基于毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用的PTEN缺失誘導(dǎo)代謝重編程研究

王志超 劉 靜 樸海龍*

1(中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 大連 116023)2(中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

1 引 言

前列腺癌(Prostate cancer，PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一，致死率在所有男性腫瘤中排第三[1]。盡管在早期前列腺癌患者中很少出現(xiàn)，但約60%的晚期前列腺癌患者存在染色體10q23缺失[2]。染色體10q23中起到重要抑癌作用的基因即PTEN(Phosphatase and tensin homolog)[3]。PTEN催化磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(Phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate，PIP3)去磷酸化，并生成磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(Phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate，PIP2)，進而抑制PI3K/AKT通路。PTEN缺失的前列腺癌患者常具有不良預(yù)后[4]。因此，研究PTEN缺失引起的細胞功能改變，可能發(fā)現(xiàn)潛在的治療靶點，并提供特異性治療PTEN缺失前列腺癌的手段。PTEN缺失調(diào)控細胞能量代謝，如β氧化[5]及谷胱甘肽代謝[6]。Naguib等發(fā)現(xiàn)PTEN缺失的細胞對線粒體復(fù)合物I抑制劑更敏感[7]，從而說明研究PTEN突變誘導(dǎo)的代謝變化對靶向治療PTEN缺失腫瘤有重要意義。

生物體內(nèi)的代謝物種類難以計數(shù)，僅Human Metabolome Database統(tǒng)計的存在或可能存在的代謝物已超過40000個[8]。在非靶向篩查生物大分子對代謝的影響中需要對生物體內(nèi)的代謝物進行系統(tǒng)性的分析。代謝組學(xué)(Metabolomics)是指“系統(tǒng)全面地對生物體系內(nèi)代謝物進行定性定量分析”[9]。目前，代謝組學(xué)檢測的主流技術(shù)為色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)及核磁共振法。根據(jù)色譜分離方式色譜可分為液相色譜、氣相色譜、毛細管電泳。代謝重編程是腫瘤細胞的一大特征[10]，其中廣泛存在著能量代謝的變化，而這些代謝物普遍具有強極性。毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用(CE-MS)彌補了其它色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對極性及中等極性代謝物分離差的缺點，可用于生物體內(nèi)極性及中等極性代謝物分析[11]。CE-MS的研究集中在接口技術(shù)的改進，接口技術(shù)主要分為鞘流接口和無鞘流接口[12]。鞘流接口具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點，但鞘流的稀釋使分析靈敏度降低。無鞘流接口具有更高的靈敏度，但穩(wěn)定性較低，目前仍在發(fā)展中[13]。

在特定遺傳背景下基因才能發(fā)揮特定功能，因此治療靶點的篩選需要在特定遺傳背景下進行。如Kim等發(fā)現(xiàn)CPS1(Carbamoyl phosphate synthetase-1)在KRAS/LKB1突變的肺癌細胞中調(diào)控嘧啶合成[14]，而維生素C只有在KRAS/BRAF突變的結(jié)直腸癌細胞中才能靶向GAPDH，并殺死細胞[15]。因此，基于代謝組學(xué)篩選潛在的治療靶點時需要考慮不同遺傳背景的影響。

為降低癌癥治療過程中的毒副作用，研究在正常細胞及癌細胞中PTEN缺失改變的不同代謝變化，并探究針對癌細胞中所特有的代謝變化，對臨床治療具有積極的指導(dǎo)意義。Chow等[16]在蛋白水平對PTEN在正常細胞及癌細胞中的不同功能作了系統(tǒng)描述，但在代謝物研究領(lǐng)域缺少相關(guān)研究。本研究采用CE-MS，通過比較前列腺癌細胞DU145與正常前列腺細胞RWPE1分別敲除PTEN后的代謝變化，闡釋PTEN調(diào)控的代謝重編程，并確定PTEN在腫瘤中引起的特異性的代謝變化。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

搭配電噴霧離子源(G1607A)的毛細管電泳(G7100A)-飛行時間質(zhì)譜(G6224A)系統(tǒng)(美國安捷倫公司)用于代謝組學(xué)分析。電泳分離采用熔融石英毛細管柱(50 μm i.d.× 80 cm，日本HMT公司)進行。

