張媚 王富平 魏如男 陳忠敏

摘要： 分析在乙醇處理前后絲素蛋白（SF）與絲素肽（SFP）二級結(jié)構(gòu)含量變化，及對細胞生長的影響。采用醇溶法提取制備SF，由中性蛋白酶酶解得SFP，40%乙醇分別處理SF與SFP，得ET-SF、ET-SFP。將SF、SFP、ET-SF、ET-SFP分別采用過濾除菌處理后再分別在1mg/mL、0.5mg/mL濃度條件下，檢測其對人肝癌細胞（HepG2）、人宮頸癌上皮細胞（Caski）的生長影響，利用相對增值率評價其毒性，圓二色譜法檢測二級結(jié)構(gòu)含量。結(jié)果表明：乙醇處理前后SF為非濃度依賴型，對細胞生長均有促進作用且趨勢相同;乙醇處理前后SFP為濃度依賴型，對細胞均有抑制作用，當β-折疊含量增加，SFP對細胞毒性作用增加。

關鍵詞： 絲素蛋白;絲素肽;二級結(jié)構(gòu);細胞生長;細胞毒性

中圖分類號： TS102.33 ? 文獻標志碼： A ? 文章編號： 1001-7003（2019）05-0014-06 ? 引用頁碼： 051103

Abstract： The changes in secondary structure content of silk fibroin （SF） and silk fibroin peptide （SFP） before and after treatment with ethanol， and the effects of different secondary structures on cell growth were investigated. SF was extracted and prepared by alcohol solution method， and then SFP was gained by neutral protease enzymolysis. SF and SFP were treated with 40% ethanol respectively to get ET-SF and ET-SFP. After filtration sterilization of SF， SFP， ET-SF and ET-SFP respectively， their effects on the growth of human liver cancer cells （HepG2） and human cervical cancer epithelial cells （Caski） were detected at the concentration of 1 mg/ml and 0.5 mg/ml， respectively. The Relative Growth Rate （RGR） was used to evaluate the toxicity. The secondary structure content was detected by Circular Dichroism （CD）. The results showed that SF was non-concentration-dependent before and after ethanol treatment and could promote cell growth， with the same trend. SFP was concentration-dependent before and after ethanol treatment and could inhibit the cell proliferation. In a conclusion， SFP enhanced the cytotoxicity with the increases of β-sheet content.

Key words： silk fibroin; silk fibroin peptide; secondary structure; cell growth; cytotoxicity

絲素蛋白（Silk fibroin， SF）是一種從蠶絲中提取的天然高分子纖維蛋白，具有良好的生物相容性、降解性和力學性能，被廣泛應用于生物醫(yī)學領域，如新型載藥系統(tǒng)、細胞培養(yǎng)基質(zhì)、醫(yī)用生物敷料、固定化酶材料、組織工程支架[1-2]。作為組織工程支架時具有促進細胞在材料表面黏附的能力，當其在體內(nèi)生理環(huán)境下發(fā)生降解時，產(chǎn)物以游離氨基酸和低分子多肽為主，可被細胞新陳代謝所利用，促進細胞增殖生長[3-5]，即經(jīng)過降解的絲素蛋白帶上了猶如生長因子類的作用，在組織工程支架領域具備了優(yōu)異的特性。

SF是一種纖維狀蛋白，由無定形區(qū)和結(jié)晶區(qū)構(gòu)成，其結(jié)晶度一般在50%～60%，較大側(cè)基的氨基酸主要存在于無定形部分，而極性氨基酸在無定形區(qū)中的含量比在結(jié)晶區(qū)中的含量多[6]。結(jié)晶形態(tài)又可分Silk Ⅰ型和Silk Ⅱ型，Silk Ⅰ型分子鏈主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲交替堆積而成，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定;而Silk Ⅱ型主要為β-折疊片層狀結(jié)構(gòu)，且在溫度和溶劑影響下Silk Ⅰ型容易向Silk Ⅱ型轉(zhuǎn)變[7-9]。有研究發(fā)現(xiàn)將乙醇加入絲素蛋白溶液后，溶液中原有的少量β-折疊構(gòu)象將受到破壞，由于乙醇分子與水分子結(jié)合使得絲素蛋白分子之間的相互作用增強，促使鏈段重新排列形成大量的β-折疊構(gòu)象[10-12]。但是目前關于SF及絲素肽（Silk fibroin peptide，SFP）的二級結(jié)構(gòu)變化與細胞生長作用影響的相關研究并不多見，因此本文嘗試用40%乙醇處理SF，得到二級結(jié)構(gòu)含量不同的SF與SFP，再將所制得的SF和SFP與細胞進行共培養(yǎng)，探究其對細胞生長的作用。

