楊 梅 劉永張

(昆明動物園，昆明，650021)

野生動物成功繁殖是其適應(yīng)環(huán)境的具體表現(xiàn)，也是動物維持其種群的重要策略。動物園人工圈養(yǎng)條件下野生動物的合理繁殖、種群建立及可持續(xù)發(fā)展，不僅是行業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，更是對就地保護(hù)的貢獻(xiàn)。隨著中國動物園全行業(yè)管理理念、飼養(yǎng)技術(shù)、設(shè)施設(shè)備和人才隊(duì)伍的不斷發(fā)展，基于生殖內(nèi)分泌學(xué)基礎(chǔ)開展的人工圈養(yǎng)下野生動物的繁殖監(jiān)測得到長足發(fā)展，獲得了非常寶貴的初始數(shù)據(jù)，為人工圈養(yǎng)物種更加科學(xué)規(guī)范管理打下了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。同時，目前仍不屬于常規(guī)操作的生殖激素檢測分析工作，在日常飼養(yǎng)管理中也凸現(xiàn)出一些現(xiàn)實(shí)困難和問題，如何結(jié)合現(xiàn)階段中國動物園行業(yè)發(fā)展不平衡的現(xiàn)狀，考慮圈養(yǎng)野生動物的成本與效益，對激素分析監(jiān)測實(shí)踐中細(xì)節(jié)工作進(jìn)行分析，探討在日常飼養(yǎng)管理中推廣應(yīng)用的可行性，尋求更有效的操作方法與策略，讓野生動物的繁殖監(jiān)測更加科學(xué)化、客觀化，可作為傳統(tǒng)動物園向現(xiàn)代動物園轉(zhuǎn)變、單個動物園管理向動物園行業(yè)管理轉(zhuǎn)變過程中的示范載體之一。

1 野生動物生殖激素檢測與繁殖監(jiān)測的相關(guān)性

引起動物繁殖行為的最直接內(nèi)分泌因子是生殖腺分泌的性激素。由兩性動物體內(nèi)睪丸和卵巢分泌的性腺激素主要功能可歸納為：促進(jìn)動物第二性征的發(fā)育并維持；促進(jìn)動物的性行為和發(fā)情表現(xiàn)；促進(jìn)生殖器官的周期性變化[1]。隨著動物的生長，性激素通過長期、持續(xù)的調(diào)節(jié)過程，形成動物的生殖生理規(guī)律。實(shí)踐中主要監(jiān)測分析的雌性激素有雌二醇(estradiol，E2)、雌三醇(estriol，E3)和雌酮(estrone，E1)，對動物的繁殖周期有調(diào)節(jié)作用，能夠控制繁殖周期，啟動雌性動物的繁殖行為。分析監(jiān)測孕激素中的孕酮(progesteron，P)對于準(zhǔn)確判定雌性動物妊娠分娩具有重要作用。雄性激素監(jiān)測中最重要的是由睪丸分泌的睪酮(testosterone，T)，對雄性性行為和性欲表現(xiàn)起促進(jìn)作用。按化學(xué)性質(zhì)分類，雌二醇(E2)、雌三醇(E3)、雌酮(E1)、孕酮(P)和睪酮(T)都屬于類固醇(甾體)激素(steroid hormone)類[1]。促黃體生成素(luteinizing hormone，LH)的主要靶細(xì)胞是睪丸，其主要功能是促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞的增生，促進(jìn)其合成和分泌雄性激素，主要是睪酮(T)。所以，對促黃體生成素(LH)含量變化進(jìn)行監(jiān)測，也可起到間接監(jiān)測睪酮(T)水平變化、監(jiān)測繁殖狀態(tài)的作用。