甲醇(色譜純，德國Merck公司); 氯仿(色譜純，韓國Duksan公司); 氨水(28%)、甲酸(≥95%)、乙酸銨(≥98%)、甘露醇(≥98%)購自美國Sigma公司; CE-MS所用內(nèi)標1(含10 mmol/L蛋氨酸砜、D-樟腦-10-磺酸鈉鹽)及內(nèi)標3(含10 mmol/L 3-氨基吡咯烷二鹽酸、N,N-二乙基-2-苯基乙酰胺、苯均三酸、3-萘酚-2,7-二磺酸鈉)購自日本HMT公司; RPMI 1640(C11875500BT)培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司); 胎牛血清(P30-3302，德國PAN公司); 超純水由Mili-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)制備。超濾管(5 kDa，美國Millipore公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1樣品制備及代謝物提取前列腺癌細胞DU145及正常前列腺細胞RWPE1購自美國ATCC(American Type Culture Collection)，均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。用于PTEN敲除的shRNA及空載體購自美國Sigma公司，序列為：CCGGAGGCGCTATGTGTATTATTATCTCGAGATAA-TAATACACATAGCGCCTTTTTT(TRCN0000002745)、CCGGACATTATGACACCGCCAAATTCTCGAGAATT-TGGCGGTGTCATAATGTTTTTTG(TRCN0000355946)。

分別在DU145、RWPE1兩種細胞系中構(gòu)建穩(wěn)定敲除PTEN的細胞系。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen，11668027，美國)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進細胞48 h后，在含0.5 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選。當(dāng)作為陰性對照的未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的同種細胞在0.5 μg/mL嘌呤霉素篩選中全部死亡時，篩選結(jié)束，得到穩(wěn)定低表達細胞系。

細胞培養(yǎng)至80%匯合度后進行代謝物提取。快速棄去培養(yǎng)基后，以5%甘露醇洗去殘留培養(yǎng)基，洗3次，每次10 mL。洗凈后，快速將培養(yǎng)皿投入液氮中進行淬滅。淬滅5 min后，在培養(yǎng)皿中加1 mL甲醇(含體積比1∶400的內(nèi)標1)，將細胞隨著甲醇刮下并轉(zhuǎn)移至5 mL Ep管中。渦旋30 s后，加入1 mL氯仿并繼續(xù)渦旋1 min。最后再加入0.4 mL水并渦旋1 min。冰上靜置10 min后，在4℃以15000 g離心15 min。每個樣品分別取兩份各0.45 mL上清液至超濾管中，4℃ 12000 g離心至上清液全部透過濾膜。濾液凍干，于-80℃保存。樣品測定時用20 μL超純水復(fù)溶(含體積比1∶200內(nèi)標3)。

2.2.2CE-MS分析儀器參數(shù)與文獻[11]相同，電泳參數(shù)：陽離子模式：流動相為1 mol/L甲酸，電泳電壓27 kV，進樣量為5 kPa壓力下進樣3 s(約3 nL); 陰離子模式：流動相為25 mmol/L乙酸銨(以氨水調(diào)至pH 8.5)，電泳電壓30 kV，并施加1.5 kPa的壓力，進樣量為5 kPa壓力下進樣25 s(約25 nL)。質(zhì)譜參數(shù)如下：霧化氣壓力(Nebulizer pressure)135.8 kPa，干燥氣溫度(Dry gas temperature)300℃，氮吹(Nitrogen flow)7 L/min，離子傳輸管電壓(Skimmer) 50 V，采集速度1.5/s，正負離子模式下毛細管電壓(Capillary voltage)分別為 4.0和3.5 kV，裂解電壓(Fragmentor)分別為105和125 V。