1 實 驗

1.1 材料、試劑和儀器

繭殼（重慶市纖維織品檢驗所），酶活力20×104 U/g的中性蛋白酶（南寧龐博生物有限公司），人宮頸癌上皮細胞Caski、人肝癌細胞HepG2（上海中喬新舟生物科技有限公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），DMEM培養(yǎng)基、PRMI-1640培養(yǎng)基、HyClone（賽默飛世爾生物化學制品有限公司），氨芐青霉素、硫酸鏈霉素、MTT（北京Solarbio生物科技有限公司），SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（Beyotime，碧云天生物技術公司），超低分子量蛋白電泳試劑盒（Real-Times，中科瑞泰（北京）生物科技有限公司），所用試劑無水乙醇、二甲亞砜（DMSO）等均為分析純（市售）。

FD-1-50真空冷凍干燥機（上海比郎儀器有限公司），JY300E電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）。

1.2 絲素蛋白制備

按照文獻[13]的方法，將廢蠶繭除雜后，于04% Na2CO3溶液中沸煮兩次，每次1.5h，水浴比為1 ︰ 30，以除去絲素纖維表面的絲膠蛋白。干燥后的絲素蛋白采用鹽溶液溶解，配制CaCl2/C2H5OH/H2O（摩爾比1 ︰ 2 ︰ 8）的混合鹽溶液體系，80℃水浴30min。將鹽溶液經(jīng)過濾、濃縮和冷凍干燥得到絲素蛋白粉末，密封保存?zhèn)溆?，掃描電鏡檢測其線粒大小為20～50μm，此即為絲素蛋白（SF）。采用中性蛋白酶按照m純絲素液 ︰ m中性蛋白酶=20 ︰ 1在pH6.0～7.0條件下55℃水浴酶解1.5h，制得絲素肽（SFP）。

將SF與SFP分別用40%乙醇溶液處理2h，冷凍干燥得到二級結(jié)構(gòu)不同的絲素蛋白粉末，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 絲素蛋白相對分子質(zhì)量的測定

電泳步驟按照碧云天生物技術公司說明書進行，配置15%分離膠與5%濃縮膠，先灌入分離膠，待分離膠聚合后再灌入濃縮膠，插入梳子，待膠聚合好后拔出梳子，上樣，開始電泳。首先在80V條件下電泳1～2h，待指示buffer到達分離膠上沿時，將電壓調(diào)至120V，直至buffer到達分離膠下沿，結(jié)束電泳。電泳結(jié)束后將膠層置于考馬斯亮藍染液中染色2h，再用脫色液進行脫色，得到清晰的蛋白質(zhì)條帶。再以相同步驟按照中科瑞泰（北京）生物技術有限公司說明書對SFP進行電泳。

