能力強(qiáng)。