李 斌 劉旭敏 肖澤濤 韓 堯 王冬梅 郭書賢

(南陽理工學院生物與化學工程學院；河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室，南陽 473004)

微生物油脂是除了植物油脂和動物油脂之外的又一油脂資源[1]，是由真菌、細菌或微藻等產油微生物利用糖類、烴類和一般油脂作為碳源，并配合氮源和無機鹽輔助因子在特定情況下產生的物質。從德國科學家首次發(fā)現產油微生物以來，科學家們從未停止研究。20世紀80年代，新西蘭、日本、英國、法國等對一些高產γ-亞麻酸、花生四烯酸的微生物進行了大規(guī)模生產，并將一些發(fā)酵產品投入市場。90年代后，研究的重點都在如何獲取功能性油脂上。隨后，科學家們發(fā)現大部分微生物生產的油脂在脂肪酸組成上與植物油脂類似，以 C16、C18脂肪酸為主，均富含飽和、低度不飽和長鏈脂肪酸，這使得微生物油脂有潛力成為生物柴油的生產原料[2]。利用木質纖維素生產油脂不僅可以獲得作為新油源的微生物油脂，而且有助于解決農業(yè)廢棄物問題。木質纖維素含有纖維素、半纖維素和木質素，另外還有少量的灰分、蛋白質、淀粉等成分組成[3-4]。木質纖維素里能水解成被利用的糖是纖維素和半纖維素，而木質素的結構會降低對纖維素和半纖維素的利用，因此木質纖維素材料要進行預處理才能打破木質素的結構，提高對木質纖維素的利用率[5-9]。纖維素水解是將預處理獲得的纖維素經水解轉化為單糖，才能夠被產油酵母利用。木質纖維素水解較難，影響其水解的因素主要有結晶度、木質素對纖維素的保護作用、物料特性及半纖維素對纖維素的包裹[10-14]。以木質纖維素為原料，經粉碎后稀酸水解得到發(fā)酵液，并進一步脫毒處理可用于油脂酵母的利用[15-17]。因此，對水解技術和脫毒技術要有進一步的研究。能源短缺和環(huán)境污染是人類當今面臨的兩大難題，因傳統(tǒng)能源消耗大、污染嚴重、發(fā)展新型清潔的可再生能源已成為全球關注的熱點[18]。從土壤中分離篩選出的TrichosporondermatisZZ-46可同步利用葡萄糖和木糖生產油脂，通過本次研究也將真正探索出酵母菌利用木質纖維素產油脂發(fā)酵的規(guī)律所在，以便提高生產效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株

TrichosporoncutaneumCGMCC2.571購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，TrichosporondermatisZZ-46河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術重點實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

YEPD培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，酵母粉10 g，蛋白胨10 g，水1 000 mL，pH自然，121 ℃飽和蒸汽滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖70 g，酵母粉0.75 g，NH4Cl 0.1 g，KH2PO411.8 g，K2HPO43.7 g，CaCl2·H2O 40 mg，MgCl21.0 g，CaCl240 mg，FeSO4·7H2O 5.5 mg，ZnSO4·7H2O 1.0 mg，Na2SO40.1 g，MnSO4·4H2O 0.76 mg，濃H2SO40.001 84 mg，檸檬酸5.2 mg，水1 000 mL，pH 5.8～6.0，在121 ℃飽和蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：木質纖維素稀酸水解液脫毒后，在121 ℃飽和蒸汽壓下滅菌20 min。在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中用水解液代替1 000 mL水及總糖(其余同基礎發(fā)酵培養(yǎng)基)作為發(fā)酵培養(yǎng)基。

1.1.3 實驗試劑

酵母粉(BR)、蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、檸檬酸(AR)、NH4Cl (AR)、KH2PO4(AR)、濃鹽酸(AR)、濃硫酸(AR)、纖維素酶(酶活力15 000.0 U/g)、木聚糖酶(酶活力15 000.0 U/g)等：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2G超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；HZQ-B大型恒溫搖床：蘇州威爾實驗用品有限公司；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；TDL-40B離心機：上海安亭科學儀器廠；752N紫外-可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 水解液的制備

將小麥秸稈和甘蔗渣按1∶1的質量比稱取樣品25 g，置于三角瓶中，加入1%的稀硫酸(固液比1∶6)，121 ℃下水解60 min。取出水解后的樣品，加入蒸餾水(固液比1∶4)，待樣品冷卻到常溫后，用NaOH調節(jié)pH值為5.0。再加入MgCl20.137 5 g，吐溫0.375 mL，纖維素酶2.00 g/100 g，木聚糖酶2.00 g/100 g。密封，置于45 ℃下水浴振蕩48 h后，離心，抽濾。