1.4 細胞生長性能檢測

HepG2細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)、Caski細胞用PRMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。配制質(zhì)量濃度為4mg/mL的SF溶液，分別為SF溶液、ET-SF（乙醇處理后的絲素蛋白）溶液、SFP溶液、ET-SFP（乙醇處理后的絲素肽）溶液，采用過濾除菌法（微孔濾器，220nm，Millipore，Ireland）處理，在處理后用完全培養(yǎng)基分別稀釋成質(zhì)量濃度為2、1mg/mL。用血球計數(shù)板分別將三種細胞濃度調(diào)節(jié)為3×105個/mL，以每孔100μL加入到96孔板（Corning，USA）中，過夜待細胞貼壁后每孔加入100μL制備好的經(jīng)不同處理的培養(yǎng)基（此時質(zhì)量濃度為1、0.5mg/mL），以只加完全培養(yǎng)基的孔作為空白對照組，每組實驗設置3個復孔，于37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱（FORMA3111，美國Thermo公司）中培養(yǎng)。于5d后采用MTT法檢測三種細胞的活性：每孔加入20μL MTT，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h后，棄去96孔板中的液體，每孔加入150μL DMSO，使用酶標儀（Multiskan GO，美國Thermo公司）震蕩10min，然后檢測其在490nm處的吸光值繪制細胞生長曲線，并按照下式計算相對增殖率RGR。

根據(jù)毒性級別評價國家標準GB/T16886.5—2003《醫(yī)療器械生物學評價 第5部分：體外細胞毒性試驗》，將RGR值轉(zhuǎn)換為細胞毒性分級（表1）。

1.5 乙醇處理后絲素蛋白中二級結(jié)構(gòu)含量的測定

采用圓二色光譜儀（英國APL Chiascan）檢測蛋白二級結(jié)構(gòu)，絲素蛋白質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，樣品充分溶于水后上機進行測試。儀器參數(shù)：能帶寬度1nm;響應時長1s;波長190～260nm;掃描速度500nm/min。

1.6 統(tǒng)計學處理

每組實驗重復三次，采用OriginPro2016軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SF與SFP的相對分子質(zhì)量大小分析

實驗采用SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳對SF與SFP的相對分子質(zhì)量區(qū)間進行測定。圖1（a）結(jié)果顯示，電泳得到SF泳道相對分子質(zhì)量形成了15～40kD的一個分布，而SFP泳道則不能看見明顯的相對分子質(zhì)量條帶，因此再采用低相對分子質(zhì)量蛋白電泳對SFP進行電泳測定，觀察到在相對分子質(zhì)量小于17kD有明顯的條帶形成（圖1（b））。這是由于SFP的相對分子質(zhì)量太小，因為中性蛋白酶可催化分解肽鍵，將大分子的蛋白質(zhì)降解成為小分子的多肽或氨基酸物質(zhì)[14]。此方法確認了制備出的絲素蛋白分別為相對分子質(zhì)量大小不同的SF與SFP。

2.2 乙醇處理前后SF與SFP對細胞生長的影響

SFP是酶解產(chǎn)物，呈水溶性，可溶解分散于細胞培養(yǎng)基中，由于中性蛋白酶酶切位點無特定性，SFP產(chǎn)物即屬于復雜的多肽、游離氨基酸混合物。SF溶于水后在水溶液中形成絲素蛋白膠粒[15]，SF由于粒徑較大，會黏附在細胞的表面促進細胞增殖，且增值速率隨著其與細胞貼壁面積的增加而增大;而對于粒徑較小的SFP，能被細胞攝入胞內(nèi)并對細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝產(chǎn)生一定程度的干擾，從而抑制細胞的生長[16]。

以人的宮頸癌上皮細胞細胞（Caski）與肝癌細胞（HepG2）作為體外模型，分別將SF、ET-SF、SFP、ET-SFP對細胞生長的影響進行評估。圖2顯示SF與ET-SF對Caski和HepG2的生長均有明顯的促進作用，且趨勢相同，質(zhì)量濃度對其影響較小，與理論相符?？梢奡F二級結(jié)構(gòu)的變化對細胞生長的影響不大。

