喬大偉，李玉芳，張蕾，姜禮雙，孔桂美，卜平*

(1. 揚州大學臨床醫(yī)學院消化內(nèi)科，江蘇 揚州 225001； 2. 江蘇省中西醫(yī)結合老年病重點防治實驗室，江蘇 揚州 225001)

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大癌癥和癌癥死亡的第四大原因[1]。近年來由于生活方式和飲食習慣的變化，我國結直腸癌發(fā)病率和死亡率呈逐步上升趨勢, 結直腸惡性腫瘤在腫瘤發(fā)病率中占據(jù)第5位[2]。肝是CRC最常見的遠處轉(zhuǎn)移部位，CRC患者中約有一半會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。結直腸癌肝轉(zhuǎn)移(colorectal cancer liver metastases，CRLM)也是CRC患者死亡的主要原因。盡管經(jīng)過化療后，患者存活率有所提高，但手術切除仍被認為是肝轉(zhuǎn)移患者的唯一治療選擇。雖然根治性手術是標準治療方式，但只有10%～20%的患者被認為有資格進行切除。即使在成功切除后，大多數(shù)患者仍然會復發(fā)[3]。近年來，由于免疫缺陷小鼠的廣泛應用，以及患者的個性化治療越來越受到關注，源于患者原代腫瘤組織的異種移植(patient-derived tumor xenograft，PDTX)的臨床前模型研究火熱。PDTX模型是指將手術期間獲得患者腫瘤部分組織或者人源腫瘤細胞植入免疫缺陷小鼠。用于PDTX模型的小鼠類型包括裸鼠，SCID小鼠，NOD/SCID小鼠和NSG小鼠[4]。本文就目前常用的CRLM-PDTX動物模型進行綜述。

1 異種原位種植模型

異種原位植入，即在小鼠中與人類患者原始腫瘤部位相對應的部位植入人源腫瘤細胞，使小鼠腫瘤發(fā)生與發(fā)展的行為與臨床患者相似。1984年，Wang等首次采用異種原位種植建模[5]，他們將人CRC細胞Co115注入裸鼠的降結腸，腫瘤在注射部位生長繁殖并發(fā)生轉(zhuǎn)移。隨后有學者[6]利用裸鼠建立了首例人體腫瘤組織異種原位種植的模型(patient-derived orthotopic xenograft，PDOX)。從那時起，PDOX模型被用于腫瘤微環(huán)境研究，探索腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制，包括自發(fā)轉(zhuǎn)移形成[7]。這些模型使研究人員能夠研究藥物療效，如用各種化療方案以預測患者的臨床反應[8]，還用于研究新的腫瘤標志物抗性和易感性，并檢測新的藥物方案以克服抗性。Wang等[9]采用自制接種器將0.1 mL細胞濃度為2×107/mL的人結腸癌細胞HCT116接種于BALB/c裸鼠直腸，成功建立異種原位種植模型，直腸原位接種組18只成瘤率為100%，未發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移。此法轉(zhuǎn)移發(fā)生時間較長。Hite等[10]模擬了結直腸癌患者中原發(fā)腫瘤生長和自發(fā)性肝轉(zhuǎn)移的模式，使用熒光素酶標記的HT-29細胞建立了異種原位小鼠直腸種植模型，結果發(fā)現(xiàn)直腸內(nèi)注射的死亡率為4.0%(1/25)，60%的小鼠有肝轉(zhuǎn)移，56%發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，證實直腸內(nèi)注射建立異種原位種植模型能準確地模擬腸癌原發(fā)性腫瘤生長和自發(fā)轉(zhuǎn)移的過程，具有安全性，可重復性及高模擬性。原位種植方法操作簡單，能更好地模擬結直腸癌的臨床生物學行為，比如腫瘤的局部生長、腫瘤的浸潤、癌細胞原位脫落穿過血管壁進入門靜脈循環(huán)血運轉(zhuǎn)移等過程。但是因直腸壁較薄故種植成功率較低，遠處轉(zhuǎn)移時間較長，因此，為了能夠監(jiān)測轉(zhuǎn)移的發(fā)生，該模型成像技術是必不可少的。

