高效液相色譜法測定蔬菜和水果中烯酰嗎啉和赤霉素的殘留

郭宏斌 王明月 張春艷 林玲 葉劍芝 楊春亮

摘? 要? 采用高效液相色譜技術(shù)，以草莓、西瓜和西紅柿為研究對象，建立了一種快速、準確測定蔬菜、水果中烯酰嗎啉與赤霉素殘留測定方法。酸性條件下（pH 2.5），樣品用乙酸乙酯提取，經(jīng)弗羅里硅土柱凈化后，使用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀進行檢測。結(jié)果表明，各組分分離良好，在0.025、0.050、0.100 mg/kg這3個添加水平，2種農(nóng)藥的回收率為81.2%～91.3%，相對標準偏差均小于6.7%;在0.025～1.00 μg/mL濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.9995;烯酰嗎啉與赤霉素的檢出限分別為為0.01、0.02 mg/kg。該方法準確、靈敏、快速，可滿足對蔬菜、水果中烯酰嗎啉與赤霉素農(nóng)藥殘留的檢測需要。

關(guān)鍵詞? 烯酰嗎啉;赤霉素;高效液相色譜;蔬菜;水果

中圖分類號? Q949.748.5? ? ? 文獻標識碼? A

Determination of Dimethomorph and Gibberellin A3 Residues in Fruits and Vegetables by Liquid Chromatography

GUO Hongbin1， WANG Mingyue2， ZHANG Chunyan3， LIN Ling1， YE Jianzhi1， YANG Chunliang1*

1. Agricultural Products Processing Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences （CATAS）， Zhanjiang， Guangdong 524001， China; 2. Analysis and Testing Center， CATAS， Haikou， Hainan 571101， China; 3. College of Tropical Crops， Yunnan Agricultural University， Puer， Yunnan 665000， China

Abstract? A simple， sensitive and reproducible high-performance liquid chromatographic method was developed for determining dimethomorph and gibberellin A3 residues in fruit and vegetable samples （strawberry， watermelon and tomatoes）. The samples were extracted with ethyl acetate under acid conditions （pH 2.5）， cleaned up by florisil solid-phase extraction cartridge， and analyzed by high-performance liquid chromatography with ultraviolet detection. There were good linear correlations between the peak area and the corresponding concentration of dimethomorph and gibberellin A3 in the range of 0.025–1.00 μg/mL and the correlation coefficient was above 0.9995. The average recovery of dimethomorph and gibberellin A3 in three levels （0.025， 0.050 and 0.100 mg/kg） was between 81.2 and 91.3. The limit of detection of the dimethomorph and gibberellin A3 was 0.01 mg/kg and 0.02 mg/kg， respectively.

Keywords? dimethomorph; gibberellin A3; HPLC; vegetable; fruit

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.12.027

烯酰嗎啉（Dimethomorph）[1]，是專一殺卵菌綱真菌殺菌劑，其作用特點是破壞細胞壁膜的形成[2-3]，對卵菌生活史的各個階段都有作用[4-6]。赤霉素（Gibberellin A3）[7]，一種植物體內(nèi)普遍存在促進植物生長發(fā)育重要的內(nèi)源激素，工業(yè)品為白色結(jié)晶粉末[8]，難溶于水、苯等，可溶于甲醇、乙醇、丙酮等[9-10]。赤霉素應(yīng)用范圍廣泛，并且價格低廉，被認為是一種發(fā)展前景廣闊的植物生長促進劑，在害蟲以及抗性農(nóng)業(yè)害蟲的防治中廣泛應(yīng)用[11-13]。

國內(nèi)外文獻報道，劉磊等[1]采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對辣椒及其栽培土壤中烯酰嗎啉和唑嘧菌胺的殘留，進行了研究，方法檢出限為0.01 mg/kg;趙民娟等[3]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜與土壤中烯酰嗎啉和氰霜唑及其代謝物的殘留量，檢出限為0.05 mg/kg，師真等[4]采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中13種氨基甲酸酯類農(nóng)藥和殺菌劑殘留，檢出限為0.001 mg/kg;張倩等[13]采用HPLC-MS/MS法測定設(shè)施甜櫻桃果實中的赤霉素含量;李偉等采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定松花粉中赤霉素的含量，都未報道方法的檢出限[14-16]。目前，這一類文獻報道，局限于采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對蔬果中的烯酰嗎啉或赤霉素的一種藥物進行分析檢測，還未見采用高效液相色譜法同時檢測水果中烯酰嗎啉和赤霉素殘留的報道。