而對于SFP與ET-SFP，其對Caski和HepG2的生長均存在抑制作用，如圖3所示。當SFP與ET-SFP質(zhì)量濃度較低（0.5mg/mL）時，其對細胞增殖的抑制作用隨著時間的增加顯著增強;當SFP與ET-SFP質(zhì)量濃度較高（1mg/mL）時，Caski和HepG2幾乎不生長，說明SFP與ET-SFP對細胞增殖的作用具有濃度依賴性。對比乙醇處理前后SFP對細胞的影響，以0.5mg/mL為例，發(fā)現(xiàn)處理前的SFP對細胞生長雖有抑制作用，但在第5天時仍有細胞生長，而對于處理后的ET-SFP，其對細胞的抑制作用明顯增強，且從第4天開始細胞趨于全部死亡。根據(jù)樣品毒性級別評分對照表進行細胞毒性級別評分，ET-SFP的細胞毒性等級相比SFP而言明顯增大，這說明乙醇處理使SFP的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導致其對細胞內(nèi)的物質(zhì)代謝干擾程度不同，因而導致細胞的增殖速度有明顯差別，細胞毒性增大。

實驗結(jié)果顯示，SF與SEP對人肝癌細胞HepG2的生長的影響均大于人宮頸癌細胞Caski，這可能是由于HepG2細胞的增殖生長能力強于Caski細胞[17]，代謝能力強，導致在經(jīng)過SF與SFP處理后，影響效果均較Caski大。

2.3 乙醇處理前后對SFP中二級結(jié)構(gòu)含量的影響

通過上述細胞實驗發(fā)現(xiàn)，乙醇處理前后，SF對細胞生長的影響變化不大，而SFP變化明顯，因此采用圓二色譜對SFP進行二級結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)分析。圓二色譜是一種被廣泛應用于生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能研究的測定技術，可以有效檢測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化[18]。圖4為所得圓二色譜，在190～240nm波段為遠紫外區(qū)掃描范圍，是肽鍵的吸收范圍，反映蛋白質(zhì)分子主鏈的二級結(jié)構(gòu)比例[19]。采用CONTIN程序和Yang-chen公式對其二級結(jié)構(gòu)成分進行分析。

乙醇是一種質(zhì)子型有機溶劑，且乙醇分子能與絲素蛋白的疏水部分相互結(jié)合[9]，使蛋白質(zhì)介電常數(shù)和表面水合層遭到不同程度的破壞[20]，致使蛋白質(zhì)分子相互接觸形成較大的粒子而從溶液中析出，引起蛋白變性、β化[21]。Yang等[22]認為絲素蛋白呈無規(guī)卷曲狀態(tài)的部分在水溶液中會形成一定的疏水區(qū)域，乙醇的加入將削弱疏水側(cè)鏈之間的相互作用，從而引發(fā)絲素蛋白由無規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變。表2結(jié)果顯示，乙醇處理對絲素肽的二級結(jié)構(gòu)變化影響明顯，使α-螺旋和無規(guī)卷曲向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，且β-折疊含量由48.76%升高到55.16%，并且隨之細胞毒性增強。有研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白B能夠殺死小鼠和人腫瘤細胞系的主要原因，就是由于該肽在水溶液中形成扭曲的β-折疊結(jié)構(gòu)[23]。β-折疊較多時，原先包裹在蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水基團將被暴露在蛋白表面，從而使其能夠插入到細胞膜脂質(zhì)雙層的疏水區(qū)，進而破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，最終導致細胞變形、聚集和破裂[24]。故SFP中β-折疊結(jié)構(gòu)的增加導致細胞毒性的增強。

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，對于絲素蛋白，因其相對分子質(zhì)量太大，不能進入細胞內(nèi)部，因此對其進行結(jié)構(gòu)改變對其細胞毒性影響不大;而對于相對分子質(zhì)量較小的絲素肽，其細胞毒性為濃度依賴型，且乙醇處理后其毒性變化較大，這是由于乙醇處理后，絲素肽的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，β-折疊含量顯著增加，細胞毒性增加。

本研究為絲素肽的制備工藝檢測過程提供了思路，建議在制備絲素肽時，要格外注意其條件控制，以避免二級結(jié)構(gòu)中β-折疊含量增多引起的細胞毒性增加，同時為進一步研究絲素肽對細胞作用影響奠定了實驗基礎。

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