由于技術(shù)的進(jìn)步和分析手段的不斷提高，通過對動物體內(nèi)性腺激素水平變化的監(jiān)測，判定繁殖狀態(tài)、發(fā)情周期、妊娠產(chǎn)仔等，進(jìn)一步開展人工授精、體外受精和胚胎移植，提高動物生產(chǎn)力，已成為畜牧業(yè)的重要手段。近年來，隨著對野生動物生殖生理研究的不斷深入，野生動物生殖激素的分析、檢測，生殖激素與生殖行為的相關(guān)性等研究也受到越來越多的關(guān)注。Bonney等通過測定一對大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)連續(xù)2個繁殖季尿液中雌、雄激素含量及變化，證明了大熊貓的發(fā)情行為與內(nèi)分泌及相關(guān)激素相關(guān)聯(lián)[2]。Moore探討了應(yīng)用于雄性動物繁殖策略選擇的基于激素作用的組織激活理論[3]。Freeman等探討了圈養(yǎng)亞洲象(Elephasmaximus)和非洲象(Loxodontaafricana)在群體中的行為、支配地位及卵巢活躍度之間的相互關(guān)系，提出象的圈養(yǎng)管理需更加聚焦于社群和環(huán)境狀況的優(yōu)化，以最大限度提高繁殖潛力[4]。從這些研究中可以看到，野生動物生殖激素同樣是其繁殖活動的重要生理基礎(chǔ)之一，對野生動物(尤其是珍稀瀕危物種)繁殖活動進(jìn)行有效監(jiān)測，可促進(jìn)野生動物保護(hù)管理和資源可持續(xù)利用。

當(dāng)然，由于動物體內(nèi)的生殖激素含量屬微量，其分泌在一定程度上受生物節(jié)律、季節(jié)、應(yīng)激強(qiáng)度、持續(xù)時間等因素影響，分泌后一般很快被利用或分解，不在體內(nèi)存留，并通過尿液、膽汁或糞便排出體外。所以，采用何種有效的檢測手段、方法，同樣值得關(guān)注。李春等認(rèn)為，相對于血液、毛發(fā)、尿液等樣本，利用動物糞便研究類固醇激素具有完全無傷害性、材料收集容易等其他方法無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，糞便類固醇代謝有以下作用：(1)評估青春期的健康狀況；(2)可獲得關(guān)于季節(jié)性繁殖、發(fā)情周期和發(fā)情時間、未孕黃體期的時間長短、妊娠周期的準(zhǔn)確信息；(3)可判斷動物的排卵方式(自發(fā)排卵或誘導(dǎo)排卵)；(4)早孕診斷、預(yù)測產(chǎn)期；(5)確定生殖活動不活躍和過渡活躍的原因；(6)以評估動物生理壓力為工具來提高其生殖潛力，同時，評估并提高動物棲息地環(huán)境狀況，以促進(jìn)其健康[5]。因此，對野生動物糞便類固醇激素進(jìn)行監(jiān)測是一種較為理想的方法，為長期監(jiān)測動物生殖活動提供了可能性。

李春旺等[6]在探討江蘇大豐麋鹿保護(hù)區(qū)麋鹿(Elaphurusdavidianus)繁殖行為與糞樣激素水平變化關(guān)系時曾表述過：“性激素在血漿和糞樣中的濃度有很高的相關(guān)性；Lasley等[7]認(rèn)為多數(shù)動物的性激素在血液和糞樣中的相關(guān)性是較高的；張志華等[8]發(fā)現(xiàn)母狒狒(Papiosp.)血漿、糞樣雌二醇及孕酮的相關(guān)系數(shù)分別為0.92和0.82，這充分證實(shí)由糞樣提取分析性激素的可信度是相當(dāng)高的?！辈⒃趯?shí)驗(yàn)中用放射免疫分析法測定了糞樣中的睪酮(T)、孕酮(P)、總雌二醇(E2)和總雌三醇(E3)，證實(shí)了麋鹿糞樣中的性激素水平變化與繁殖行為的季節(jié)性變化密切相關(guān)[6]。

高云芳等以秦嶺一野生川金絲猴(Rhinopithecusroxellana)種群為研究對象，結(jié)合采樣個體的性行為觀察，對秦嶺不同季節(jié)野生雌性川金絲猴糞便中睪酮水平進(jìn)行了測定，以探討睪酮水平變化與邀配頻次的季節(jié)性變化，進(jìn)一步驗(yàn)證了雌性體內(nèi)睪酮水平與性行為之間的可能關(guān)系[9]。

