，，，

(1.蘇州檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)中心，江蘇 蘇州 215104； 2.蘇州華博日化品檢測(cè)服務(wù)有限公司，江蘇 蘇州 215104)

由于水產(chǎn)品種分布的多樣性, 鮮活水產(chǎn)品跨地區(qū)、長(zhǎng)時(shí)間運(yùn)輸已成為常態(tài)[1]。因此，在長(zhǎng)途運(yùn)輸中對(duì)水產(chǎn)品進(jìn)行有效?；罹惋@得非常重要[2]，在水產(chǎn)品運(yùn)輸中使用麻醉劑可以降低魚類的耗氧量和氨氮排放量，可有效防止其在運(yùn)輸時(shí)激烈活動(dòng)造成的傷害，從而增加運(yùn)輸距離和運(yùn)輸量，提高其存活率[3]。常用的漁用麻醉劑主要有MS-222、丁香酚類化合物、二氧化碳等[4]。其中，丁香酚以其高效、低價(jià)、代謝快的特點(diǎn)，受到廣泛關(guān)注，但其對(duì)肝細(xì)胞具有一定毒性。目前，關(guān)于丁香酚對(duì)人體的危害及作為漁用麻醉劑的安全性在國(guó)際上仍具有一定的爭(zhēng)議，日本、韓國(guó)、澳大利亞、新西蘭、智利等國(guó)認(rèn)定丁香酚是合法的漁用麻醉劑[5]。MS-222作為水生動(dòng)物麻醉劑具有易處理、效力迅速、安全性高等特性[6-8]，是美國(guó)FDA批準(zhǔn)在指定種類水產(chǎn)品中使用的麻醉劑[9-11]，但要經(jīng)過21 d停藥期才能上市銷售。

目前, 中國(guó)對(duì)丁香酚類、MS-222等麻醉劑在水產(chǎn)品中的使用并未制定相關(guān)的政策法規(guī)和限量標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)楸O(jiān)管制度的滯后，國(guó)內(nèi)現(xiàn)缺乏對(duì)魚用麻醉劑使用安全性的權(quán)威判定，如不及時(shí)加以引導(dǎo)和監(jiān)管，可能會(huì)越來(lái)越多地引起公眾對(duì)魚用麻醉劑安全性的擔(dān)憂和恐慌，同時(shí)也不利于漁業(yè)經(jīng)濟(jì)的健康發(fā)展。但現(xiàn)有方法僅針對(duì)單一種類麻醉劑，且方法檢出線較高，基質(zhì)干擾較嚴(yán)重，因此，需開發(fā)制定快速、高效且適合中國(guó)國(guó)情的檢測(cè)方法。本研究中，利用三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，建立了能同時(shí)檢測(cè)水產(chǎn)品中7種麻醉劑的前處理方法和高靈敏度、抗基質(zhì)干擾、高準(zhǔn)確性和高穩(wěn)定性的三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀(GC-MS/MS)檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)儀器：氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀(Agilent公司)、氮吹儀(Organomation公司)、渦旋混合器(IKA公司)、超純水器(Milliporeco公司)、離心機(jī)(湘儀公司)和電子天平(METTLER公司)。

試驗(yàn)試劑：丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚標(biāo)準(zhǔn)品(Dr.Ehrenstorfer公司)，乙酸丁香酚酯、甲基異丁香酚、三卡因標(biāo)準(zhǔn)品(CNW公司)，乙酸異丁香酚酯標(biāo)準(zhǔn)品(Chroma Dex公司)，3-氨基苯甲酸甲酯內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(TCI公司)，丁子香酚-D3內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(Accu Standard公司)、Silica 500 mg/6 cc、PRiME HLB 200 mg/6 cc、HLB 500 mg/6 cc、MCX 60 mg/3 cc固相萃取柱(Waters公司)，Dispersive SPE(Agilent公司，15 mL)，Cleanert MAS-Q(迪馬公司)；乙腈、正己烷、乙酸乙酯和丙酮為色譜純，無(wú)水硫酸鈉為分析純(經(jīng)550 ℃干燥4 h)，所有用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(1 mg/mL)：準(zhǔn)確稱取丁香酚、甲基丁香酚、異丁香酚、三卡因、甲基異丁香酚、乙酸丁香酚酯、乙酸異丁香酚酯、丁香酚-D3、3-氨基苯甲酸甲酯7種標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，分別用乙腈溶解后定容至10 mL，配制成1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，置于冰箱(-18 ℃)中冷藏保存。