2.3 數(shù)據(jù)處理

使用安捷倫公司自帶軟件Quanlitative analysis(B.06.00)、Quantitative analysis(B.06.00)及HMT公司Method Maker軟件對數(shù)據(jù)進行定性和定量分析。具體步驟如下：(1)通過保留時間與質(zhì)荷比進行定性分析 HMT公司(日本)提供含1000個代謝物、內(nèi)標理論質(zhì)荷比及理論保留時間的數(shù)據(jù)庫。使用Method Maker軟件，通過代謝物及內(nèi)標理論保留時間、內(nèi)標實際保留時間計算在此內(nèi)標保留時間下代謝物理論保留時間。陽離子模式下使用內(nèi)標蛋氨酸砜、3-氨基吡咯烷二鹽酸、N,N-二乙基-2-苯基乙酰胺，陰離子模式下使用內(nèi)標D-樟腦-10-磺酸鈉鹽、苯均三酸、3-萘酚-2,7-二磺酸鈉。在Quantitative analysis軟件中，將此理論保留時間與代謝物實際時間進行比對，以偏差在±0.2 min以內(nèi)且質(zhì)荷比與理論值偏差在±0.01 Da的標準進行鑒定。(2)定量分析 定性分析后，導(dǎo)出定性的代謝物的峰面積數(shù)據(jù)，刪除在80%以上樣品中峰面積小于400的代謝物。代謝物峰面積使用對應(yīng)樣品所有代謝物的總峰面積校正，校正后的數(shù)據(jù)用于后續(xù)分析。使用GraphPad Prism 7(美國)進行繪圖及t檢驗。t檢驗中p<0.05的代謝物使用MetaboAnalyst(http://www.metaboanalyst.ca)[17]作熱圖及通路富集分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 PTEN缺失誘導(dǎo)的代謝重編程

通過與含1000個代謝物標樣的數(shù)據(jù)庫中保留時間及精確質(zhì)量數(shù)進行比對，實現(xiàn)了代謝物準確的定性分析。為考察分析方法對易降解物質(zhì)準確檢測的能力，CE-MS分析后，根據(jù)公式([ATP] + 0.5 × [ADP])/([AMP] + [ADP] + [ATP])(ATP，腺嘌呤核苷三磷酸; ADP，腺嘌呤核苷二磷酸; AMP，腺嘌呤核苷一磷酸)計算胞內(nèi)能荷，DU145、RWPE1兩種細胞中能荷均為0.96，達到正常生物體內(nèi)能荷水平[18]，表明在分析測試過程中易降解代謝物得到準確檢測。

圖1 PTEN誘導(dǎo)的代謝重編程。(A) DU145和RWPE1兩種細胞系中PTEN缺失改變的相同及不同的差異代謝物個數(shù)。相同的差異代謝物在DU145(B)及RWPE1(C)中變化熱圖。腺嘌呤核苷二磷酸(ADP)，天冬氨酸(Asp)Fig.1 Metabolic reprogramming induced by phosphatase and tensin homolog (PTEN) in DU145 and RWPE1 cells. (A) Common and specific differential metabolites number in two cell lines. Heatmaps of common metabolites changes in DU145 (B) and RWPE1 (C) after PTEN silencing. ADP, adenosine diphosphate; Asp, aspartate

采用CE-MS分析DU145和RWPE1兩種細胞系，分別定性得到200和214種代謝物。DU145和RWPE1敲除PTEN后相比對照細胞分別得到28種和37種差異代謝物，兩種細胞共同的差異代謝物有8種(圖1A和1B)。PTEN敲除后蘇糖酸(Threonic acid)顯著升高，異丁基肉堿(Isobutyrylcarnitine)、二磷酸腺苷(ADP)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-Glycolylneuraminic acid)、天冬氨酸(Asp)、亞?；撬?Hypotaurine)顯著下降，而甘磷酸膽堿(Glycerophosphocholine，GPC)、2-羥戊二酸(2-Hydroxyglutaric acid，2-HG)在兩種細胞中變化相反。

DU145細胞中2-羥戊二酸、甘磷酸膽堿在PTEN敲除后顯著升高，而在RWPE1細胞中則顯著下降(圖2)。

圖2 PTEN缺失引起的2-羥戊二酸(2-HG)及甘磷酸膽堿(GPC)變化：2-羥戊二酸在DU145(A)及RWPE1(B)中的變化; 甘磷酸膽堿在DU145(C)及RWPE1(D)中的變化。Fig.2 2-Hydroxyglutaric acid (2-HG) and glycerophosphocholine (GPC) changes in two independent PTEN shRNAs transduced cells. 2-HG changes in DU145 (A) and RWPE1 (B). GPC changes in DU145 (C) and RWPE1 (D). *, **, ***, **** represent p<0.05, p<0.01, p<0.001, p<0.0001, respectively. n=4. Data was normalized by average of control