蘭天在新疆野馬繁殖中心以普氏野馬(Equusprzewalskii)為研究對象進(jìn)行繁殖生理監(jiān)測，尋找符合普氏野馬生存環(huán)境氣候特征的糞便樣品保存方法，認(rèn)為采用乙醇常溫保存該物種糞便內(nèi)類固醇激素是一種較好的選擇，適用于目前新疆卡拉麥里自然保護(hù)區(qū)放歸野馬的繁殖監(jiān)測[10]。

鳥類由于特殊的排泄器官和排泄方式，其糞便和尿液混合在一起排出體外，近年來從鳥類糞尿混合排泄物中提取類固醇化合物進(jìn)行分析監(jiān)測的方法已應(yīng)用于對多種野生鳥類的監(jiān)測研究。Touma等認(rèn)為測定哺乳類糞便和鳥類糞尿混合排泄物中甾體激素代謝物這一方法能夠作為實(shí)驗(yàn)室、農(nóng)場、動物園、野生動物保護(hù)機(jī)構(gòu)等評估不同動物腎上腺皮質(zhì)活躍情況的有力工具[11]。Staley等通過測定金雕(Aquilachrysaetos)和游隼(Falcoperegrinus)糞尿混合排泄物中類固醇激素含量變化以監(jiān)測性腺和腎上腺狀況，并認(rèn)為這是一種對珍稀瀕危猛禽進(jìn)行監(jiān)測的有效的、有前途的工具[12]。張雁云等就通過收集和測定籠養(yǎng)黃腹角雉(Tragopancaboti)糞尿混合排泄物類固醇化合物，以監(jiān)測性激素水平變化，進(jìn)一步證明鳥體內(nèi)促性腺激素、甾體激素的水平會隨著繁殖周期中性腺的成熟和衰退而發(fā)生同步性波動；通過對糞尿樣中性激素的分析發(fā)現(xiàn)，雄性黃腹角雉的許多繁殖行為如求偶炫耀、領(lǐng)域行為、走動等的發(fā)生頻次與糞便中睪酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著相關(guān)；雄性黃腹角雉的射精量與其糞便中睪酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化相一致；表明黃腹角雉兩性個體糞樣中雌二醇和睪酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)之比存在顯著差異，因而在野外研究中，利用糞尿混合樣內(nèi)雌雄激素的比值進(jìn)行性別鑒定、了解種群結(jié)構(gòu)是可行的[13]。

2 國內(nèi)動物園相關(guān)工作進(jìn)展

中國動物園在瀕危野生動物的飼養(yǎng)、繁殖方面開展了大量的研究，成功繁殖了中國鶴科(Gruidae)、鸛科(Ciconiidae)、洞角科(Bovidae)、鹿科(Cervidae)、馬屬(Equus)、靈長類(Primates)動物等，許多中國特有動物已經(jīng)在中國動物園系統(tǒng)形成了可繁殖群體，如華南虎(Pantheratigrisamoyensis)[14-15]；一些極度瀕危的動物，如大熊貓，全國動物園針對其繁育開展了技術(shù)協(xié)作；成功繁殖了很多國外引進(jìn)動物，如斑馬(Equusburchelli)、長頸鹿(Giraffacamelopardalis)等[16]。事實(shí)證明，中國動物園行業(yè)在不斷推進(jìn)圈養(yǎng)物種科學(xué)管理等工作中取得了顯著成績，已成為瀕危物種易地保護(hù)的重要基地。

在這一進(jìn)程中，借鑒目前野生動物保護(hù)實(shí)踐領(lǐng)域的相關(guān)研究，中國動物園系統(tǒng)也開展了人工圈養(yǎng)條件下不同種野生動物的生殖生理研究，其中發(fā)展最為成熟、全面的是隨著人工種群成功建立和野外保護(hù)深入發(fā)展的大熊貓。在過去30年中，通過非干擾性內(nèi)分泌檢測技術(shù)的逐漸運(yùn)用，對大熊貓獨(dú)特的繁殖特點(diǎn)已有了較為準(zhǔn)確地掌握。隨著研究的不斷深入，基于內(nèi)分泌學(xué)基礎(chǔ)的激素測定與分析，研究范圍已涉及了個體發(fā)情期生殖內(nèi)分泌變化規(guī)律研究[17-25]、應(yīng)激管理[26-27]、圈養(yǎng)行為成因分析[28]等。為了更進(jìn)一步掌握大數(shù)量樣本的情況，羅娌等追蹤了大熊貓30次妊娠的情況，發(fā)現(xiàn)大熊貓的整個妊娠期可以分為3個部分，且找到了每個部分孕激素變化規(guī)律[29]?？梢哉f，目前對大熊貓的保護(hù)管理已建立起了能夠比對的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，為其日常管理、保護(hù)決策提供了準(zhǔn)確依據(jù)。據(jù)2017年7月中國林業(yè)網(wǎng)報道，中國大熊貓保護(hù)研究中心在大熊貓雌激素檢測方面取得了長足進(jìn)步，繁殖生理研究室通過對酶聯(lián)免疫法改變實(shí)驗(yàn)步驟，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法，研究探索縮短檢測時間的方法，把原來一般需耗時120～150 min的檢測時間縮短到了40～50 min，將對提升大熊貓發(fā)情監(jiān)測的時效和指導(dǎo)適時配種起到十分積極的作用。

