熊維 彭曦 黃海艷

【摘要】 目的：觀察脈沖染料激光（PDL）對增生性瘢痕的預(yù)防及治療的有效性，比較治療前后的瘢痕組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad3基因的表達(dá)情況，探討PDL治療增生性瘢痕的機制。方法：以兔耳增生性瘢痕模型為研究對象，檢查上皮化后和增生性瘢痕形成后PDL治療對瘢痕的瘢痕增生指數(shù)（SEI）、瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞密度、膠原纖維面積、細(xì)胞凋亡、膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值以及TGF-β1、Smad3表達(dá)的改變情況。結(jié)果：上皮化后創(chuàng)面接受PDL治療后，SEI、成纖維密度指標(biāo)、膠原纖維面積均保持平穩(wěn)低水平（P>0.05）;細(xì)胞凋亡率隨天數(shù)增加明顯上升（P<0.05）;膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值、TGF-β1、Smad3表達(dá)均無明顯改變（P>0.05）。瘢痕形成后接受PDL治療，SEI、成纖維密度指標(biāo)、膠原纖維面積、膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值、TGF-β1、Smad3表達(dá)隨天數(shù)增加均呈下降趨勢（P<0.05）;細(xì)胞凋亡率隨天數(shù)增加明顯上升（P<0.05）。結(jié)論：PDL治療通過下調(diào)TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)，促進瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防及改善瘢痕增生。

【關(guān)鍵詞】 增生性瘢痕 脈沖染料激光 轉(zhuǎn)化生長因子-β1

[Abstract] Objective： To observe the effectiveness of pulsed dye laser （PDL） in the prevention and treatment of hypertrophic scar， compare the expression of transformed growth factor-β1 （TGF-β1） and Smad3 genes in scar tissue before and after treatment， and explore the mechanism of PDL in the treatment of hypertrophic scar. Method： The rabbit ear hypertrophic scar model was studied， check after the epithelium and hyperplastic scar formation after PDL to treat the scar of scar elevation index （SEI）， fibroblast density in scar， collagen fiber area， cell apoptosis， and collagen Ⅰ/Ⅲ ratio and TGF-β1， Smad3 expression change. Result： After PDL treatment， SEI， fibroblast density index and collagen fiber area remained stable and low （P>0.05）， apoptosis rate increased significantly with the number of days （P<0.05）， and there were no significant change in collagen Ⅰ/Ⅲ ratio， TGF-β1 and Smad3 expression （P>0.05）. After receiving PDL treatment after scar formation， SEI， fibroblast density index， collagen fiber area， collagen Ⅰ/Ⅲ ratio， TGF-β1 and Smad3 expression showed a decreasing trend with the number of days （P<0.05）， and apoptosis rate increased significantly with the number of days （P<0.05）. Conclusion： Pulsed dye laser therapy can down-regulate the expression of TGF-β1/Smad3 signaling pathway and promote the apoptosis of fibroblasts in scar， thereby preventing and improving scar hyperplasia.

[Key words] Hypertrophic scars Pulsed dye laser Translation growth factor β 1

First-authors address： Peking University Shenzhen Hospital， Shenzhen 518036， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.35.006

增生性瘢痕是一種影響器官功能、美觀、心理健康、生活社交的疾病。其產(chǎn)生與多種因素有關(guān)，治療方法多樣，療效不一[1-2]。目前瘢痕的發(fā)病機制不明確、治療手段多樣但效果均有限，是皮膚科及整形科的難題之一。探究其發(fā)病原因和機制，尋求理想的防治方法是目前基礎(chǔ)研究和臨床實踐中的緊迫課題。近年來，國內(nèi)外報道了多種激光設(shè)備對增生性瘢痕具有良好的療效，而最常見的激光設(shè)備是脈沖染料激光（PDL）[3-4]。因此，本研究以兔耳增生性瘢痕模型為研究對象，觀察PDL對增生性瘢痕的預(yù)防及治療的有效性，比較治療前后的瘢痕組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）、Smad3基因的表達(dá)情況，探討PDL治療增生性瘢痕的機制。