在偏酸性或缺氧條件下，細胞通過酶(乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶)的非特異性催化合成L型2-羥戊二酸[19,20]。腫瘤細胞中普遍存在偏酸性或缺氧環(huán)境[21,22]，因此推測PTEN缺失后引起相關(guān)酶活性變化，但是只有在腫瘤細胞中才能通過酶的非特異性催化合成L-2-羥戊二酸，而在正常細胞中則不存在這種環(huán)境。在乳腺癌中，侵襲性更強的癌細胞有更高的甘磷酸膽堿[23,24]，但Stewart等[25]報道升高甘磷酸膽堿引起腫瘤轉(zhuǎn)移能力下降。結(jié)合前列腺癌中腫瘤細胞和正常細胞缺失PTEN后相反的甘磷酸膽堿變化，推測PTEN與其它基因共同作用調(diào)控甘磷酸膽堿，在不同遺傳背景下，甘磷酸膽堿引起的效應(yīng)不同。

綜上所述，PTEN缺失在腫瘤細胞中引起促癌代謝物2-羥戊二酸和甘磷酸膽堿的積累，而在正常細胞中反而引起兩種代謝物下降。

3.2 PTEN缺失在癌癥細胞中改變的特異性代謝重編程

20種代謝物在DU145細胞中敲除PTEN后有顯著差異，而在RWPE1中無顯著變化(圖1A)，即這20種差異代謝物為特定腫瘤遺傳背景下PTEN缺失誘導(dǎo)的。20種差異代謝物如表1所示。對這20種差異代謝物進行通路富集分析發(fā)現(xiàn)，硫胺(維生素B1)代謝途徑(Thiamine metabolism)及谷胱甘肽代謝途徑(Glutathione metabolism)變化最為顯著(圖3A)。

兩種代謝途徑均涉及硫代謝并調(diào)節(jié)細胞內(nèi)還原勢。PTEN敲除后維生素B1升高，而硫胺素焦磷酸降低(圖3B)。維生素B1作為多種因子的輔酶能夠促進腫瘤增殖及增強對化療的抗性，且腫瘤會更多的從體內(nèi)攝取維生素B1[26]。谷胱甘肽代謝途徑從半胱氨酸合成谷胱甘肽，DU145中PTEN缺失后半胱氨酸、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)下降(圖3C)，還原型谷胱甘肽與氧化型谷胱甘肽比值(GSH/GSSG)上升(圖3D)。谷胱甘肽合成前體半胱氨酸下降、GSH/GSSG上升可能是由于谷胱甘肽合成速度加快，但半胱氨酸來源不足。PTEN缺失后GSH/GSSG上升，說明細胞內(nèi)氧化壓力降低。谷胱甘肽可維持細胞內(nèi)還原勢，增加腫瘤細胞對化療的抵抗性[27]。Lien等報道激活PI(3)K/Akt通路促進谷胱甘肽合成通路上調(diào)，并增強對氧化壓力抵抗能力[6]。