相比大熊貓，目前國內(nèi)動物園對其他野生動物生殖激素的分析監(jiān)測研究，基本都是針對單一物種、短期狀態(tài)、無連續(xù)性的各家動物園自行開展、零星報到，深入度不夠，尚未形成系統(tǒng)工作。綜合相關(guān)文獻(xiàn)報道，國內(nèi)外對人工圈養(yǎng)條件下野生動物生殖激素進(jìn)行過分析監(jiān)測的動物大致有：舊大陸猴、貓科(Felidae)、麋鹿、小熊貓(Ailurusfulgens)、狒狒、倭黑猩猩(Panpaniscus)、白面僧面猴(Pitheciapithecia)、北豚尾猴(Macacaleonina)、棉頂絨猴(Saguinusoedipus)、食蟹猴(Macacafascicularis)、加拿大盤羊(Oviscanadensis)、麝牛(Ovibosmoschatus)、北美野牛(Bisonbison)、云豹(Neofelisnebulosa)、獵豹(Acinonyxjubatus)等。據(jù)不完全的文獻(xiàn)資料，通過對國內(nèi)人工圈養(yǎng)條件下小熊貓[30-33]、東北虎(Pantheratigrisaltaica)[14-15，34]、華南虎[35-36]、亞洲象[37]、黑熊(Ursusthibetanus)[38]、狼(Canislupus)[39]、丹頂鶴(Grusjaponensis)[40]、朱鹮(Nipponianippon)[41-42]、大鴇(Otistarda)[43]等動物血清或糞、尿樣品中類固醇激素的測定分析也取得可喜進(jìn)展。

由于雌性川金絲猴經(jīng)期沒有性皮紅腫現(xiàn)象，經(jīng)血量也非常少，且腹部肥大，即使是人工圈養(yǎng)下也很難通過觀察判斷月經(jīng)周期和明顯的妊娠體態(tài)變化，因此，閻彩娥等通過測定尿液中雌二醇、孕酮相對含量變化，對動物園圈養(yǎng)的川金絲猴不同時期的生理狀態(tài)進(jìn)行了監(jiān)測，根據(jù)雌二醇在排卵前的一個明顯高峰，由兩個雌二醇高峰之間的間隔推斷出月經(jīng)周期為(28.33±1.67)d；依據(jù)雌二醇水平的變化情況與分娩日期，推測的妊娠期約為200 d(193～204 d)，存在個體差異；受試樣本動物實(shí)際產(chǎn)仔日期與預(yù)測日期基本一致[44]。任寶平等跟蹤測定了上海野生動物園一個半放養(yǎng)川金絲猴群3個成年雄性川金絲猴的睪酮濃度，發(fā)現(xiàn)雄性睪酮水平出現(xiàn)高峰期與雌性的繁殖交配盛期基本不重疊，說明雄性大量分泌睪酮更多的是由其社會環(huán)境的變化引起的，提示在川金絲猴中繁殖活動的時間主要由雌性個體來調(diào)節(jié)[45]。黎繪宏等對1只雌性黑猩猩(Pantroglodytes)的月經(jīng)周期和性皮腫脹情況進(jìn)行了長達(dá)3年的觀察記錄，并測定尿液中促黃體生成素(LH)含量變化，以預(yù)測黑猩猩排卵期，為適時配種提供科學(xué)參考[46]。