1 材料與方法

1.1 兔耳瘢痕造模與分組 參考文獻[5-6]的方法，構(gòu)建兔耳增生性瘢痕模型，簡單敘述如下：2019年2-6月選取20只新西蘭大耳兔，兔齡2～3個月，性別不限，體重1.5～2.0 kg，采用氯胺酮肌注麻醉后，在兔雙耳腹側(cè)各做4處直徑為1 cm的全層皮膚及軟骨膜缺損切口，切口之間間距2 cm以上，共計160個切口。術(shù)后予以常規(guī)自然愈合，正常飼養(yǎng)。待術(shù)后2周，所有創(chuàng)面愈合（即上皮化）后，隨機選取10只入上皮化實驗;剩余10只待術(shù)后3周瘢痕形成，入瘢痕實驗。上皮化實驗分為對照1組（CON-1組）和PDL-1組，瘢痕實驗分為對照2組（CON-2組）和PDL-2組。兩實驗各自的組間比較采用同一只實驗兔左右耳自身對照，即CON-1組：n=10，PDL-1組：n=10，CON-2組：n=10，PDL-2組：n=10。

1.2 治療方案與取材 PDL治療參數(shù)設(shè)置如下：能量5.5～8.5 J/cm2;脈寬0.5～2.0 ms;頻率1 Hz;光斑5～7 mm。PDL-1組創(chuàng)面處與PDL-2組增生瘢痕處分別接受2次PDL治療，2次治療之間間隔2周。關(guān)于取材方案，在上皮化實驗中，在上皮化后PDL治療前和上皮化后2周（第14天）、4周（第28天）分別切取兩組增生性瘢痕，共計取材120處，其中60處用于組織學(xué)分析，60處用于RNA和蛋白表達(dá)分析。瘢痕實驗取材方案與上皮化實驗相同。

1.3 觀察指標(biāo) （1）瘢痕增生指數(shù)（scar elevation index，SEI）：計算公式為SEI=（瘢痕厚度-正常兔耳厚度）/正常兔耳厚度;當(dāng)SEI>1.6，認(rèn)為存在明顯瘢痕，提示瘢痕增生模型成功。（2）瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞密度：采用HE染色法對瘢痕進行細(xì)胞學(xué)分析，按照HE染色試劑盒（武漢谷歌生物科技公司，G1005）步驟操作。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察瘢痕塊的組織結(jié)構(gòu)和成纖維分布，計算成纖維細(xì)胞密度，具體方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算出視野內(nèi)成纖維細(xì)胞數(shù)目，求出與視野面積的比值，并算出5個視野的平均成纖維細(xì)胞密度值。（3）膠原纖維面積百分比：采用Masson染色法對瘢痕進行膠原纖維形成情況分析，按照Masson染色試劑盒（Servicebio，G1006）步驟操作。在普通光學(xué)顯微鏡下觀察瘢痕塊的膠原纖維形成和分布，計算膠原纖維面積百分比，具體方法如下：在瘢痕切片的中央和四周共選取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0軟件計算出視野內(nèi)藍(lán)染的膠原纖維面積，求出該面積與組織總面積的比值，即膠原纖維面積百分比，并算出5個視野的平均膠原纖維面積百分比。（4）細(xì)胞凋亡率：采用TUNEL法評估瘢痕組織內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，按照TUNEL染色試劑盒（羅氏，11684817910）步驟操作。凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈現(xiàn)淡棕色至深棕黃色顆粒。高倍鏡下，每張切片隨機選取3個陽性細(xì)胞最多的視野進行計數(shù)，計算凋亡細(xì)胞率（凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)），取3個視野的均數(shù)。（5）Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白比值：采用western blot法，檢測瘢痕組織中Ⅰ型及Ⅲ型膠原蛋白的含量，采用灰度值法計算兩者含量的比值。（6）TGF-β1、Smad3基因的mRNA表達(dá)水平：提取瘢痕組織內(nèi)的總RNA，采用RT-PCR方法，進行40個循環(huán)擴增，GAPDH為內(nèi)參基因，采用靶基因量=2-??Ct公式計算TGF-β1、Smad3基因mRNA水平，采用比較Ct值方法以內(nèi)參相對定量靶基因表達(dá)水平。引物設(shè)計如下：TGF-β1：（F）5‘-TGGAACGGGCTCAACATCTACAC-3，（R）5‘-AATGTACAGCTGCCGCACAC-3;Smad3：（F）5‘-CAGCGACCACCAGATGAAC-3，（R）5‘-AGGAGATGGAGCACCAGAAT-3;GAPDH：（F）5‘-ACCACAGTCCATGCCTACAC-3，（R）5‘-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 12.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用（x±s）表示，兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，多組數(shù)據(jù)比較采用One-Way ANOVA分析;計量資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兔耳瘢痕增生指數(shù)變化情況 在上皮化實驗部分，CON-1組瘢痕組織內(nèi)SEI隨著天數(shù)增加而呈上升趨勢（P<0.05），而PDL-1組SEI保持平穩(wěn)低水平，未出現(xiàn)明顯上升（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天，PDL-1組的SEI均較相同時間點的CON-1組顯著下降（P<0.05）。見表1。在瘢痕實驗部分，CON-2組瘢痕組織內(nèi)SEI隨著天數(shù)增加維持平高水平（P>0.05），而PDL-2組SEI隨天數(shù)增加呈現(xiàn)下降趨勢（P<0.05）;此外，術(shù)后第14、28天，PDL-2組的SEI均較相同時間點的CON-2組顯著下降（P<0.05）。見表2。