標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液(10.0 μg/mL)：準(zhǔn)確吸取7種麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成10.0 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)稀釋溶液，置于冰箱(4 ℃)中冷藏保存。

內(nèi)標(biāo)稀釋溶液(10.0 μg/mL)：準(zhǔn)確吸取兩種麻醉劑內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備溶液各100 μL，用乙腈定容至10 mL，配制成10.0 μg/mL內(nèi)標(biāo)稀釋溶液，置于冰箱(4 ℃)中冷藏保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液，用乙酸乙酯與乙腈的混合液(體積比為3∶2)稀釋，使標(biāo)準(zhǔn)品終濃度為1、5、10、25、50、75、100 μg/L，內(nèi)標(biāo)濃度均為10.0 μg/L，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 前處理方法 參照GB/T 30891—2014采樣方法[12]，稱取5.00 g樣品，置于50 mL離心管中，準(zhǔn)確加入1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，再依次加入5 g無(wú)水硫酸鈉、10 mL正己烷及兩粒陶瓷均質(zhì)子，渦旋混勻1 min，超聲提取15 min，以8000 r/min離心5 min，取上清液至干凈離心管中，殘?jiān)? mL正己烷重復(fù)提取1次，合并上清液，待固相萃取凈化。

將樣品提取液全部加入硅膠柱(6 mL正己烷活化)中，控制流速小于0.5 mL/min，用2 mL正己烷淋洗，抽干后加8 mL乙酸乙酯洗脫，收集液體在低于45 ℃條件下，用氮?dú)獯抵? mL，然后用乙腈定容至5 mL，渦旋混合1 min，過0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，濾液供GC-MS/MS測(cè)定。

1.2.3 儀器條件

GC條件：載氣為高純氦氣(99.9995%)，恒流流速為1.5 mL/min；進(jìn)樣口溫度為280 ℃,傳輸線溫度為260 ℃；升溫程序?yàn)槌跏紲囟葹?0 ℃, 保持0.5 min，然后以8 ℃/min升至152 ℃，保持0 min，再以2 ℃/min升至160 ℃, 并保持0 min, 最后以60 ℃/min升至270 ℃，保持4 min；進(jìn)樣方式為不分流，進(jìn)樣體積為1.0 μL；色譜柱為HP-5MS UI毛細(xì)管柱(30 m×0.320 mm×0.25 μm)。

MS-MS條件：離子源為EI源，離子源溫度為230 ℃；離子化能量為70 eV；溶劑延遲為5.0 min；四級(jí)桿溫度為150 ℃；淬滅氣為高純氦氣，2.25 mL/min；碰撞氣(用于MRM)為高純氮?dú)猓?.5 mL/min。

在選定的色譜條件下，通過分析7種麻醉劑標(biāo)準(zhǔn)溶液的單桿全掃描(MS1 Scan)質(zhì)譜得到每種物質(zhì)的總離子流圖，選擇質(zhì)荷比(m/z)和相對(duì)豐度較高的一級(jí)碎片為目標(biāo)化合物的母離子，確定保留時(shí)間和前級(jí)離子；在產(chǎn)物離子掃描(Product Ion)模式下，設(shè)定合適的碰撞電壓，使目標(biāo)物母離子與碰撞氣體(高純氮?dú)?進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)解離，進(jìn)一步裂解產(chǎn)生碎片離子得到二級(jí)質(zhì)譜圖，分別選取豐度較強(qiáng)且基質(zhì)干擾較小的碎片離子作為定量和定性子離子；選擇電子轟擊離子源多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)，進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量，使特征碎片離子產(chǎn)生的離子對(duì)強(qiáng)度均達(dá)到最大，各目標(biāo)物最佳參數(shù)見表1。

表17種麻醉劑及其內(nèi)標(biāo)的離子監(jiān)測(cè)參數(shù)