從這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果中再次證明：雖然存在物種、個體、飼養(yǎng)狀況等差異，但性腺激素能夠調(diào)節(jié)野生動物的生理機(jī)能，對野生動物的生殖狀態(tài)具有指示作用；對其進(jìn)行科學(xué)監(jiān)測，對動物園日常飼養(yǎng)實(shí)踐具有非常重要的指導(dǎo)意義，將為動物園合理開展圈養(yǎng)動物的繁殖工作提供科學(xué)保障。

3 存在的問題

監(jiān)測野生動物性腺激素與生殖行為的關(guān)系，最理想的方法是結(jié)合動物的行為觀察，經(jīng)過一個長期持續(xù)的過程，連續(xù)采集一個物種若干個體同期血液樣本，測定其中的性激素含量，才能準(zhǔn)確描述出一個客觀變化規(guī)律。而且由于野生動物種間差異很大，因此最終為每個物種建立自己的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)才可能為準(zhǔn)確判斷其生理狀態(tài)提供科學(xué)參照。遺憾的是，由于主客觀條件限制，現(xiàn)階段中國動物園全行業(yè)在飼養(yǎng)實(shí)踐中尚不能達(dá)到這一理想狀態(tài)，仍存在一些實(shí)際困難和問題。

3.1 樣本的取得

直接采集動物血液測定激素水平，具有簡便、快捷、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，在畜牧業(yè)、寵物業(yè)、實(shí)驗(yàn)動物和人類的疾病監(jiān)測中是應(yīng)用最為廣泛、高效、傳統(tǒng)的方法。但對于在動物園中呈現(xiàn)擬自然狀態(tài)的野生動物而言，應(yīng)激水平一般較高，在日常飼養(yǎng)管理中如要經(jīng)常性地捕捉、保定并靜脈穿刺獲取血液組織，本身就會導(dǎo)致其生理指標(biāo)的異常，在實(shí)際操作中存在很大的難度和隱患。

首先，采集血液樣本的過程本身就是一個強(qiáng)有力的應(yīng)激源，會導(dǎo)致動物機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的應(yīng)激反應(yīng)。其次，配合采血而使用的一切物理保定措施，對動物來說都是一個激烈的刺激。第三，麻醉劑會抑制動物神經(jīng)功能和影響垂體的分泌，進(jìn)而影響激素分泌，經(jīng)常性地對動物實(shí)施麻醉沒有現(xiàn)實(shí)性和可操作性。第四，經(jīng)常性地保定、采血會極大地干擾動物的正常狀態(tài)，造成生理和心理的損傷。

目前，采集野生動物的尿液和糞便樣品測定性激素這種非損傷取樣法，在圈養(yǎng)野生動物的研究中應(yīng)用較多，優(yōu)點(diǎn)是對動物機(jī)體無損傷，不會對野生動物的正常狀態(tài)造成較大干擾，且可以在一段時間內(nèi)有規(guī)律的收集，是研究激素水平變化最理想的樣品選擇。但是，群居動物特定個體尿液、糞便的準(zhǔn)確識別，動物排泄的隨機(jī)性，圈養(yǎng)籠舍地面環(huán)境的限制，甚至不同地域飼養(yǎng)方式、飼料品種差異，都會對樣本造成干擾，進(jìn)而干擾測定結(jié)果，是需要注意的因素。隨著動物園展示方式的不斷改變，集群飼養(yǎng)、甚至是混群飼養(yǎng)會越來越多地出現(xiàn)在城市動物園中，在進(jìn)行目標(biāo)動物糞尿樣品采集監(jiān)測過程中，由飼養(yǎng)員根據(jù)日常特征區(qū)分、利用高清監(jiān)控設(shè)備辨識目標(biāo)個體，提前合理分隔監(jiān)測小群、選擇適當(dāng)籠舍，確定穩(wěn)定的日糧組成等，均應(yīng)納入到激素監(jiān)測方案中，并不斷完善。

