羅倉學， 張春芳

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

黑豆中蛋白質、氨基酸、脂肪、維生素、微量元素和粗纖維含量豐富.中醫(yī)認為黑豆有活血、利水、祛風、解毒之功效，基于以上保健功能，黑豆常被加工為保健產(chǎn)品[1].黑豆淀粉含量可達30%[2]，糊化溫度為78℃，是很好的碳水化合物來源.黑豆淀粉在一些產(chǎn)品加工(如黑豆豆?jié){[3]、黑豆酸奶[4]、黑豆多肽保健飲品[5]等)中作為廢渣被浪費.目前有關淀粉酶解方面的研究較多，如黃旖旎等[6]用α-淀粉酶酶解百合淀粉，畢金峰等[7]用α-淀粉酶酶解玉米淀粉等，黑豆淀粉研究較少，其主要原因是黑豆淀粉含量低為3～30%[8,9]，常見的淀粉提取法濕磨法[10]和酶解法[11]淀粉提取率較低為50%左右[12]，不利于黑豆淀粉提取，所以黑豆淀粉糊化溫度對淀粉酶解效果的研究更少.一般淀粉糊化是在低于100℃溫度下進行，此溫度是否為最利于淀粉酶解的預處理溫度并未有相關報道.

本文主要對比了黑豆淀粉在100℃以下和100℃以上高溫糊化對淀粉酶解率的影響，并通過響應面優(yōu)化α-淀粉酶酶解工藝，旨在獲得較高酶解程度的黑豆淀粉酶解液，提高黑豆淀粉利用率.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶 ，丹麥諾維信酶制劑公司；食用調和植物油，益海嘉里食品工業(yè)有限公司；亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、鹽酸、氫氧化鈉、硫酸銅、亞甲基藍、冰乙酸、葡萄糖、酒石酸鉀鈉，天津市科密歐化學試劑有限公司.

1.2 儀器與設備

220V-AC萬用電爐，北京科偉永興儀器有限公司；FA2104S分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；U610052單道可調式移液器，上海普林斯頓生物科技發(fā)展有限公司；101-2型干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械有限公司； PB-10Sartorius pH計，德國賽多利斯集團； MJ-BL25B36粉碎機，廣東美的集團股份限公司；DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器、DF-1集熱式恒溫磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責任公司.

1.3 實驗方法

1.3.1葡萄糖含量測定

將黑豆酶解液在沸水浴中滅酶10min，等溫度降至60℃，3000r/min離心10min，根據(jù)GB/T5009.7-2016中方法測上清液中葡萄糖(以還原糖計)含量.

1.3.2淀粉酶解率測定方法

將1.3.1葡萄糖含量測定過程中離心后的上清液測定體積，并將葡萄糖含量和體積代入式(1).

(1)

式(1)中：m為葡萄糖當量等于葡萄糖含量與酶解液質量乘積，g；0.9為還原糖轉化為淀粉含量的系數(shù)；M為黑豆重量，g；0.28為該黑豆樣品中淀粉含量為28%.

1.4 糊化溫度對黑豆淀粉酶解率的影響

取黑豆5g和50mL純凈水于帶橡膠塞的圓底燒瓶，選擇糊化溫度為68℃、78℃、98℃、108℃、118℃、128℃在油浴鍋中加熱20min，待黑豆糊中心溫度降至65℃時加入α-淀粉酶，酶解條件：加酶量30μL、酶解pH值6.0、酶解溫度65℃，酶解時間1h，沸水浴加熱10min滅酶，測定不同糊化溫度下的淀粉酶解率，確定最佳糊化溫度，以上實驗均重復三次.

1.5 α-淀粉酶酶解實驗

取黑豆5g按質量比1∶10加入純凈水在55℃下浸泡5h，按1.4優(yōu)化的糊化溫度在帶有攪拌器的加熱容器中糊化1h，進行以下單因素實驗和響應面實驗.

1.5.1α-淀粉酶酶解單因素實驗

固定酶解溫度為65℃，加酶量為30μL，酶解時間為2h，以淀粉酶解率為指標觀察不同酶解pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)對淀粉酶解率的影響；固定酶解溫度為65℃，酶解時間為2h，酶解pH值為6.0，觀察不同加酶量(10μL、20μL、30μL、40μL、50μL)對淀粉酶解率的影響；固定加酶量為30μL，酶解溫度為65℃，酶解pH值為6.0，觀察不同酶解時間(1h、2h、3h、4h、5h)對淀粉酶解率的影響；固定加酶量為30μL，酶解pH值為6.0，酶解時間為3h，觀察不同酶解溫度(55℃、60℃、65℃、70℃、75℃)對淀粉酶解率的影響，以上實驗均重復三次.