Tab.1Monitoringparametersofionsandinternalcompoundsin7anesthetics

化合物compound保留時(shí)間/minretention time 前級(jí)離子質(zhì)荷比precursor ion產(chǎn)物離子質(zhì)荷比product ion碰撞能量/VCE丁香酚 Eugenol7.86164.0131.0*12164.0104.015丁香酚-D3 Eugenol-D37.86167.0131.0*12167.0103.025甲基丁香酚 Methyl eugenol8.56178.0107.0*18178.0147.073-氨基苯甲酸甲酯3-Aminobenzoic acid methyl9.18151.0120.0*12151.092.025異丁香酚 Isoeugenol9.27164.1131.0*12164.1104.115三卡因 MS-22210.34165.0120.0*20165.093.012甲基異丁香酚 Methyl isoeugenol9.98178.1147.18178.1107.1*18乙酸丁香酚酯 Eugenyl acetate10.47206.0164.02164.0149.0*8乙酸異丁香酚酯 Acetisoeugenol12.14206.0148.9*22164.0149.110

注：*為定量離子

Note: *denotes quantitative ions

2 結(jié)果與分析

2.1 總離子流圖

在“1.2.3”節(jié)儀器條件下，魚肉加標(biāo)樣品的總離子流圖如圖1所示，13 min內(nèi)所有目標(biāo)化合物均已出峰，目標(biāo)化合物不僅達(dá)到完全分離，峰形良好，且在目標(biāo)物出峰處無(wú)雜質(zhì)干擾。因此，可選擇三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用法。

圖1 MRM模式下魚肉加標(biāo)樣品總離子流圖Fig.1 TIC of derivatives in 7 anesthetic residues in fish by MRM mode

2.2 線性關(guān)系和檢出限、定量限

在“1.2.3”節(jié)儀器條件下，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣分析，以目標(biāo)物濃度(x)為橫坐標(biāo)，其峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)(表2)，其相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，說(shuō)明0～100 μg/L 范圍內(nèi)7種麻醉劑的濃度和峰面積線性關(guān)系良好。

表2 魚肉中7種麻醉劑線性回歸方程及其相關(guān)系數(shù)Tab.2 Linear equations and R2 in 7 anesthetics in fish

依據(jù)定性、定量離子色譜峰的信噪比(S/N)大于3為檢出限(LOD)，以S/N大于10為定量限(LOQ)，確定本方法中7種麻醉劑的檢出限為2.0 μg/kg，定量限為5.0 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度及精密度

在空白樣品中添加待測(cè)物，使之理論含量為5.0、10.0、50.0 μg/kg，經(jīng)上述試驗(yàn)步驟處理后，對(duì)3個(gè)水平進(jìn)行回收率測(cè)試(表3)，每個(gè)濃度平行測(cè)定6次，分別考察3 d，以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)計(jì)算批內(nèi)和批間精密度。結(jié)果表明，此方法的回收率為73.93%～119.97%，且相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差滿足GB/T 27404—2008[13]要求，說(shuō)明其準(zhǔn)確度和精密度較高，可以滿足日常檢測(cè)需求。

2.4 實(shí)際樣品分析

用上述方法分別檢測(cè)市售鮮活淡水魚、蝦類(包括黑魚、鯽、草魚、河蝦等)和海水魚、蝦、貝、蟹類(包括鱈、黃魚、多寶魚、石斑魚、斑節(jié)蝦、花蛤、梭子蟹等)35個(gè)樣品，考察試驗(yàn)結(jié)果，其中一批草魚、兩批鱈、一批長(zhǎng)江回魚、一批金鯧魚和一批千島湖鯽共6批次樣品中檢出丁香酚類麻醉劑，檢出率為17.1%，最高殘留量達(dá)298 μg/kg(長(zhǎng)江回魚)；MS-222均未被檢出。

3 討論

3.1 凈化方法的選擇

丁香酚類微溶于水而易溶于有機(jī)溶劑[14]，MS-222易溶于水[15]，兩種類型麻醉劑的理化特性完全不同，同時(shí)提取凈化是個(gè)難點(diǎn)。本試驗(yàn)中考察了不同萃取方式，結(jié)果表明，采用HLB小柱凈化后6種丁香酚類化合物均損失嚴(yán)重，MS-222的回收率偏低；6種丁香酚類化合物在MCX小柱的回收率優(yōu)于HLB小柱，但結(jié)果偏低；采用PRiME HLB小柱和硅膠柱處理后，6種丁香酚類化合物回收率可以滿足檢測(cè)要求，但是MS-222經(jīng)PRiME HLB小柱處理后損失較大；而采用硅膠柱對(duì)所有目標(biāo)物都有較好的保留；此外，嘗試Dispersive SPE和Cleanert MAS-Q兩種不同分散固相萃取方法，回收率均可以滿足要求，但是后期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分散固相萃取方法的凈化效果沒有硅膠柱好，因此，本試驗(yàn)的前處理采用硅膠柱進(jìn)行富集凈化。