表1 DU145中PTEN缺失后改變的特有差異代謝物

Table 1 Specific metabolites changes in DU145 induced by PTEN

化合物名稱Name變化倍數(shù) RatioshPTEN1shPTEN2顯著性 p valueshPTEN1shPTEN2辛基肉堿 Octanoylcarnitine0.860.324.15×10儊26.54×10儊6乙酰神經(jīng)氨酸 N-Acetylneuraminic acid0.790.581.24×10儊37.26×10儊5甘油酸 Glyceric acid0.620.604.31×10儊31.48×10儊3黃素單核苷酸 FMN0.640.611.30×10儊58.78×10儊6氧化型谷胱甘肽 GSSG0.850.654.50×10儊38.62×10儊5煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 NADP+0.840.653.53×10儊22.55×10儊3肌肽 Carnosine0.710.673.85×10儊23.50×10儊3硫胺素焦磷酸 Thiamine diphosphate0.780.743.75×10儊29.78×10儊3半胱氨酸 Cys0.650.795.05×10儊31.97×10儊2煙酸腺嘌呤二核苷酸 Deamido-NAD+0.230.833.04×10儊81.02×10儊3維生素B1 Thiamine1.541.193.24×10儊51.36×10儊2谷氨酸-谷氨酸二肽 Glu-Glu1.131.273.22×10儊21.72×10儊3肌酸酐 Creatinine1.181.321.53×10儊42.22×10儊5吡哆醇 Pyridoxine1.251.361.83×10儊29.76×10儊5N8-精胺 N8-Acetylspermidine1.851.431.30×10儊43.89×10儊21-磷酸核糖 Ribose 1-phosphate1.281.687.26×10儊41.65×10儊2丁基肉堿 Butyrylcarnitine1.151.991.78×10儊23.07×10儊5N-乙酰谷氨酸 N-Acetylglutamic acid1.512.083.73×10儊44.37×10儊3鳥苷 Guanosine1.804.574.07×10儊31.15×10儊5XA0055*1.221.482.44×10儊29.71×10儊3*表示確定為代謝物,但未定性出結(jié)果。*Means that it is authenticated metabolite, but not identified.

圖3 DU145中特有的PTEN缺失改變的代謝變化：(A)通路富集分析DU145中特有的PTEN缺失誘導(dǎo)的代謝變化; (B)硫胺代謝通路中的差異代謝物; (C)谷胱甘肽通路中的差異代謝物; (D)DU145中PTEN誘導(dǎo)的GSH/GSSG比例變化Fig.3 Metabolites changes induced by PTEN and specific in DU145. (A) Pathway enrichment analysis of the changed metabolites specific in DU145; (B) Metabolites changes in thiamine metabolism pathway; (C) Metabolites changes in glutathione metabolism pathway; (D) Ratio changes of GSH/GSSG induced by PTEN. *, **, ***, **** represent p<0.05, p<0.01, p<0.001, p<0.0001, respectively. n=4. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADP+). Data was normalized by average of control

肌酸酐(Creatinine)在PTEN缺失后升高(圖4A)。血清中肌酸酐上升預(yù)示前列腺癌發(fā)病幾率上升[28]。肌肽(Carnosine)在PTEN缺失后降低(圖4B)。肌肽通過降低缺氧誘導(dǎo)因子1表達起到抗增殖的作用[29]。有研究表明，乙酰神經(jīng)氨酸(N-Acetylneuraminic acid)上調(diào)可以作為頭頸部癌及非小細胞肺癌的標志物[30,31]，但本研究中PTEN突變后乙酰神經(jīng)氨酸下降(圖4C)。

圖4 DU145中特有的PTEN缺失改變的代謝變化中與腫瘤診斷或預(yù)后相關(guān)的代謝物： (A)肌酸酐; (B)肌肽; (C)乙酰神經(jīng)氨酸Fig.4 Cancer diagnosis and prognosis related metabolites changes induced by PTEN and specific in DU145. (A) Creatinine; (B) Carnosine; (C) N-Acetylneuraminic acid. *, **, ***, **** represent p<0.05, p<0.01, p<0.001, p<0.0001, respectively. n=4. Data is normalized by average of control

4 結(jié) 論

通過對前列腺癌細胞系DU145及正常前列腺細胞系RWPE1分別敲低PTEN后進行CE-MS分析，研究了PTEN在癌細胞及正常細胞中生物學(xué)功能的異同。PTEN缺失引起的代謝變化中DU145所特有的為L-2-羥戊二酸、甘磷酸膽堿、維生素B1、GSH/GSSG等。這些代謝物或比值在PTEN缺失的DU145細胞中均上升，進而對腫瘤細胞增殖、侵襲、抗化療都有促進作用。這些變化只出現(xiàn)在PTEN缺失的前列腺腫瘤細胞DU145，而并未出現(xiàn)在PTEN缺失的正常前列腺細胞RWPE1中，因此推測癌細胞中PTEN可通過特定的代謝物含量改變促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展。但是，PTEN與其它腫瘤相關(guān)基因的相互作用有待進一步研究。