五味子乙素對香煙煙霧提取物和脂多糖損傷的肺上皮細胞干預作用研究①

胡素珍黎宛妍敖然張大鵬張志敏

(廣州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院，廣州510030)

五味子乙素(Schisandrin B，Sch B)是中藥五味子[Schisandra chinesis(Turcz.)Baill]木脂素類主要活性成分之一。多種研究表明，Sch B具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、抗心肌缺血、保肝利膽等生物活性[1，2]。慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以進行性、不完全可逆性氣流受限和肺部炎性病變?yōu)橹饕卣鞯穆苑尾考膊?，具有反復發(fā)作、進行性發(fā)展的特點。其發(fā)病機制雖未完全清楚，但與煙霧或有害氣體和顆粒引起的肺部或全身的炎癥反應有關，炎癥反應過程進一步可引起COPD急性發(fā)作(Acute exacerbation chronic obstructive pulmonary disease，AECOPD )，因此控制和減輕AECOPD 患者局部或全身的炎癥反應對提高療效具有重要意義。本實驗以體外培養(yǎng)的人肺泡上皮細胞A549為研究對象，在體外成功建立了CSE聯合LPS誘導A549細胞COPD急性加重期模型，以A549細胞相關增殖抑制、mRNA水平、蛋白水平為評價指標，初步探討Sch B對CSE聯合LPS對A549細胞炎癥損傷及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 肺上皮細胞A549由廣州醫(yī)科大學國家重點實驗室提供。

1.1.2藥物及試劑 五味子乙素購自成都曼思特生物科技有限公司；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基、0.25 mg/ml 胰蛋白酶(美國Gibco)；青-鏈霉素雙抗(×100)、PBS(×1)(吉諾生物醫(yī)藥技術公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Sigma)；RT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；NF-κB Pathway sampler Kit、GAPDH抗體(Cell Signaling Technology)；IL-8、COX-2 ELISA試劑盒(武漢華美)。

1.1.3儀器及耗材 CO2培養(yǎng)箱( Thermo，311 型，美國)； 超凈工作臺( ESCO，新加坡)；熒光定量PCR儀( 7500，ABI，美國)；高速冷凍離心機(Allegra X-22，BECKMAN，R美國)；倒置顯微鏡(IX71，Olympus，日本)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 將肺上皮細胞A549用含10%胎牛血清、1%雙抗(青霉素100 U/ml、鏈霉素100 U/ml)的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下進行細胞培養(yǎng)，隔天更換新鮮培養(yǎng)基，待細胞融合70%～80%時，以0.25%胰酶消化，用于傳代或種板。

1.2.2體外制備COPD急性加重期細胞模型(CSE聯合LPS) 香煙煙霧提取物的制備 香煙為“紅雙喜”牌香煙(廣東中煙工業(yè)有限責任公司，焦油量11 mg；煙堿量1.2 mg；一氧化碳量13 mg)，5 ml無血清的RPMI1640培養(yǎng)基裝入2個串聯的氣體采樣管(大包氏管)內作為吸收液，點燃去掉過濾嘴的香煙，采集香煙主流煙霧。大包氏管一端連接香煙，另一端連接50 ml注射器，以50 ml/min的速度吸煙2支，每支煙吸10次，然后將該溶液pH值調整為7.40，并用0.22 μmol/L 濾孔直徑的濾膜過濾，去除細菌和顆粒，制備成100%CSE溶液[3,4]。根據實驗需要稀釋成不同梯度濃度。30 min內用于實驗。脂多糖(Lipoplysaccharide,LPS)使用終濃度為0.4 μg/ml。與CSE共同加入肺上皮細胞中作用 24 h 制備COPD急性加重期體外模型。

1.2.3細胞分組 細胞共分為4組，即空白對照組(CON)、模型組(CSE+LPS)、低劑量Sch B組(5 μmol/L)、高劑量Sch B組(20 μmol/L)[5,6]。當細胞生長至適合造模和給藥時，CON用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，模型組給予4% CSE聯合0.1 μg/ml LPS，給藥組除造模外給予相應劑量Sch B。收集細胞或上清，檢測相關指標。