1.5.2α-淀粉酶響應面優(yōu)化實驗

采用Box-Benhnken中心組合實驗設計，在單因素實驗基礎上，固定酶解時間為3h，選取酶解pH、加酶量、酶解溫度對淀粉酶解率影響較大的三個因素，建立三因素三水平的Box-Benhnken中心組合實驗，以淀粉酶解率為響應值，進行實驗，以上實驗均重復三次.實驗設計詳見表1所示.

表1 響應面實驗設計水平

1.6 驗證實驗

將黑豆分別在最佳糊化溫度和78 ℃下糊化后，在最佳酶解條件下酶解，對比響應面軟件所得預測值與真實值之間的誤差及通過比較78 ℃和最佳糊化溫度糊化后淀粉酶解率，得高溫糊化對淀粉酶解率的影響，以上實驗均重復三次.

2 結果與討論

2.1 糊化溫度對黑豆淀粉酶解率的影響

由圖1可知，當糊化溫度范圍在78 ℃～98 ℃時，淀粉酶解率基本不變.溫度高于108 ℃時，淀粉酶解率迅速增加并隨著溫度升高趨于穩(wěn)定.魏毛毛[13]比較了常見的八種淀粉，發(fā)現(xiàn)其中綠豆直鏈淀粉含量最高為37.0%，95 ℃處理下，其膨脹體積最低.黑豆淀粉中直鏈淀粉含量為45.5%[14]，所以推斷出黑豆淀粉膨脹能力較弱，需要高溫才能使其淀粉顆粒完全破壞.當溫度大于108 ℃淀粉顆粒才能充分吸水膨脹，淀粉酶解率迅速增加到50%左右并趨于穩(wěn)定.為了節(jié)約資源，所以108 ℃為最佳糊化溫度.

圖1 糊化溫度對淀粉酶解率的影響

2.2 α-淀粉酶酶解實驗結果分析

2.2.1α-淀粉酶單因素實驗結果分析

(1)酶解pH值對淀粉酶解率的影響

由圖2可知，酶解pH在5.0～6.0范圍內，淀粉酶解率逐漸增大，酶解pH為6.0時淀粉酶解率達到最大，酶解pH在6.0～7.0之間淀粉酶解率基本保持穩(wěn)定，說明酶解pH在6.0～7.0之間酶活力穩(wěn)定，此時的酶解離狀態(tài)最有利于酶與底物結合.酶解pH在7.0～8.0范圍內，淀粉酶解率逐漸降低.原因可能是pH 值影響酶活性中心上必需基團的解離程度和催化基團中質子供體或質子受體所需的離子化狀態(tài)，從而影響酶與底物的結合[15]，因此酶解 pH 值在6.0～7.0為最佳.

圖2 酶解pH對淀粉酶解率的影響

(2)加酶量對淀粉酶解率的影響

由圖3可知，隨著加酶量的增加淀粉酶解率逐漸增加，這是因為反應起始時淀粉過量，加酶量與酶促反應速度成正比.當加酶量增加至30μL時，淀粉酶解率達到最大值，大于30μL后淀粉酶解率略有下降，原因是酶與淀粉反應為可逆反應，當還原糖積累到一定程度時，加速了逆反應，更多最終產(chǎn)物轉化為中間產(chǎn)物，抑制正反應進行，因此淀粉酶解率略有降低[16].所以最佳加酶量為30μL.

圖3 加酶量對淀粉酶解率的影響

(3)酶解時間對淀粉酶解率的影響

由圖4可知，在0～3 h范圍內淀粉酶解率隨著酶解時間的增加而增加.當酶解時間大于3 h時，淀粉酶解率基本穩(wěn)定不變，原因可能是底物逐步被酶解，淀粉酶解率趨于穩(wěn)定，也可能是酶解時間的增加，導致酶活力逐漸降低，產(chǎn)物逐步積累，對酶解作用產(chǎn)生抑制，淀粉酶解率趨于穩(wěn)定.所以最佳酶解時間為3 h[17].