1.3.2 脫毒方法

Ca(OH)2法：將水解液放入燒杯中，60 ℃水浴保溫，用Ca(OH)2粉末調節(jié)pH至10～11，抽濾，得濾液，H3PO4調節(jié)pH到6.0，抽濾，得濾液[19]。

活性炭吸附法：按固液比1∶5向水解液中加入活性炭，28 ℃搖床中(120 r/min)下振蕩60 min，過濾活性炭后得濾液[20]。

混合脫毒法：將以上兩種脫毒方法混合使用，進行脫毒處理。

1.3.3 培養(yǎng)方法1.3.3.1 菌種活化

TrichosporoncutaneumCGMCC2.571、TrichosporondermatisZZ-46劃線接種至YEPD固體斜面培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.3.3.2 搖瓶種子液的培養(yǎng)

活化后的菌體接兩環(huán)于YEPD液體種子培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min培養(yǎng)36 h。

1.3.3.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

取培養(yǎng)36 h的種子液，按10%接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)5 d，每間隔12 h測定生物量、油脂產量、殘?zhí)荹19]。

1.3.4 測定方法1.3.4.1 OD值(采用光電比濁法)

取適量培養(yǎng)液，將樣液稀釋至OD值在0.2～0.8范圍，用分光光度計在660 nm下測定光密度值[21]。

1.3.4.2 總糖的測定(苯酚-硫酸法)

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖標準品0.050 0 g，以蒸餾水定容至500 mL，配制成100 μg/mL葡萄糖標準溶液。精確量取100 μg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL于8支10 mL比色管中，各加蒸餾水補至2.0 mL，依次加入6%苯酚1 mL，濃硫酸5 mL，搖勻，70 ℃水浴中加熱20 min后冷卻至室溫，測定490 nm吸光度。以糖濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[22]。樣品液稀釋一定濃度后，取2 mL，按上述步驟操作，根據標準曲線計算總糖含量。

1.3.4.3 殘?zhí)菧y定(DNS法)

精密稱取烘干至恒重的葡萄糖標準品100 mg，以蒸餾水定容至100 mL，配制成1 mg/mL葡萄糖標準溶液。精確量取1 mg/mL葡萄糖標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于7支25 mL具塞試管中，各加蒸餾水補至2.0 mL，分別加入DNS試劑2.0 mL，搖勻，沸水浴5 min顯色，冰水冷卻至室溫，分別加入9.0 mL蒸餾水，搖勻，測定540 nm處吸光度值(A)。以第一支試管作為空白對照，以葡萄糖含量為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線[22]。

1.3.4.4 發(fā)酵液中糠醛含量的測定

精確稱取糠醛，用蒸餾水配制0、0.5、1.0、1.5、2.5、3.0、4.0 μg/mL標準溶液，測定 276 nm吸光度。以糠醛濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[23]。

1.3.4.5 油脂的提取及含量測算(磷酸香草醛法)

搖瓶培養(yǎng)皮狀絲孢酵母TrichosporoncutaneumCGMCC2.571發(fā)酵液，使用酸熱法提取油脂，收集得到氯仿層，旋轉蒸發(fā)，得液體石蠟。取5個100 mL容量瓶，精確吸取不同劑量皮狀絲孢酵母液體油脂0.02、0.016、0.012、0.01、0.008 g，配置濃度為0.2、0.16、0.12、0.1、0.08 g/L的油脂樣品(溶劑為1∶2的乙醇∶正己烷)。取6根試管，其中5支試管加入配好的皮狀絲孢酵母油脂樣品各1 mL，1支加入蒸餾水，作為空白對照。把這6支試管放入沸水浴中，蒸干后加入2 mL98%硫酸，混勻，置于90 ℃水浴加熱20 min，取出后在冰水浴中冷卻至室溫。加入0.25 g/L香草醛磷酸溶液3 mL，搖勻，室溫反應20 min，在530 nm處測定吸光度。以油脂含量為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖[24]。

1.3.4.6 菌體生物量測定(細胞干重法)

量取一定體積的待測發(fā)酵液V(mL)于已稱重的7 mL的離心管(m1，g)中，8 000 r/min離心5 min。下層沉淀用蒸餾水洗滌3次后，8 000 r/min離心5 min，棄上清，下層沉淀放入鼓風干燥箱中105 ℃烘干至恒重，干燥器中自然冷卻至室溫后稱總重量(m2，g)。菌體生物量以細胞干重(m，g/L)表示，計算公式[19]如下：

m=(m2-m1)×1 000/V

1.3.4.7 發(fā)酵動力學研究

為了研究產油脂酵母的生長、底物消耗以及產物生成的動力學特征，每隔12 h取樣測定殘?zhí)橇?S，g/L)、菌體生物量(X，g/L)及油脂產量(P，g/L)，計算菌體的比生長速率μ(h-1)、底物比消耗速率Qs(h-1)和油脂比生成速率Qp(h-1)，得到μ、Qs、Qp隨發(fā)酵時間t(h)的變化規(guī)律，根據菌體生物量、油脂產量及殘?zhí)橇康脑鰷p，計算其動力學參數，進行發(fā)酵動力學分析[19]。