2.2 瘢痕內(nèi)成纖維密度變化情況 在上皮化實驗部分，CON-1組瘢痕組織內(nèi)成纖維密度指標(biāo)隨著天數(shù)增加而呈上升趨勢（P<0.01），而PDL-1組成纖維密度指標(biāo)保持平穩(wěn)水平，未出現(xiàn)明顯上升（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天，PDL-2組的成纖維密度指標(biāo)均較相同時間點的CON-1組顯著下降（P<0.05）。見表3。在瘢痕實驗部分，CON-2組瘢痕組織內(nèi)成纖維密度指標(biāo)隨著天數(shù)增加保持平穩(wěn)水平（P>0.05），而PDL-2組成纖維密度指標(biāo)隨天數(shù)增加呈現(xiàn)下降趨勢（P<0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-2組的成纖維密度指均較相同時間點的CON-2組顯著下降（P<0.05）。見表4。

2.3 瘢痕內(nèi)膠原纖維面積變化情況 在上皮化實驗部分，CON-1組瘢痕組織內(nèi)膠原纖維面積百分比隨著天數(shù)增加而呈上升趨勢（P<0.01），而PDL-1組膠原纖維面積保持平穩(wěn)水平，未出現(xiàn)明顯上升（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-1組的膠原纖維面積百分比均較相同時間點的CON-1組顯著下降（P<0.05）。見表5。在瘢痕實驗部分，CON-2組瘢痕組織內(nèi)膠原纖維面積百分比隨著天數(shù)增加保持平穩(wěn)水平（P>0.05），而PDL-2組膠原纖維面積百分比隨天數(shù)增加呈現(xiàn)下降趨勢（P<0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-2組的膠原纖維面積百分比均較相同時間點的對照組顯著下降（P<0.05）。見表6。

2.4 瘢痕內(nèi)細(xì)胞凋亡檢測結(jié)果 在上皮化實驗部分，CON-1組瘢痕組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率隨著天數(shù)增加無明顯變化（P>0.05），而PDL-1組細(xì)胞凋亡率隨天數(shù)增加明顯上升（P<0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-1組的細(xì)胞凋亡率均較相同時間點的CON-1組顯著上升（P<0.05）。見表7。在瘢痕實驗部分，CON-2組瘢痕組織內(nèi)細(xì)胞凋亡率隨著天數(shù)增加無明顯變化（P>0.05），而PDL-2組細(xì)胞凋亡率隨天數(shù)增加明顯上升（P<0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-2組的細(xì)胞凋亡率均較相同時間點的CON-2組顯著上升（P<0.05）。見表8。