圖4 酶解時間對淀粉酶解率的影響

(4)酶解溫度對淀粉酶解率的影響

由圖5可知，酶解溫度在55 ℃～65 ℃之間淀粉酶解率緩慢增加，在65 ℃～70 ℃之間，淀粉酶解率基本保持穩(wěn)定，高于70 ℃后淀粉酶解率迅速降低.這一現(xiàn)象與酶促反應的普遍規(guī)律相吻合.酶解溫度對酶促反應的影響有兩方面.一方面，當酶解溫度升高，單位時間內的有效碰撞次數(shù)增加，反應速度增快，達到最佳溫度范圍后反應速度保持穩(wěn)定；另一方面，酶本質是蛋白質，酶解溫度高于該酶所能承受的最大溫度后，隨著酶解溫度升高，酶發(fā)生變性失活淀粉酶解率迅速降低[18]，所以最佳酶解溫度為70 ℃.

圖5 酶解溫度對淀粉酶解率的影響

2.2.2 響應面實驗方案設計及結果分析

根據(jù)單因素實驗結果，由Design-Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件設計實驗方案.以淀粉酶解率為響應值，以加酶量(A)、酶解pH(B)酶解溫度(C)為自變量，進行三因素三水平中心組合實驗，其結果如表2所示.

表2 響應面實驗設計及酶解結果

(1)回歸方程擬合及方差分析

采用Design Expert 8.0.6統(tǒng)計軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸方程結果如表3所示.對各因素回歸擬合后，得到回歸方程：淀粉酶解率=54.80+2.29A+1.89B-0.47C-1.59AB-0.58AC+1.23BC-1.75A2-5.06B2-2.14C2回歸模型的R2=0.988 8，RAdj=0.968 5由方差分析可知回歸方程模型顯著(p<0.05),說明該模型與實際擬合良好，實驗方法可靠，失擬項不顯著(p>0.05)，說明所得方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小，可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析.結果表明，加酶量(A)、酶解pH值(B) 、加酶量與酶解pH值交互項(AB)、 酶解pH值與酶解溫度交互項(BC)、加酶量二次項(A2) 、酶解pH值二次項(B2)、酶解溫度二次項(C2)對應響應值顯著，根據(jù)P得各因素顯著性的排序為A>B>C.根據(jù)軟件所建立的數(shù)學模型進行參數(shù)最佳化分析，得α-淀粉酶最佳酶解工藝為：加酶量33.29μL、酶解溫度 69.09 ℃、酶解pH6.03、酶解時間3 h，淀粉酶解率預測值為54.80%.

注：**p<0.01為極顯著；*p<0.05為顯著.

(2)響應面圖分析

根據(jù)軟件Design-Expert 獲得響應值的3D曲面，分析各因素對淀粉酶解率的影響及各因素間的交互作用.圖6所示固定加酶量，酶解pH值，酶解溫度中的任意一個因素為零水平時，觀察其余兩個因素間的交互作用及對淀粉酶解率的影響.淀粉酶解率隨其中任意兩個變量的增加均呈上升趨勢，達到某一定值時，曲面稍下降或趨于平緩.由圖6可知，曲面陡峭，說明加酶量和酶解pH之間交互作用明顯，與方差分析結果一致.

圖6 兩因素的交互作用對淀粉酶解率的響應面圖

2.3 驗證實驗

考慮到實際操作條件，將黑豆酶解工藝調整為：加酶量33μL、酶解溫度69 ℃、酶解pH6.0、酶解時間3 h.由表4驗證實驗結果可得：黑豆在最佳糊化溫度108 ℃下糊化，用最佳酶解工藝酶解淀粉酶解率達53.10±2.3%，與預測值誤差為3.20±0.04%.相比黑豆在78℃下糊化，黑豆在108 ℃下糊化淀粉酶解率提高了20.20±1.1%.

表4 驗證實驗

3 結論

由以上實驗可知，黑豆淀粉糊化溫度為108 ℃時，最益于α-淀粉酶酶解.在108 ℃下糊化后，通過響應面法優(yōu)化α-淀粉酶酶解工藝，得最佳酶解工藝：加酶量33μL，酶解溫度69 ℃，酶解pH6.0，酶解時間3 h.通過驗證實驗得黑豆108 ℃下糊化，與78 ℃下糊化相比,淀粉酶解率提高了20.20±1.1%.通過本實驗獲得了較高酶解程度的黑豆淀粉酶解液，提高黑豆利用率，避免了資源浪費.