3.2 色譜柱的選擇

參照相關(guān)資料，并考慮方法的通用性，本試驗(yàn)中選用甲基聚硅氧烷固定相的DB-5MS毛細(xì)管色譜柱，7種麻醉劑在該色譜柱的分離效果如圖2所示，丁香酚、異丁香酚和MS-222出現(xiàn)明顯的拖尾，且化合物出峰時(shí)間集中在4 min內(nèi)，分離效果不理想；而改用HP-5MS UI毛細(xì)管柱后，在相同儀器條件下，目標(biāo)物的峰寬均小于0.12 min，拖尾現(xiàn)象得到改善，基線噪音顯著降低，目標(biāo)化合物峰形對(duì)稱且其分離度和靈敏度均有所提高。故本試驗(yàn)中最終采用HP-5MS UI毛細(xì)管柱。

表3 魚肉中7種麻醉劑的回收率和精密度(相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差)Tab.3 Recoveries and repeatability (RSD) of 7 anesthetics in fish %

圖2 不同色譜柱中7種麻醉劑的色譜圖Fig.2 Chromatograms of 7 anesthetic residues by different columns

3.3 儀器方法的選擇

目前，國(guó)內(nèi)已報(bào)道的檢測(cè)方法中，僅檢測(cè)單一種類的丁香酚類化合物[16]，主要有液相色譜法[17-18]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[20-21]。對(duì)于MS-222殘留檢測(cè)，較常見的是液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[22-23]和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[10]。本試驗(yàn)中采用三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜分析方法，7種目標(biāo)物和兩種內(nèi)標(biāo)在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式下的質(zhì)譜圖見圖3。

本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)比對(duì)了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氣質(zhì)聯(lián)用法和三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用法的檢測(cè)效果。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法僅適用于MS-222殘留檢測(cè)，而丁香酚類由于揮發(fā)性太強(qiáng)、沸點(diǎn)低，在液質(zhì)上碎片離子較小容易受干擾，檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定。用氣質(zhì)聯(lián)用法能同時(shí)分析7種麻醉劑，但檢出限較高，基質(zhì)干擾明顯。丁香酚和其同位素內(nèi)標(biāo)丁香酚-D3打碎后得到了相同特征碎片離子，由于保留時(shí)間相同，在氣質(zhì)中無(wú)法區(qū)分，而在三重四級(jí)桿氣質(zhì)中，兩物質(zhì)的前級(jí)離子不同，即使其產(chǎn)物離子和保留時(shí)間均一致，也可以完全區(qū)分開；此外，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采用分段多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，根據(jù)目標(biāo)物出峰時(shí)間分成4段，縮短掃描所需的循環(huán)時(shí)間，使每個(gè)峰上得到的數(shù)據(jù)點(diǎn)數(shù)增多，大大提高了分析通量，確保了結(jié)果的穩(wěn)定性和靈敏度，7種麻醉劑檢出限均可達(dá)到2 μg/kg，而使用普通氣質(zhì)聯(lián)用法時(shí)丁香酚檢出限為5 μg/kg[24]。

◆表示前級(jí)離子；△▲表示產(chǎn)物離子Note:◆，precursor ion；△▲，product ion圖3 MRM模式下7種麻醉劑及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜圖Fig.3 Mass spectrum of 7 anesthetic residues and internal compounds by MRM mode

4 結(jié)論

本試驗(yàn)中基于氣相色譜聯(lián)用三重四級(jí)桿質(zhì)譜分析技術(shù)，建立的GC-MS/MS檢測(cè)方法，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，根據(jù)保留時(shí)間、特征離子及其豐度對(duì)比，可對(duì)魚蝦等水產(chǎn)品中7種麻醉劑同時(shí)進(jìn)行篩選、定量和確證，具有靈敏度高、抗基質(zhì)干擾、高準(zhǔn)確性和高穩(wěn)定性的特點(diǎn)，能滿足水產(chǎn)品中丁香酚類和MS-222麻醉劑殘留量的檢測(cè)要求，對(duì)保障消費(fèi)者的健康，維護(hù)中國(guó)水產(chǎn)品的正常進(jìn)出口貿(mào)易具有一定的意義。