本研究采用高效液相色譜法（HPLC）同時對水果與蔬菜中烯酰嗎啉和赤霉素農(nóng)藥殘留進行定性、定量研究，分別對水果與蔬菜中烯酰嗎啉和赤霉素的檢出限進行了研究，2種藥物在蔬果中的檢出限低于國家殘留限量的要求。建立了高效、靈敏、可靠的HPLC法同時測定水果與蔬菜中烯酰嗎啉和赤霉素農(nóng)藥殘留的快速分析方法。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料? 草莓、西瓜和西紅柿樣品，購于湛江本地農(nóng)貿(mào)市場。甲醇、甲酸、乙腈和乙酸銨（色譜純），美國Fisher Scientic公司;甲醇、乙腈、正己烷、丙酮與乙酸乙酯等均為分析純，廣州化學(xué)試劑廠;水為超純水;弗洛里矽硅土固相萃取柱，美國安捷倫公司。

烯酰嗎啉與赤霉素對照品[含量（98.0± 0.2）%]，德國DR Ehrenstorfer公司。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? Waters 2695型高效液相色譜儀，配備有紫外檢測器，美國Waters公司;UNIVERAL 32R離心機，德國Hettich公司。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品制備? 按照食品安全國家標準GB 2763-2016的要求，將草莓、西瓜和西紅柿樣品，切碎，充分混勻，放入破壁機中勻漿。勻漿好的樣品，放入聚乙烯瓶中于–16 ～ –20 ℃條件下保存。

1.2.2? 樣品提取? 稱取制備好的蔬菜、水果（草莓、西瓜和西紅柿）試樣10 g（精確到0.01 g），置于50 mL離心管中。加入5 mL水（2 mol/L鹽酸調(diào)pH至2.5），渦旋，混勻;加入15 mL酸性環(huán)境（pH 2.5）中的乙酸乙酯，渦旋，2 min;振蕩，10 min;4 ℃，8000 r/min離心，提取有機相于50 mL離心管中;再加入15 mL酸性環(huán)境（pH 2.5）中的乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，合并兩次有機相提取液于50 mL離心管中;45 ℃，旋轉(zhuǎn)、濃縮至近干。

1.2.3? 樣品凈化? 將弗洛里矽硅土固相萃取柱依次用5 mL丙酮正己烷（10∶90，V/V）、5 mL正己烷預(yù)淋洗，條件化，當溶劑液面到達柱吸附層表面時，立即倒入上述待凈化溶液，用15 mL刻度離心管接收洗脫液，用5 mL丙酮正己烷（10∶90，V/V）沖洗燒杯后淋洗弗洛里矽硅土固相萃取柱，并重復(fù)一次。將盛有淋洗液的離心管置于氮吹儀上，45 ℃水浴條件下，氮氣吹干，用超純水定容至1.0 mL，在旋渦混合器上混勻，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，供液相色譜測定。

1.2.4? 標準溶液配制? （1）烯酰嗎啉標準儲備液：準確稱取10.0 mg烯酰嗎啉標準品，甲醇溶解并定容至10.0 mL。此溶液每毫升相當于含赤霉素1.00 mg。

（2）赤霉素標準儲備液：準確稱取10.0 mg赤霉素，甲醇溶解并定容至10.0 mL。此溶液每毫升相當于含烯酰嗎啉1.00 mg。

（3）混合標準工作液：分別準確吸取相同體積烯酰嗎啉和赤霉素標準儲備液，將其稀釋成烯酰嗎啉和赤霉素含量分別為0.025、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 μg/mL的混合標準工作液。

1.2.5? 高效液相色譜檢測條件? 色譜柱為Waters C18柱（150 mm4.6 mm5 μm）;流動相為甲醇（A）水（B）0.1%乙酸溶液（C，pH 4.0），梯度洗脫比例見表1;流動相流速1.0 mL/min;色譜柱溫度35 ℃;波長252 nm;進樣量20 μL。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 樣品前處理的優(yōu)化

為了有效提取蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素，分別考察了提取溶劑、pH以及提取溫度對于蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素回收率的影響。