2 異種異位種植模型

異種異位種植模型按植入位置不同可以分為皮下種植、脾種植、門靜脈/腸系膜種植、肝種植、腹腔擴散種植及尾靜脈種植。

2.1 皮下種植模型

皮下植入模型可以直接測量腫瘤大小，發(fā)展成類似于人類腫瘤的結直腸癌，但幾乎不會產(chǎn)生轉(zhuǎn)移。Blomme等[11]收集患者手術時新鮮腫瘤樣品，切成60 mm3的細小片段并皮下移植到NOD-SCID小鼠的皮膚中。利用MALDI成像技術，對6名患者腫瘤組織與PDX第4代的腫瘤組織進行了代謝比較分析。首次研究發(fā)現(xiàn)CRC/CRC-LM PDX模型在代謝水平能夠維持功能穩(wěn)定性。證明人類癌細胞在PDX模型上，不僅能產(chǎn)生類似人類的腫瘤組織，且能對患者腫瘤組織保持高度的遺傳性和轉(zhuǎn)錄的保真度。這將為新藥物應用于臨床前進行實驗研究提供一個非常好的實驗平臺。Brown等[12]收集16名腸癌肝轉(zhuǎn)移患者肝轉(zhuǎn)移灶組織，并將腫瘤移植到NOD.CB17-Prkdcscid/Arc小鼠皮下。結果植入率達81%，患者與PDX化療敏感性概況之間的陽性匹配率為67%。該試驗研究證明了使用CRLM的PDX模型作為評估PDX化療敏感性的平臺的可行性。Lu等[13]將患者腫瘤組織約2 mm大小的碎片并植入8～10周齡JAX.NOD.CB17-PrkdcSCID-J小鼠的側(cè)腹。使用基于基因的方法與結直腸癌的臨床前模型的結合來鑒定可用于治療結腸直腸肝轉(zhuǎn)移的協(xié)同藥物，即奧沙利鉑和mTOR抑制劑聯(lián)合應用可有效治療結直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者。此法操作簡單，植入成功率高，便于觀察，重復性好。但是因皮下生長的腫瘤常易被纖維膜所包繞，不易表現(xiàn)惡性腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的特性，故常常用于評價單純針對原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶組織的保真性，化療敏感性及治療的有效性。

2.2 脾種植模型

脾種植法是目前大腸癌肝轉(zhuǎn)移模型公認的最佳模式之一。由于腫瘤細胞從脾內(nèi)種植細胞，植入的細胞逃逸大量免疫細胞的攻擊，主要通過血管浸潤發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。因此，能夠更好模擬人體內(nèi)CRC切除后的肝轉(zhuǎn)移。根據(jù)是否切除脾分為脾保留法和脾切除法。

2.2.1 脾保留法

脾保留是指將人CRC細胞從脾上極或下極注入動物脾內(nèi)，脾送回體內(nèi)，瘤細胞經(jīng)脾靜脈進入肝。Fleten等[14]通過脾注射HT細胞株HT29和HCT116，在裸鼠中建立腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。注射后，HCT116和HT29細胞在所有動物中產(chǎn)生肝腫瘤。Kawaguchi等[15]將人HT29-RFP細胞(5 × 105)注射到裸鼠的脾上極和下極。注射后3周，成功建立腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。此法成功率高，應用最為廣泛。最近，Kim等[16]在使用CRC-PDTX以及CRLM-PDTX模型基礎上，證明了CCSP-2靶向探針可以鑒定結腸外CCSP-2陽性結腸腫瘤。這表明CCSP-2靶向分子成像能夠檢測轉(zhuǎn)移性疾病。對于結腸癌的治療，早期轉(zhuǎn)移或復發(fā)檢測，有望通過在疾病早期檢測病變來挽救更多患者，延長生存期。此法保留了脾的部分免疫功能，保存宿主固有的抗腫瘤免疫力，且操作簡單，易于實施。但是肝轉(zhuǎn)移瘤形成的同時發(fā)生脾腫瘤，轉(zhuǎn)移灶常為巨大癌結節(jié)，影響小鼠的存活時間，并且脾腫瘤通常在肝轉(zhuǎn)移瘤前發(fā)生，會影響實驗的準確性，不適于驗證周期較長的藥物實驗。