1.3.4.8 油脂脂肪酸組成及相對含量的分析

樣品甲酯化[25]：取樣品油 0.1 g，加入0.5 mol/L KOH-甲醇溶液2 mL，于65 ℃水浴中皂化30 min，加入BF3-乙醚溶液(1∶1)0.2 mL，再在65 ℃水浴中甲酯化5 min，取出，迅速冷水冷卻，加入石油醚2 mL，振蕩，靜置20 min，吸取上清液0.3～0.5 μL作為氣相色譜的進樣樣品。

氣相色譜檢測條件：色譜柱是FFAP石英毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.4 μm)，柱溫190 ℃，氣化溫度230 ℃，檢測器(FID)溫度230 ℃，載氣(N2)流速41 mL/min，燃氣(H2)流速33 mL/min，助燃氣(空氣)流速100 mL/min，分流比∶20∶1，進樣量為1 μL。

不飽和脂肪酸指數(IUFA)=1×單烯酸質量分數/%+2×二烯酸質量分數/%+3×三烯酸質量分數/%+……+n×n烯酸質量分數/%。

定性方法：將測得的樣品色譜圖各峰的保留時間與脂肪酸標準品的保留時間作比較，確定樣品色譜圖各峰的性質。

定量方法：面積歸一法。由于相同質量脂肪酸甲酯各組分在FID檢測器上的響應值接近，不引入定量校正因子，各組分含量按下式計算：P=Ai/ ∑Ai×100%

式中：P表示組分的相對質量分數/%，Ai表示組分的峰面積，∑Ai表示各組分的峰面積總和。

2 結果與分析

2.1 不同脫毒方法下糠醛含量的檢測

根據糠醛標準曲線y=0.186 8x+0.006 4(R2=0.999 7)計算得不同脫毒方法下糠醛的含量見表1。由表1可知，混合脫毒法脫毒效果較好，糠醛含量最低。因此，優(yōu)先采用氫氧化鈣與活性炭混合脫毒法進行纖維素水解液原液的脫毒處理，以防有毒物質對產油酵母的生長產生抑制作用。

表1 不同脫毒方法下糠醛含量的檢測

2.2 ZZ-46在脫毒與未脫毒水解液中產油脂能力的比較

將TrichosporondermatisZZ-46接種在脫毒水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基與未脫毒水解液的發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵120 h后，計算其油脂產量，比較TrichosporondermatisZZ-46在脫毒與未脫毒水解液中發(fā)酵產油脂的能力，結果見表2：

表2 ZZ-46利用不同水解液發(fā)酵產油能力

根據皮狀絲孢酵母油脂的磷酸香草醛顯色法標準曲線公式y(tǒng)=3.325 7x-0.095 4(R2=0.999 2)進行計算，結果顯示產油酵母在脫毒水解液中長勢較好，且生物量達到18.502 g/L，油脂質量分數達到36.71%，而未脫毒水解液中菌體生物量是13.751 g/L，油脂質量分數為34.24%。所以，TrichosporondermatisZZ-46菌株在脫毒水解液中產油能力要高于未脫毒水解液。

圖1 ZZ-46在不同水解液發(fā)酵120h的光學顯微鏡照片

由圖1可以看出，TrichosporondermatisZZ-46菌株培養(yǎng)120 h后，在脫毒水解液中菌體生物量和產油能力明顯高于未脫毒水解液。

2.3 ZZ-46利用水解液發(fā)酵過程的研究

利用混合脫毒的水解液，添加適合TrichosporondermatisZZ-46生長所需的微量元素營養(yǎng)物質，在25 ℃，120 r/min的條件下進行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次，測定其生物量、油脂產量和殘?zhí)橇俊?/p>

表3 ZZ-46利用脫毒水解液發(fā)酵產油情況

由表3可知，隨著時間的增加，菌體生物量、油脂產量逐漸增大，殘?zhí)橇恐饾u減少。油脂含量在120 h后上升平緩，在144 h達到最高峰37.29%。菌體生物量前36 h變化都比較緩慢，在36～96 h才有明顯升高，菌體生長旺盛，處于對數生長期。96 h后，由于對數生長期細胞的大量繁殖，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質消耗，有害物質逐漸積累，菌體生物量增長變緩，菌體生長趨于穩(wěn)定。120 h后，由于發(fā)酵液的黏度增大使通氧受限、營養(yǎng)物質的缺乏以及有毒抑制物的存在等不利因素的影響，使其發(fā)酵過程減慢，菌體開始進入減速期?？梢姡罴雅囵B(yǎng)時間為120 h。