2.1.1? 樣品提取的優(yōu)化? 根據(jù)烯酰嗎啉與赤霉素的分子結(jié)構(gòu)以及化學(xué)性質(zhì)，為了有效提取蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素，采用1.2.2中樣品提取的過程，分別考察了正己烷、乙腈、甲醇、乙酸乙酯以及酸性環(huán)境（pH 2.5）中的乙酸乙酯等不同有機溶劑作為樣品提取溶劑時，水果與蔬菜中的烯酰嗎啉與赤霉素的凈化效果及回收率。準確稱取空白水果與蔬菜樣品10.0 g（精確至0.01 g），加適量2種農(nóng)藥標準工作液，使加標水平為0.5 mg/kg，按1.2的方法處理后進行色譜分析。每個濃度做5 份重復(fù)，以外標法計算空白水果與蔬菜樣品中農(nóng)藥殘留量，烯酰嗎啉與赤霉素在3種蔬菜與水果（草莓、西瓜和西紅柿）中的回收率實驗結(jié)果見表2、表3。

結(jié)果表明，甲醇、乙腈與正己烷作為提取溶劑時，蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素回收率較低，難以滿足殘留檢測要求;在酸性環(huán)境中，選用乙酸乙酯作為水果與蔬菜烯酰嗎啉與赤霉素的提取溶劑時，回收率高;因此，本文選擇酸性環(huán)境（pH 2.5）中的乙酸乙酯作為提取溶劑，能夠有效提取蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素，且提取出來的色素雜質(zhì)相對較少。

2.1.2? pH的優(yōu)化? 為了研究pH對提取過程的影響，采用上述相同的樣品提取方法，考察提取環(huán)境pH值為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0時，蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素的回收率，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，在酸性條件下（pH 2.5），選用乙酸乙酯作為提取溶劑時，蔬菜與水果中烯酰嗎啉與赤霉素的提取效率最高，方法滿足回收率的要求。因此，本文選擇酸性環(huán)境（pH 2.5）中的乙酸乙酯作為提取溶劑。

2.2? 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1? 紫外吸收波長的選擇? 由于烯酰嗎啉與赤霉素的分子結(jié)構(gòu)與化學(xué)性質(zhì)差異，導(dǎo)致兩種農(nóng)藥在液相色譜紫外吸收波長存在差異，為了在有效時間內(nèi)，實現(xiàn)烯酰嗎啉與赤霉素的分離，提升烯酰嗎啉與赤霉素的靈敏度，對烯酰嗎啉與赤霉素的色譜條件紫外吸收波長進行了優(yōu)化。在本研究中，考察了烯酰嗎啉與赤霉素在4種紫外吸收波長（210、250、252、254 nm）條件下，烯酰嗎啉與赤霉素的液相色譜圖像。結(jié)果表明，在紫外吸收波長252 nm處，烯酰嗎啉與赤霉素的吸光度高，雜質(zhì)干擾少，樣品分離效果好，靈敏度高，能夠滿足實驗的要求（圖2）。因此在隨后的實驗中，選擇252 nm作為蔬果中烯酰嗎啉與赤霉素的液相色譜紫外吸收波長。

2.2.2? 定容溶劑的優(yōu)化? 為了使烯酰嗎啉與赤霉素高效液相色譜檢測過程中，有效分離，同時提高2種農(nóng)藥的靈敏度以及色譜峰形，考察了0.1%乙酸水溶液、水、甲醇以及乙腈作為定容液時，烯酰嗎啉與赤霉素的分離效果。結(jié)果表明，當選用0.1%乙酸水溶液、甲醇以及乙腈作為定容液時，目標化合物烯酰嗎啉的色譜峰都能夠有效分離;但赤霉素在蔬菜和水果中的色譜峰存在拖尾現(xiàn)象，靈敏度低，不能夠滿足殘留檢測的要求。用超純水作為定容液時，可以顯著改變目標化合物赤霉素在蔬菜和水果中色譜分離的滯留行為，得到良好的分離度和滿意的峰形（圖2）。

2.2.3? 流動相的優(yōu)化? 據(jù)文獻報道，在烯酰嗎啉的色譜分離過程中，主要采用甲醇水溶液體系作為流動相，能夠?qū)崿F(xiàn)目標化合物的有效分離;但是在赤霉素的色譜分離過程中，為了使目標化合物能夠有效分離，通常采用甲醇與乙酸水體系作為流動相。在本研究中，為了使蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素在色譜分離過程中，得到更好的分離效果和更短的分析時間，本研究采用梯度洗脫法，流動相梯度和流速結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，采用表1所述的梯度洗脫法，得到了較好的分辨率和滿意的色譜峰形，因此，在隨后的分析中，采用上述的梯度洗脫法，檢測蔬菜與水果中的烯酰嗎啉與赤霉素的殘留。