2.5 瘢痕組織中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ表達(dá)情況 在上皮化實驗部分，CON-1組瘢痕組織內(nèi)膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值隨天數(shù)增加逐漸上升（P<0.05），而PDL-1組膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值隨天數(shù)增加無明顯改變（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-1組的Ⅰ/Ⅲ比值較相同時間點的CON-1組均顯著下降（P<0.05）。在瘢痕實驗部分，PDL-2組膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值隨天數(shù)增加明顯下降（P<0.05）;而CON-2組膠原蛋白Ⅰ/Ⅲ比值隨天數(shù)增加無明顯改變（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-2組的Ⅰ/Ⅲ比值較相同時間點的CON-2組均顯著下降（P<0.05）。見圖1和表9、10。

2.6 TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)情況 在上皮化實驗部分，CON-1組瘢痕組織內(nèi)TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)隨天數(shù)增加均逐漸上升（P<0.05），而PDL-1組TGF-β1、Smad3表達(dá)隨天數(shù)增加均無明顯改變（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-1組的TGF-β1、Smad3表達(dá)較相同時間點的CON-1組均顯著下降（P<0.05）。見表11。在瘢痕實驗部分，PDL-2組TGF-β1、Smad3表達(dá)隨天數(shù)增加均明顯下降（P<0.05）;而CON-2組TGF-β1、Smad3表達(dá)隨天數(shù)增加均無明顯改變（P>0.05）;此外，術(shù)后第14、28天時，PDL-2組的TGF-β1、Smad3表達(dá)較相同時間點的CON-2組均顯著下降（P<0.05）。見表12。

3 討論

瘢痕是人體組織創(chuàng)傷修復(fù)過程中不可避免的產(chǎn)物，但瘢痕組織的外觀或功能嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量。病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，目前已成為世界性的問題[7-8]。隨著激光技術(shù)的發(fā)展，多種激光設(shè)備都被嘗試著用于治療增生性瘢痕和瘢痕疙瘩。目前，已有大量的報道包括動物實驗及臨床研究證實，多種激光設(shè)備對增生性瘢痕有治療作用。PDL 585 nm是針對血管治療的激光，以抑制瘢痕血管為主[9-11]。Kuo等[12]研究證實，PDL可減少TGF-β的表達(dá)，從而抑制成纖維細(xì)胞的增殖與分裂，減少膠原沉積。朱玉等[13]驗證不同治療周期PDL照射均可抑制兔耳增生性瘢痕成纖維細(xì)胞的增殖過程，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且1周治療組與2周治療組兩組無明顯差異。在臨床研究中，McCraw等[14]應(yīng)用PDL 585 nm激光治療創(chuàng)口瘢痕后，瘢痕快速變軟，紅色消退，更接近正常膚色，取得了良好的療效。同樣Liew等[15]應(yīng)用PDL 585 nm激光于深度傷創(chuàng)面上，每3周1次，可有效預(yù)防增生性瘢痕，且無明顯副作用。本研究以兔耳增生性瘢痕模型為對象，探索了PDL對增生性瘢痕的預(yù)防及治療效果，明確上皮化后的創(chuàng)面早期接受PDL治療，可抑制其向增生性瘢痕轉(zhuǎn)化;當(dāng)瘢痕形成后接受PDL治療，可有效改善瘢痕增生程度。

TGF-β是目前公認(rèn)的與創(chuàng)傷密切相關(guān)的細(xì)胞因子之一，也是與瘢痕疙瘩形成密切相關(guān)的最具代表性的細(xì)胞因子，其異常表達(dá)會促進病理性瘢痕的形成[16-17]。TGF-β1高表達(dá)可刺激大量成纖維細(xì)胞增殖和合成膠原、彈力蛋白、纖維結(jié)合蛋白、粘蛋白等ECM成分，同時抑制膠原降解，使膠原的合成和降解不平衡[18]。TGF-β1分泌后與受體連接，激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其中Smad信號通路是研究最多的信號傳導(dǎo)途徑[19-20]。本研究結(jié)果推測，PDL治療通過下調(diào)TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)，促進瘢痕內(nèi)成纖維細(xì)胞凋亡，從而預(yù)防及改善瘢痕增生。而對于PDL調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號通路預(yù)防及改善瘢痕增生的結(jié)論，本研究僅進行了相關(guān)性研究，未來將進行進一步嚴(yán)謹(jǐn)?shù)墓δ茉囼炓则炞C該機制。

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（收稿日期：2019-08-12） （本文編輯：張爽）