圖2 ZZ-46在不同時期的光學顯微鏡照片

由圖2可知，TrichosporondermatisZZ-46菌株在培養(yǎng)初期，細胞呈圓桿狀，隨著培養(yǎng)時間的延長，細胞形狀逐漸變成橢圓形，細胞內逐漸產生1～4個脂肪球，有的多于4個，脂肪球較大，占細胞體積比例也較大。培養(yǎng)120 h后，菌體生物量、油脂產量無明顯區(qū)別，菌體生長趨于穩(wěn)定。因此，最佳培養(yǎng)時間為120 h。

2.4 ZZ-46發(fā)酵動力學參數分析

為了探討ZZ-46的生長、底物消耗、產物生成特征，在 25 ℃，120 r/min的條件下利用混合脫毒的水解液進行發(fā)酵培養(yǎng)，每隔12 h取樣測定菌體生物量X、殘?zhí)橇縎及油脂產量P，計算菌體利用水解液中還原糖的比生長速率μ、底物比消耗速率Qs和油脂比生成速率Qp，得到μ、Qs和Qp隨發(fā)酵時間的變化規(guī)律，結果如圖3所示。

由圖3可知：在培養(yǎng)前12 h，菌體比生長速率μ和總底物比消耗速率Qs迅速增長，在12～24 h期間達到最大值。同時，油脂比生成速率Qp增長不大。這說明此時菌體大量繁殖消耗營養(yǎng)物質，而幾乎不積累油脂。此后，菌體比生長速率μ和總底物比消耗速率Qs則迅速降低，油脂比生成速率快速增長，在72～84 h期間達到最高，84 h之后比較穩(wěn)定，說明此時細胞內開始積累油脂。隨著時間延長，120 h后菌體生長進入減速期，生長產油能力逐漸減退。

圖3 ZZ-46發(fā)酵產油脂的μ、Qs、Qp變化曲線

2.5 ZZ-46在脫毒水解液中產油脂的脂肪酸組成分析

由表4分析可知：ZZ-46菌株利用木質纖維素脫毒水解液產生的菌油以油酸為主，其次為棕櫚酸、亞油酸，三種脂肪酸約占總脂肪酸的81.58%。其中，油酸含量占36.2%、棕櫚酸含量占22.77%、亞油酸含量占22.61%。ZZ-46不飽和脂肪酸指數(IUFA)也比較高，大于85%，還能形成一部分多不飽和脂肪酸，這些脂肪酸具有一定的保健功能和對某些疾病有一定的治療效果等[26]。

圖4 脂肪酸標準品的氣相色譜圖譜

表4 ZZ-46在脫毒水解液發(fā)酵培養(yǎng)基中產油脂肪酸組成分析

種類月桂酸C12∶0豆蔻酸C14∶0棕櫚酸C16∶0棕櫚油酸C16∶1硬脂酸C18∶0油酸C18∶1亞油酸C18∶2亞麻酸C18∶3未知IUFA%ZZ-460.060.8722.771.4612.6436.2022.611.162.2386.36

3 結論

3.1 通過對不同脫毒方法下水解液中糠醛含量的測定，確定了氫氧化鈣+活性炭混合脫毒法為最佳方法。其中，原水解液糠醛含量為1.565 μg/mL，氫氧化鈣、活性炭、混合脫毒法脫毒后糠醛含量分別為：0.397、0.135、0.032 2 μg/mL?；旌厦摱痉啡┖孔畹?，優(yōu)先選用混合脫毒法進行脫毒處理。

3.2 在研究ZZ-46利用木質纖維素水解的發(fā)酵產油脂能力時，隨著時間的延長，菌體生物量、油脂產量逐漸增大，油脂含量在120 h左右趨于穩(wěn)定。同時，殘?zhí)橇恐饾u減少，直至達到0.934 g/L。菌體生物量前36 h變化都比較緩慢，在36～96 h才有明顯升高，菌體生長旺盛，處于對數生長期。96 h后，由于對數生長期細胞的大量繁殖，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質消耗，有害物質逐漸積累，菌體生物量增長變緩，菌體生長趨于穩(wěn)定。120 h后，由于發(fā)酵液的黏度增大使通氧受限、營養(yǎng)物質的缺乏以及有毒抑制物的存在等不利因素的影響，使其發(fā)酵過程減慢，菌體開始進入減速期?？梢?，最佳培養(yǎng)時間為120 h。

3.3 由發(fā)酵生長動力參數可得：菌株的底物消耗與菌體生長同步，屬于與菌體生長相關型，而油脂積累則屬于與菌體生長部分相關型。

3.4 ZZ-46菌株利用木質纖維素脫毒水解液產生的菌油不飽和脂肪酸含量較高。