2.3? 空白實驗

取蔬菜與水果（不添加烯酰嗎啉和赤霉素）各1份，稱取10.0 g，按照1.2的方法，進行樣品前處理，凈化過柱后，定容，然后用高效液相色譜儀進行檢測，所得的檢測圖譜見圖3，在烯酰嗎啉與赤霉素對照品的出峰保留時間5.819、6.582、8.511 min處未出現(xiàn)干擾峰。結(jié)果表明，蔬菜與水果樣品中不含烯酰嗎啉與赤霉素，不影響烯酰嗎啉與赤霉素的檢測。

2.4? 回收率與精密度

準確稱取空白果蔬樣品10.0 g（精確至0.01 g），加適量烯酰嗎啉與赤霉素標準工作液，使加標水平分別為0.025、0.05、0.10、1.00 mg/ kg，按1.2的方法處理后進行色譜分析。每個濃度做5份重復(fù)，以外標法計算水果樣品中農(nóng)藥殘留量?；厥章始熬芏扔嬎憬Y(jié)果見表4。在3個添加水平，烯酰嗎啉與赤霉素農(nóng)藥的回收率在81.2%～ 91.3%之間，相對標準偏差低于10.3%。典型空白蔬菜與水果樣品添加烯酰嗎啉與赤霉素的高效液相色譜圖見圖3。

2.5? 方法線性與檢出限

準確配制6個濃度梯度（0.025、0.05、0.1、

0.25、0.5、1.0 μg/mL）的2種農(nóng)藥基質(zhì)匹配標準溶液進樣，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標，以相應(yīng)的峰面積為縱坐標作出標準曲線，測得2種農(nóng)藥的回歸系數(shù)見表5，在0.025～1.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)，2種農(nóng)藥的相關(guān)系數(shù)均大于0.9995，線性關(guān)系良好。以3倍信噪比計算方法檢出限，2種農(nóng)藥的檢出限見表5（烯酰嗎啉0.01 mg/kg;赤霉素0.02 mg/kg），蔬菜與水果樣品中2種農(nóng)藥的檢出限遠低于我國無公害食品中2種農(nóng)藥所規(guī)定的最高殘留限量。

2.6? 實際樣品測定

采用本方法對來自湛江本地農(nóng)貿(mào)市場的的蔬菜與水果（草莓、西瓜、生菜、西紅柿、荔枝和龍眼）30個樣品中2種目標物進行檢測，烯酰嗎啉在2個草莓樣品和1個荔枝樣品中被檢出，檢出率為10%，檢出濃度最高為0.32 mg/kg，赤霉素均未檢出。

3? 討論

建立了高效液相色譜法測定蔬菜與水果中2種農(nóng)藥的分析方法。該方法的靈敏度、精密度和檢出限都能滿足日常檢測分析的要求，具有快速、靈敏度高的特點，適合于蔬菜與水果樣品中烯酰嗎啉與赤霉素藥物殘留的分析。運用所建立的方法對實際樣品進行了檢測，共檢測蔬菜與水果30個批次，烯酰嗎啉在2個草莓樣品和1個荔枝樣品中被檢出，檢出率為10%，檢出濃度最高為0.32 mg/kg，赤霉素均未檢出。

相比文獻報道劉磊等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法僅測定辣椒及其栽培土壤中烯酰嗎啉的含量;李偉等超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定松花粉中赤霉素的含量;本研究更加全面、詳細，采用高效液相色譜法同時測定了蔬菜與水果中烯酰嗎啉與赤霉素的藥物殘留，烯酰嗎啉與赤霉素的檢出限分別為為0.01、0.02 mg/kg。該方法線性范圍寬、檢出限低，在實際樣品的多組分測定中取得較好的效果，加標回收率在81.2%～91.3%之間，相對標準偏差均低于6.7%，表明本方法可應(yīng)用于蔬菜與水果中實際樣品中2種農(nóng)藥的高靈敏度檢測，結(jié)果準確可靠。