3.2 激素測定的操作成本

常用的激素測定方法主要包括生物學(xué)方法、化學(xué)方法和免疫測定方法。其中，已經(jīng)用于檢測糞樣中性激素含量的免疫學(xué)方法有放射性免疫檢測法和酶聯(lián)免疫檢測法。由于放射性免疫檢測靈敏度高，方法成熟，因此測量結(jié)果可信度高，是目前應(yīng)用最廣泛的性激素測定方法。但在應(yīng)用這一方法時，會產(chǎn)生不同程度的輻射環(huán)境影響，因此，對實(shí)驗(yàn)室防護(hù)條件要求較高，不宜普及使用。酶聯(lián)免疫法雖然靈敏度略遜放射性免疫測定法，但是簡單、安全，易于普及，且測量結(jié)果與放免結(jié)果有較強(qiáng)的相關(guān)性[47]。

為達(dá)到盡量簡便高效、切實(shí)可行的目，很多研究人員探索在基礎(chǔ)分析方法上進(jìn)行改進(jìn)，但并沒有一個固定的模式。對尿液和糞便中類固醇激素的提取方法，1999年Matsumuro等采用改進(jìn)的兩步萃取法[48]，李春等對李春旺的方法進(jìn)行改進(jìn)，只使用甲醇和石油醚兩種有機(jī)溶劑提取小熊貓糞便中的類固醇激素，避免了致癌物質(zhì)二氯甲烷的使用[5]。鄧濤等專門總結(jié)了免疫分析技術(shù)在大熊貓繁殖研究中的應(yīng)用[49]。張肖等分析總結(jié)了動物糞便類固醇激素檢測過程中可能影響檢測準(zhǔn)確性的因素，包括樣品的新鮮程度、樣品量和保存方法；激素代謝的日節(jié)律和季節(jié)性變化；動物的年齡、性別和繁殖狀況等[50]。

但是，應(yīng)該看到，盡管研究人員在不斷探索更加安全、快捷的方法，對激素含量的檢測分析基礎(chǔ)還是需要建立在一定的專業(yè)實(shí)驗(yàn)室條件、一定的分析方法和專門人員的技術(shù)要求上的，所需資金投入和維護(hù)對目前大多數(shù)中國動物園來說并不現(xiàn)實(shí)，所以除少數(shù)幾家單位建立有符合條件的實(shí)驗(yàn)室，能夠獨(dú)立開展分析監(jiān)測工作外，其他國內(nèi)動物園現(xiàn)階段已開展的激素分析監(jiān)測絕大多數(shù)都是基于與具備條件的相關(guān)機(jī)構(gòu)的合作，或樣品直接送到專業(yè)激素含量測定第三方機(jī)構(gòu)進(jìn)行測定。因而，一定程度上加大了操作成本，使之不能成為經(jīng)常性的日常工作。

3.3 糞尿樣本的保存時效

受到樣品采集時間、分析條件等限制，采集的新鮮動物尿液或糞便樣品一般都需要保存一段時間后才能送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行集中分析。野生動物新鮮糞便的保存時效因物種和保存條件而異，掌握目標(biāo)物種的新鮮糞便內(nèi)激素的保存時效是應(yīng)用糞尿樣類固醇激素分析方法的前提[51-53]。

迄今為止，國內(nèi)外研究者采用尿液樣本測定了大熊貓睪酮、雌二醇、孕酮、皮質(zhì)醇等類固醇激素，成功探查了圈養(yǎng)大熊貓的繁殖生理狀態(tài)，對尿液樣本的采集和保存，不同研究者使用不同的方法[24]。畢溫磊等評估了樣品分析量和保存時間對野生大熊貓糞便樣品類固醇激素結(jié)果的影響，認(rèn)為在實(shí)際應(yīng)用中，對于非新鮮的大熊貓糞便樣品應(yīng)根據(jù)不同檢測目的在樣品保存的有效期內(nèi)進(jìn)行類固醇激素的準(zhǔn)確檢測[54]。

