杜凱然，鄧強(qiáng)，張彥軍，朱寶，馬同，彭冉東，李軍杰，徐浩軍，王雨榕,郭挺

(1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，中醫(yī)臨床學(xué)院，蘭州 730000； 2. 甘肅省中醫(yī)院，脊柱骨二科，蘭州 730050)

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是由各種原因引起的脊髓結(jié)構(gòu)和功能損害，造成損傷水平以下脊髓神經(jīng)功能(運(yùn)動(dòng)、感覺、括約肌和自主神經(jīng)功能)障礙[1]。SCI作為脊柱損傷最常見且最嚴(yán)重的并發(fā)癥，呈逐年上升的趨勢[2]。因此，脊髓損傷是一種高發(fā)病率、高致殘率、高致死率、低治愈率的疾病。由于SCI發(fā)病累及人體多個(gè)系統(tǒng)、并發(fā)癥復(fù)雜而多，治療周期長、治療方式繁雜、花費(fèi)高且療效不明顯，目前臨床尚無有效的治療方法使得SCI后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。目前，圍繞脊髓損傷的研究模型主要為構(gòu)建脊髓損傷動(dòng)物模型和損傷模型的修復(fù)治療。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)、一氧化氮(NO)和活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠有效地促進(jìn)脊髓損傷后的組織和功能修復(fù)，起到組織保護(hù)作用，成為治療脊髓損傷的干預(yù)靶點(diǎn)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的功能恢復(fù)和再生[3-4]， 但這種促進(jìn)修復(fù)的作用機(jī)制尚不明確。為了深入研究這個(gè)問題，首先需要建立一個(gè)理想的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型。本文就建立一個(gè)客觀、定量、可模擬的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的問題，對(duì)近年來國內(nèi)外的研究進(jìn)展作一綜述，為指導(dǎo)今后脊髓損傷治療的研究提供參考[5]。

1 星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)損傷的獨(dú)特作用

星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，其形態(tài)可以分為三種類型：原漿性、纖維性、放射狀[6]。其作用主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①神經(jīng)遞質(zhì)傳遞的維持和建立血-腦脊液屏障。②星形膠質(zhì)細(xì)胞可以對(duì)神經(jīng)元的修復(fù)、提供神經(jīng)的營養(yǎng)因子發(fā)揮重要作用[7-8]。有科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，在額葉神經(jīng)元和海馬神經(jīng)元附近的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠儲(chǔ)存和釋放糖原，在神經(jīng)元葡萄糖糖元消耗不足的情況下能夠給予及時(shí)的補(bǔ)充[9-10]。③星形膠質(zhì)細(xì)胞在構(gòu)建血-腦脊液屏障與維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮巨大的作用[9]。④星形膠質(zhì)細(xì)胞也對(duì)于神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、突觸傳遞、以及神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起著至關(guān)重要的作用[11]。但過度的反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞增生也會(huì)導(dǎo)致一些不利于神經(jīng)恢復(fù)的改變[12-13]。如過多的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生在脊髓損傷的周圍形成瘢痕組織，阻礙新生的神經(jīng)元的生長。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于脊髓損傷的恢復(fù)形成是最主要的影響因素。國外一些學(xué)者提出移植未成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞有利于較小瘢痕組織的形成，能夠大大提高脊髓損傷的后期修復(fù)功能[14-15]。鑒于星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)于神經(jīng)元的恢復(fù)起到的獨(dú)特作用，我們應(yīng)該重視對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的研究。

2 星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的建立

關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的分離，最初由國外科學(xué)家建立的嚙齒類動(dòng)物的星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)模型[16-17]。起初由于技術(shù)條件限制，分離細(xì)胞要經(jīng)過多次化學(xué)消化，對(duì)于細(xì)胞的結(jié)構(gòu)破壞性大。后來的學(xué)者們在此基礎(chǔ)上不斷的改進(jìn)細(xì)胞造模的方法，雖然取得顯著的成效，但是造模方法種類頗雜，缺乏一種便捷、有效、重復(fù)率高的造模方法。以下是總結(jié)一些相對(duì)效率較高的造模方式，為今后建立一種更具優(yōu)勢的造模方法提供參考。

2.1 24 h之內(nèi)新生SD大鼠的星膠質(zhì)細(xì)胞模型的制備

龍根等[18]選取24 h內(nèi)的新生SD大鼠腦組織，用磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，在冰塊上去除腦膜及血管，取皮層組織細(xì)胞置于無血清的DMEM/F12中，用眼科剪剪碎，然后在0.125%胰酶中放置溫度37℃消化2 min，200目篩網(wǎng)過濾后，放置在恒溫的培養(yǎng)箱中一天，除掉死亡細(xì)胞后使用第二代細(xì)胞。有研究表明取24 h新生大鼠的腦組織，較1～2 d大鼠的腦組織易于剝離，并且能夠減少一些組織的混雜而影響細(xì)胞的純度，影響實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒⒌臏?zhǔn)確性。單純使用胰蛋白酶消化，能夠減少細(xì)胞培養(yǎng)所需要的儀器、溶液，降低對(duì)于實(shí)驗(yàn)室條件的要求，但是此法也存在不可忽視的缺陷，如：實(shí)驗(yàn)單純使用胰蛋白溶液剔除細(xì)胞雜質(zhì)并不能夠達(dá)到實(shí)驗(yàn)所要求的細(xì)胞純度，從而影響最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 新生1～3 d新生SD大鼠的星膠質(zhì)細(xì)胞模型的制備方法