查閱相關(guān)文獻，烯酰嗎啉與赤霉素的分子結(jié)構(gòu)以及化學(xué)性質(zhì)的差異，導(dǎo)致蔬菜與水果中2種農(nóng)藥的提取、凈化以及色譜分析存在很大差別;本研究通過對蔬菜與水果前處理過程中提取溶劑以及pH值的優(yōu)化，采用酸性條件下乙酸乙酯（pH 2.5）提取，蔬菜與水果中2種農(nóng)藥的加標回收率在81.2%～91.3%之間，滿足了殘留檢測的要求;由于烯酰嗎啉與赤霉素分子結(jié)構(gòu)的差異，導(dǎo)致2種農(nóng)藥的最大紫外吸收波長存在差異，通過定容試劑、梯度洗脫以及紫外吸收波長的優(yōu)化，最終在有效時間內(nèi)實現(xiàn)了烯酰嗎啉與赤霉素的有效分離，改善了色譜峰形，提高了2種農(nóng)藥的靈敏度，最終建立了高效液相色譜法測定蔬菜與水果中2種農(nóng)藥的殘留方法。通過該方法的探討與研究，為以后采用高效液相色譜法分析不同分子結(jié)構(gòu)以及化學(xué)性質(zhì)差異的化合物，提供了技術(shù)思路。

參考文獻

劉? 磊， 李? 輝， 邵? 輝， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定辣椒及其栽培土壤中烯酰嗎啉和唑嘧菌胺[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2017， 8（8）： 2983-2988.

吳永官， 程? 亮， 康德賢， 等. 瓜類疫霉菌對烯酰嗎啉的敏感性及其室內(nèi)抗藥突變體研究[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2016， 37（10）： 1986-1991.

趙民娟， 郭虹娜， 邵? 華， 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定黃瓜與土壤中烯酰嗎啉和氰霜唑及其代謝物的殘留量[J]. 分析測試學(xué)報， 2018， 37（11）： 1316-1321.

師? 真， 陳俊秀， 李? 旭， 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中13種氨基甲酸酯類農(nóng)藥和殺菌劑殘留[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2018， 9（20） ： 5438-5444.

高? 艷， 崔? 勇， 馬? 杰， 等. QuEChERS/超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定果蔬中19種農(nóng)藥[J]. 中國衛(wèi)生工程學(xué)， 2018， 17（4）： 569-571.

吳春霞， 王春民， 張秋萍. 高效液相色譜-串聯(lián)三重四級質(zhì)譜測定水果中多種殺菌劑殘留[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志， 2017， 27（23）： 3382-3384.

錢長江， 蔡輝明， 張紅艷， 等. 不同溫度和赤霉素濃度對百脈根種子萌發(fā)及植株萌蘗生長的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2017， 48（6）： 997-1002.

段志坤. 赤霉素在果樹生產(chǎn)上的應(yīng)用及其注意事項[J]. 果樹實用技術(shù)與信息， 2018（12）： 13-16.

李? 敏， 石治鵬， 林忠旭， 等. 棉花MAGIC群體后代株系對赤霉素和縮節(jié)胺互作的生態(tài)響應(yīng)及其敏感性鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2017， 30（6）： 1268-1274.

張金汕， 賈永紅， 孫? 鵬， 等. 施鉀和葉面噴施赤霉素對春小麥種子萌發(fā)的影響[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2018， 55（8）： 1384-1391.

李? 田， 劉海河， 張彥萍， 等. 外源赤霉素對厚皮甜瓜坐果節(jié)位葉片早衰與內(nèi)源激素含量的影響[J]. 農(nóng)藥學(xué)學(xué)報，? 2018， 20（5）： 618-624.

Guo H B， Liu K Y， Fang B H， et al. Molecularly imprinted solid-phase extraction for the selective determination of valnemulin in feeds with high performance liquid chromato graphy[J]. Journal of Chromatography B， 2011， 879（2）： 181-185.

張? 倩， 杜海云， 賈厚振， 等. HPLC-MS/MS法測定設(shè)施甜櫻桃果實中的赤霉素含量[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 49（10）： 117-120.

李? 偉， 石麗花， 王春紅， 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定松花粉中赤霉素的含量[J]. 特產(chǎn)研究， 2017， 39（3）： 28-32.

郭宏斌， 賀利民， 楊春亮， 等. 在線凝膠色譜-氣相色譜質(zhì)譜測定菠菜中55種農(nóng)藥殘留[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2015， 35（3）： 70-76.

Jan M B， Shah J， Muhammad M， et al. Glyphosate herbicide residue determination in samples of environmental import ance using spectrophotometric method[J]. Journal of Hazardous Materials， 2009， 169（1-3）： 742-745.