2.2.2 脾切除法

脾切除是指將人CRC細胞從脾上極或下極注入實驗動物脾內(nèi)，待瘤細胞經(jīng)脾靜脈進入肝，切除脾。Oshima等[17]制作了用熒光素酶和tdTomato穩(wěn)定標記的具有不同的生長特性的人結直腸癌HCT116細胞的單克隆衍生物，經(jīng)脾注射入6～8周齡無胸腺裸鼠后，將脾切除，使用體內(nèi)成像系統(tǒng)(IVIS)，可以通過體內(nèi)發(fā)光和離體熒光成像，監(jiān)視轉(zhuǎn)移的發(fā)生發(fā)展，結果大部分能夠產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移。由于該模型與臨床觀察到的肝轉(zhuǎn)移灶相似，因此它可作檢測與肝轉(zhuǎn)移相關基因，并用于肝轉(zhuǎn)移灶局部消融或輔助治療研究。此法雖然不能模擬腫瘤分泌降解酶降解細胞外基質(zhì)，偽足形成，侵及血管，進入血液等關鍵步驟，而且在一定程度上令免疫系統(tǒng)受損，術后動物病死率高，操作較復雜，對試驗者技術要求較高。但是很好地模擬了大腸癌根治術后因血行轉(zhuǎn)移而發(fā)生肝轉(zhuǎn)移的過程，肝轉(zhuǎn)移率高，模型穩(wěn)定，轉(zhuǎn)移癌向各個肝葉呈彌漫性轉(zhuǎn)移?？梢詽M足各種檢測方法的取材需要。是研究腫瘤形成和分析新的治療效果的理想模型。

2.2.3 半脾模型

半脾模型為脾保留和脾全切的改良造模方法，利用脾的解剖特點，將人CRC細胞注入脾下極，待瘤細胞經(jīng)脾靜脈進入肝，切除脾下極，保留脾上極，具有一定的創(chuàng)新性。Bai等[18]利用裸鼠脾的特殊解剖，建成半脾模型。脾中央利用一次性鈦夾夾閉并切斷，分成兩個帶血管蒂的半脾。將人HT29結直腸癌細胞接種于近端半脾被膜下，遠端半脾埋入皮下備治療所需，共分6組觀察制模30 d后的肝轉(zhuǎn)移評分、淋巴結轉(zhuǎn)移及血性腹水情況。結果人HT29結直腸癌細胞建立的肝轉(zhuǎn)移半脾模型成瘤率為100%。此法既保留了脾的部分免疫功能，又大大降低模型建立時脾腫瘤的干擾率。且此模型可以經(jīng)靜脈給藥，更加貼近于臨床，可應用于預防性肝轉(zhuǎn)移治療的實驗設計。但是相比脾保留與脾全切，動物實驗手術操作復雜，對試驗者技術要求極高。該模型為研究結直腸癌肝轉(zhuǎn)移的生物學機制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了較為理想的實驗模型，且該模型能應用于抗腫瘤藥物的篩選，因此是目前造模的最有效方法之一。