不同研究者對不同動物物種糞樣內(nèi)類固醇激素時效的認(rèn)定存在一定的差異。郎冬梅等對圈養(yǎng)林麝(Moschusberezovskii)糞便樣品3種保存條件下(不處理、90%甲醇和0.9%抗生素)類固醇激素含量變化做了研究，認(rèn)為在不能保證冷凍條件的情況下，用90%的甲醇保存對于研究林麝糞便類固醇激素是一種較好的保存方法[55]。陳浩春等利用2只成年雄性和4只成年雌性的尿液樣品共21份，確定川金絲猴尿液類固醇的保存時效和保存方法，結(jié)果表明：4 ℃時，雄性川金絲猴尿液睪酮、雌性尿液睪酮、孕酮的保存時效為7 d左右；雌性尿液雌二醇的保存時效在3 d以內(nèi)。-20 ℃時，雄性川金絲猴尿液中睪酮的含量在60 d內(nèi)保持穩(wěn)定；雌性尿液中睪酮、孕酮和雌二醇的含量在60 d、45 d、60 d內(nèi)保持穩(wěn)定。認(rèn)為，-20 ℃保存川金絲猴尿液樣品是一種有效、可靠的方法[56]。蘭天以普氏野馬為研究對象，采集5雄5雌共10匹普氏野馬糞樣，經(jīng)乙醇浸泡和烘箱干燥法處理后，分別放置0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d、20 d、25 d 8個保存時間梯度，采用酶聯(lián)免疫測定法，分別測定了不同性別、不同保存方法處理的糞便在各個時間梯度的激素含量[10]。林若蘭等在應(yīng)用Cat ELIAS Kit檢測華南虎糞樣雌二醇、孕酮、卵泡刺激素和黃體生成素時證明具有很好的穩(wěn)定性，同時試驗(yàn)得到糞樣在常溫條件下短時間(9 d)保存不影響檢測結(jié)果[36]。

崔媛媛等通過實(shí)驗(yàn)比較各種冷凍法、有機(jī)溶劑法和干燥法3類方法的優(yōu)劣，認(rèn)為各種保存野生動物糞樣的方法均存在利弊，需謹(jǐn)慎選擇才能達(dá)到試驗(yàn)的要求[57]。故而，樣本保存方法、保存條件的差異，保存時間的長短都會影響到分析監(jiān)測結(jié)果，找到一個較適合各家動物園自身?xiàng)l件的保存方法，需要每個實(shí)驗(yàn)監(jiān)測單位多方摸索。

4 可行性對策

4.1 在日常管理中植入科學(xué)意識和理念

現(xiàn)代動物園管理是以專業(yè)知識和技術(shù)為基礎(chǔ)，從科學(xué)的角度理解、分析和解決飼養(yǎng)實(shí)踐中的問題。盡管中國動物園行業(yè)目前仍處于總體發(fā)展不平衡、技術(shù)水平相對落后的階段，但是全面推行科學(xué)管理是大勢所趨，飼養(yǎng)實(shí)踐過程必然要從僅依靠日常經(jīng)驗(yàn)發(fā)展到經(jīng)驗(yàn)與科學(xué)分析的緊密結(jié)合，對野生動物圈養(yǎng)中的各種問題勢必要達(dá)到“知其然，知其所以然”，使其科學(xué)化、專業(yè)化、精細(xì)化。

對動物園中大多數(shù)動物的繁殖生物學(xué)研究，不僅僅要深入開展行為學(xué)觀察，更要摒棄“條件限制、無法進(jìn)行”等思想，將科學(xué)意識和理念融入管理各環(huán)節(jié)，理解野生動物實(shí)驗(yàn)樣本的得來不易和獨(dú)特性，珍惜日常管理中每一次操作機(jī)會，適時取樣、留存樣本，創(chuàng)造條件獲得監(jiān)測數(shù)據(jù)。

4.2 充分發(fā)揮行業(yè)互聯(lián)互通作用

充分發(fā)揮行業(yè)協(xié)會的聯(lián)動作用，以《全國動物園發(fā)展綱要》中提出的“全面推行科學(xué)的物種種群管理”為契機(jī)，積極呼吁各級部門對動物園科技投入的支持；從行業(yè)協(xié)會層面加強(qiáng)橫向聯(lián)系機(jī)制的建立，推進(jìn)國際交流與合作，完善技術(shù)培訓(xùn)和人才隊(duì)伍的培養(yǎng)；調(diào)動和發(fā)揮大型動物園的示范引領(lǐng)作用。