靳輝等[19]在建立星膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的過程中選取1～2 d SD大鼠，借鑒McCarthy[20]的混合膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)及分離方法，將新生大鼠消毒后取出腦組織，在冷的D-Hanks 液中放入分離腦組織，剪碎后放入離心管中，使用胰蛋白酶進(jìn)行消化20 min，盡量輕微地將上清液吸除，使用吸管反復(fù)吹打所制成的懸浮液后經(jīng)過200目的篩網(wǎng)濾過，將過濾后的懸液放置在培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放置在37℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中15 min進(jìn)行差速黏附處理，最終將其接種在L-多聚賴氨酸瓶中，放置在培養(yǎng)箱中，每隔3 d更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)者采用使用1～3 d的新生SD大鼠的腦組織用于建立細(xì)胞模型，在培養(yǎng)的過程中將常規(guī)的恒溫?fù)u床與差速貼壁法相結(jié)合，利用成纖維細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞貼壁的牢固程度、時(shí)間差，避免化學(xué)成分造成細(xì)胞的破壞，較傳統(tǒng)僅僅使用蛋白酶溶液所獲得的細(xì)胞純度更高。

2.3 新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)

查雨鋒等[21]在選取新生1～2 d的SD大鼠取其大腦灰質(zhì)放置冷DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，用D-Hanks液清洗3次使用眼科剪剪碎后在37℃、0.25%的消化酶液中消化震蕩15～20 min，加入10% FBS 的高糖DMEM終止消化后離心5 min，去掉其上清液后將其沉淀和終止液混勻后放入200目濾網(wǎng)，將細(xì)胞接種于未包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。首次12 h后取出培養(yǎng)液之后每隔2～3 d更換一次。王建斌等[22]在星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)在顯微鏡下星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度平均僅為1.94%，培養(yǎng)的細(xì)胞中含有寡突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等。此種方法最大的優(yōu)勢在于操作簡單、快捷、復(fù)制簡單，對(duì)于初學(xué)者易于掌握且成功率高，減少實(shí)驗(yàn)的成本且還能達(dá)到實(shí)驗(yàn)的目的，但是對(duì)于培養(yǎng)皿中的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度低、破壞嚴(yán)重從而嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)的科學(xué)性，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)性降低，對(duì)于要求精確的實(shí)驗(yàn)，此種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ途吐燥@粗糙。

2.4 新生大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的隔代培養(yǎng)

2.4.1 胰蛋白酶消化法

黎天尊等[23]在建立星形膠質(zhì)細(xì)胞模型時(shí)選取第三代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。取新生1日齡SD大鼠，剖開脊髓組織，剝離組織和血管，使用眼科剪將組織剪為0.5～1.0 mm小塊，0.25%胰蛋白酶消化15 min后繼續(xù)用DMEM/F-12培養(yǎng)基進(jìn)行消化、過濾、離心后去掉上清液后，加入新的培養(yǎng)液裝進(jìn)一次性的塑料培養(yǎng)瓶中，將此瓶放置在恒溫37℃含有5% CO2的培養(yǎng)箱中，每隔24 h后換液待細(xì)胞長約80%融合后，使用0.25%胰蛋白消化、傳代，最終取第三代細(xì)胞。此種方法比原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在制作的過程中所存在的血細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的數(shù)量明顯降低，利用胰蛋白酶剔除與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的雜質(zhì)，此種方式雖然比原代培養(yǎng)具有一定的優(yōu)勢，但是建立細(xì)胞模型的同時(shí)需要胰蛋白酶的多次消化，從而對(duì)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的本身也有很大的損害，因而此法也有其局限性。

2.4.2 恒溫?fù)u床震蕩法與差速貼壁法相結(jié)合

恒溫?fù)u床震蕩法最初由國外學(xué)者提出[24-25]，靳輝等[19]在此方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良，運(yùn)用其他技術(shù)如倒置相差顯微鏡、HE染色、GFAP免疫熒光等技術(shù)和恒溫?fù)u床震蕩法與差速貼壁法相結(jié)合，充分利用成纖維細(xì)胞的貼壁能力強(qiáng)、速度快等特點(diǎn)，先采取震蕩搖床的方法剔除成纖維細(xì)胞后，再同時(shí)利用小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁速度慢、貼壁周期長等特點(diǎn)利用震蕩搖床的方法去除殘余。此種方法充分利用成纖維細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的特點(diǎn)，在傳統(tǒng)的技術(shù)手段上與一些新的提取模式相結(jié)合。這種方法優(yōu)勢在于：①提高了星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度并且減少化學(xué)溶液、物理機(jī)械等方法對(duì)于細(xì)胞的損傷；②避免了一些初學(xué)者在分離腦膜時(shí)未能把腦膜剔除干凈，從而為成纖維細(xì)胞的繁殖提供溫床，有研究證實(shí)腦膜殘留能夠增加成纖維細(xì)胞的繁殖[26]。但是此種方法缺點(diǎn)：①并未徹底清除成纖維細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞，真正能用于實(shí)驗(yàn)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度未能達(dá)到實(shí)驗(yàn)所預(yù)設(shè)的結(jié)果；②需要37℃恒溫?fù)u床，而許多實(shí)驗(yàn)室尚未配備此種儀器，故此種方法目前仍存在一些缺陷。