2.3 門靜脈/腸系膜種植模型

此法是將人CRC細胞注入門靜脈/腸系膜靜脈，經(jīng)血流入肝。Thalheimer等[19]使用熒光素酶標記的人結腸癌細胞系HCT-116Luc(pos)的細胞(2.5 × 106)，通過門靜脈注射到免疫功能不全的裸鼠中。使用生物發(fā)光體內(nèi)成像(BLI)技術，分析動物的腫瘤生長。注射后4 d，即產(chǎn)生肝轉(zhuǎn)移。該模型利用熒光素酶活性，通過非侵入性地成像技術，提供了關于腫瘤負荷和治療有效性的有價值的信息。因此，所呈現(xiàn)的基于HCT-116Luc(pos)細胞生長的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移模型適用于不同癌癥治療策略的體內(nèi)測試。此法相比脾種植，腫瘤轉(zhuǎn)移速度更快，肝轉(zhuǎn)移率更高，適用于腫瘤藥物的篩選。但是手術難度更大，存在一定風險，死亡率更高，而且不能模擬腫瘤轉(zhuǎn)移的全過程，減少了原發(fā)瘤最初侵襲周圍組織和穿入血管等步驟。

2.4 肝種植模型

肝種植是將人CRC細胞注射到肝中或者將臨床上腫瘤組織直接植入肝發(fā)展轉(zhuǎn)移性腫瘤。Roque-Lima等[20]將新鮮腫瘤組織磨成碎片，直接植入裸小鼠肝上，成功建立PDTX臨床前模型，該模型準確地復制腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，有望為CRLM患者測試各種治療方案，包括疾病進展生物標志物和治療反應性研究。此法腫瘤生長速度快，轉(zhuǎn)移率較高。操作簡單，易于實施，且相對廉價，重復性好。但是僅僅涉及轉(zhuǎn)移的晚期過程，沒有涉及結腸癌原位生長的演進過程，故與人體內(nèi)結腸癌轉(zhuǎn)移觀察模擬度較差，不適合結腸癌這種通過血道及淋巴道為主要轉(zhuǎn)移途徑的腫瘤模型制作。而且大部分僅在實驗部位成瘤，周圍很少有轉(zhuǎn)移的衛(wèi)星結節(jié)，不符合臨床上結腸癌肝轉(zhuǎn)移常為多發(fā)轉(zhuǎn)移的特點。此模型適用在個體腫瘤基礎上測試各種化療劑以幫助臨床。

2.5 腹腔擴散種植模型

腹腔擴散種植是將人CRC細胞通過微型注射器直接注射入動物腹腔內(nèi)，使其播散性生長，引起腹水(含有大量瘤細胞)。解剖小鼠后觀察肝轉(zhuǎn)移或其他臟器轉(zhuǎn)移。如果再將這種帶瘤腹水移植至下一代動物，便建立腹水瘤模型。Miyoshi等[21]用miR-139-5p轉(zhuǎn)染的3×106個人Caco-2細胞腹膜內(nèi)注射到裸小鼠中，建立CRC腹膜轉(zhuǎn)移的小鼠模型，具有較高的肝及腹膜轉(zhuǎn)移率。此法操作簡單，肝轉(zhuǎn)移率高。轉(zhuǎn)移周期短，短期內(nèi)可復制大量模型。但是沒有專一性器官轉(zhuǎn)移，僅僅模擬晚期腫瘤患者轉(zhuǎn)移途徑，對于淋巴轉(zhuǎn)移及血行轉(zhuǎn)移意義不大。該模型常用于CRC術后腹腔種植播散和癌癥晚期腹腔廣泛轉(zhuǎn)移的病理生理研究。

3 展望

隨著模擬癌癥發(fā)生的免疫缺陷的動物模型不斷升級，最近開發(fā)的CRLM-PDTX模型，為CRC及CRLM的研究增添了新的內(nèi)容。研究人員已經(jīng)開發(fā)出非常準確的臨床前模型。在更好地了解疾病過程以及未來研究人員可用的改進技術的同時，我們可以預期這些CRLM-PDTX模型會有更多進展。這將有助于確保臨床前動物研究結果與其臨床對人結果保持一致。CRLM-PDTX模型主要用于生物標志物，藥物，腫瘤生物學等研究。盡管存在可變的基質(zhì)和缺乏合適的免疫系統(tǒng)的缺點，但該模型已經(jīng)證明具有優(yōu)異的預測能力，可以被認為是外部有效性的量度。這為CRC及CRLM患者帶來了福音。