借助目前正在大力推進(jìn)的瀕危物種種群管理、譜系管理和以地理區(qū)域劃分的協(xié)作片區(qū)模式，結(jié)合物種種群管理分級名錄，選擇優(yōu)先或已具備條件的監(jiān)測物種，以點(diǎn)帶面，讓有條件開展生殖監(jiān)測工作的動物園或相關(guān)機(jī)構(gòu)，與相鄰片區(qū)動物園、飼養(yǎng)機(jī)構(gòu)結(jié)對，從技術(shù)力量、業(yè)務(wù)指導(dǎo)乃至具體測定等工作中互聯(lián)互通。

堅(jiān)持實(shí)施和日積月累，必然成為中國動物園全行業(yè)科學(xué)管理能力和水平的又一提升，以促進(jìn)傳統(tǒng)動物園轉(zhuǎn)型發(fā)展。

4.3 進(jìn)一步發(fā)揮行為訓(xùn)練輔助作用

客觀而言，從動物血樣中直接測定激素水平是最理想的分析監(jiān)測手段。基于野生動物福利保障的正向行為訓(xùn)練可以有效降低動物應(yīng)激水平，確保操作人員和動物的安全，為動物疾病診斷和醫(yī)療保健提供便利。通過有效的健康治療行為訓(xùn)練，很多大熊貓個體已經(jīng)可以達(dá)到在非麻醉?xiàng)l件下，配合飼養(yǎng)人員和獸醫(yī)進(jìn)行相關(guān)檢查，包括靜脈采血[58-61]。

現(xiàn)階段國內(nèi)動物園中對圈養(yǎng)條件下的其他野生動物基于醫(yī)療保健和福利提升的行為訓(xùn)練也正如火如荼地開展，涉及的種類有小熊貓[62]、黑猩猩[63]、紅毛猩猩(Pongopygmmaeus)[64]、東北虎[65]、非洲象[66]等。通過這些訓(xùn)練，都在一定程度上實(shí)現(xiàn)了動物處于放松狀態(tài)、無麻醉下的健康體檢、醫(yī)療注射、腕、尾部靜脈穿刺、足部護(hù)理等日常管理操作。雖然目前動物園中絕大多數(shù)飼養(yǎng)的野生動物仍然還不能達(dá)到理想的無損傷采集血樣狀態(tài)，但是在激素監(jiān)測中行為訓(xùn)練無疑是最值得堅(jiān)持的輔助手段。

4.4 創(chuàng)造條件的分析監(jiān)測方法改進(jìn)

近些年來，從野生動物糞便中提取性激素的實(shí)驗(yàn)方法都在不斷改進(jìn)、發(fā)展、變化著，沒有形成一個固定的模式，而是根據(jù)不同動物和實(shí)驗(yàn)單位的實(shí)際情況，盡量采取簡便高效、切實(shí)可行的方法。應(yīng)鼓勵有條件的動物園、相關(guān)機(jī)構(gòu)積極探索不同的測定方法，找尋適合本單位條件的分析監(jiān)測方式方法，以提高效率、節(jié)約費(fèi)用。

4.5 逐步建立和完善參考數(shù)據(jù)庫

現(xiàn)階段中國動物園行業(yè)中的科研課題具有很強(qiáng)的實(shí)踐性，基本上都來源于日常工作實(shí)踐，最重要的是解決實(shí)際問題，在信息化快速發(fā)展的今天，充分借鑒和利用有效的資源，也是管理者的能力體現(xiàn)。在借鑒他人成果的基礎(chǔ)上，形成屬于本行業(yè)自己的成果，也包含了創(chuàng)新成分。

野生動物物種間的差異很大，逐步建立和完善每個物種各個主要生殖激素的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫，建立起正常參考區(qū)間，才能使分析測定獲得的數(shù)據(jù)指標(biāo)真正具有科學(xué)價值和參考意義。

借助目前“中國動物園協(xié)會圈養(yǎng)野生動物數(shù)據(jù)庫”項(xiàng)目的工作路徑，充分發(fā)揮互聯(lián)網(wǎng)在動物園科學(xué)管理中的重要作用，以常見展出(已建立全國譜系、納入繁殖種群計(jì)劃)及珍稀種類為主要目標(biāo)，逐步建立和完善中國動物園行業(yè)生殖激素數(shù)據(jù)庫平臺，實(shí)現(xiàn)信息共享。