2.4.3 差速貼壁、梯度血清、十字手搖法相結(jié)合

丁娟等[27]在現(xiàn)有的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上改進(jìn)一種培養(yǎng)方法，主要采取逐步遞增的三個(gè)步驟：首先使用常規(guī)差速貼壁法，利用成纖維細(xì)胞貼壁快、小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁速度慢、周期長的特點(diǎn)，先剔除一部分成纖維細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞。再利用成纖維細(xì)胞對(duì)于血清的依賴程度，通過“梯度血清”的方法再次剔除成纖維細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞。在實(shí)驗(yàn)的1～2 d使用20% DMEM以促使星形膠質(zhì)細(xì)胞快速生長，然后以10% DMEM培養(yǎng)2 d以控制細(xì)胞的生長；最后不使用DMEM溶液培養(yǎng)2 d。此種方法培養(yǎng)7 d后，一部分成纖維細(xì)胞由于缺少血清從而死亡；第三步利用成纖維細(xì)胞與小膠質(zhì)細(xì)胞比星形膠質(zhì)細(xì)胞的貼壁能力差，在培養(yǎng)第7 天后使用“十字手搖法”震蕩5 min，貼壁不牢固的成纖維細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞就會(huì)脫落[28]。該方法最大的優(yōu)勢在于：①逐層遞增的方法剔除細(xì)胞的雜質(zhì)，較傳統(tǒng)方法的效率更高，得到的星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度更高；②比較“恒溫?fù)u床法”所需37℃恒溫?fù)u床相比，“十字手搖法”為沒有恒溫?fù)u床的實(shí)驗(yàn)室提供新的解決方法，大大增加此種方法的適用范圍[29]。上述各種方案均有自身的優(yōu)勢與局限性，在星形膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞造模過程中，一定要盡量有效規(guī)避其劣勢，各方法之間有效結(jié)合、優(yōu)化配置，為今后建立星形膠質(zhì)細(xì)胞模型提供一種完整有效的方案。

3 結(jié)語

目前，脊髓損傷的治療尚缺乏切實(shí)有效的辦法，是國內(nèi)外的脊柱研究領(lǐng)域一個(gè)急需解決的問題。有大量的研究證實(shí)，脊髓損傷中血-腦脊液屏障損傷導(dǎo)致星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上水通道蛋白-4的表達(dá)改變，是血管源性水腫、細(xì)胞毒性水腫的重要因素[30]。因此，星形膠質(zhì)細(xì)胞在脊髓損傷的修復(fù)中扮演重要角色，星形膠質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)模型在病理、生理及藥理學(xué)研究中方面都具有重要意義[31]。然而，建立任何一個(gè)脊髓損傷細(xì)胞模型都應(yīng)盡可能接近人體脊髓損傷的實(shí)際情況，制作脊髓損傷細(xì)胞模型也要盡量模擬人體脊髓損傷的發(fā)生機(jī)制，并將在脊髓損傷細(xì)胞模型制備中的發(fā)現(xiàn)應(yīng)用于臨床實(shí)踐。迄今已經(jīng)取得的許多進(jìn)展，可為臨床治療脊髓損傷提供理論指導(dǎo)[32]。目前建立星形膠質(zhì)細(xì)胞模型時(shí)，選取新生SD大鼠的優(yōu)勢明顯大于猴、狗、貓等一些動(dòng)物。例如：①大鼠成本低；②大鼠的操作方便，易于獲取，也減少了研究人員在實(shí)驗(yàn)過程中被動(dòng)物咬傷的機(jī)會(huì)；③最為重要的是大鼠脊髓的星形膠質(zhì)細(xì)胞模型很接近人體的損傷模型，更有利于還原實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)的科學(xué)性。而上文中講述的造模方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，大多數(shù)學(xué)者傾向于差速貼壁、梯度血清、十字手搖法相結(jié)合，該方法利用化學(xué)、物理等方法相結(jié)合，層層剔除細(xì)胞的雜質(zhì)，相比較于其他方法，能夠獲得較高純度的星形膠質(zhì)細(xì)胞。但至今尚沒有完全規(guī)范化、統(tǒng)一性、定量化的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用于此，建立一種定量化星形膠質(zhì)細(xì)胞模型的方法，仍是今后努力研究的方向。