1.2.4MTT法測定細胞活性 各組細胞培養(yǎng)至相應時間后，每孔加MTT溶液(5 mg/ml，用PBS配制，pH調整為7.4)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內培養(yǎng)上清液，每孔加150 μl DMSO，脫色搖床振蕩10 min，使結晶物充分溶解，選擇570 nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度值(OD)并分析存活率，存活率=OD給藥組/OD對照組×100%。

1.2.5熒光定量PCR法檢測相關因子表達 各組細胞培養(yǎng)至相應時間后，吸棄上清，用預冷PBS(×1)溶液洗3次，然后加入1 ml Trizol，具體操作按試劑盒說明書進行，用紫外分光光度計測定總RNA的A260 nm、A280 nm，計算RNA樣品的濃度和純度，A260 nm/A280 nm在1.9～2.1之間視為合格。cDNA合成按照Prime ScriptTMRTreagent kit 說明書操作，總RNA取樣2 μg,為有效地反轉錄全長mRNA。qPCR反應體系20 μl，擴增條件為95℃ 30 s 預變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個循環(huán)，每份樣品做復孔檢測。IL-8上游引物CCACCGGAGCACTCCATAAG，下游引物GATGGTTCCTTCCGGTGGTT；COX-2上游引物GTTCCACCCGCAGTACAGA，下游引物AGGGCTTCAGCA-TAAAGCGT；GAPDH上游引物GAAAGCCTGCCGGTGACTAA，下游引物AGGAAAAGCATCACCCGGAG。mRNA相對表達量用比較CT值法計算，以基因GAPDH為內參，即用內參基因和靶基因CT值差(ΔΔCT)計算靶基因相對內參基因的表達量(2-ΔΔCT)，然后與對照組比較，計算實驗組mRNA的相對表達量(RNA relative quantity)。

1.2.6ELISA檢測相關指標 各組細胞培養(yǎng)至相應時間后，收集細胞上清，1 000 rcf,4℃,離心15 min取上清進行檢測。具體操作步驟：將ELISA試劑盒中各種試劑移至室溫(18～25℃)平衡至少30 min，按各自試劑配制方法配制試劑以備用；加樣：分別設標準品孔、待測樣本孔。每孔分別加標準品或待測樣本100 μl，輕輕晃動混勻，覆上板貼，37℃溫育2 h；棄去液體，甩干，不用洗滌；每孔加生物素標記抗體工作液100 μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干，洗板3次。每次浸泡2 min，200 μl/孔，甩干；每孔加辣根過氧化物酶標記親和素工作液100 μl，覆上新的板貼，37℃溫育1 h；棄去孔內液體，甩干，洗板5次。每次浸泡2 min，200 μl/孔，甩干；依序每孔加底物溶液90 μl，37℃避光顯色15～30 min；依序每孔加終止液50 μl，終止反應；在反應終止后5 min內用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的光密度。

1.2.7免疫印跡實驗(WB)法檢測磷酸化蛋白水平 各組細胞培養(yǎng)至相應時間后，吸棄細胞上清，用冰凍PBS(×1)清洗3次，RIPA裂解液冰上裂解30 min，12 000 r/min，4℃離心20 min,取上清，BCA 法檢測蛋白濃度，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，GAPDH,NF-κB，pNF-κB抗體(1∶2 000)孵育4℃過夜，TBST(×1)洗滌，10 min/次，3次，鼠抗兔IgG二抗孵育1 h，TBST(×1)洗滌，10 min/次，3次，化學顯影，檢測蛋白表達。以GAPDH 為內參照計算相對灰度值，進行統(tǒng)計學分析。

2 結果

2.1五味子乙素抑制CSE聯合LPS誘導的肺上皮細胞增殖 首先用1～60 μmol/L Sch B作用肺上皮細胞A549 48 h，觀察Sch B對肺上皮細胞的直接抑制作用。結果見圖1A。結果表明，不同濃度的Sch B均對A549細胞增殖有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性(P<0.05)。其次用4%CSE聯合0.1 μg/ml LPS作用A549細胞24 h后，制備COPD急性加重期模型，見圖1B。結果表明，CSE聯合LPS能夠明顯促進肺上皮細胞增殖，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B后，逆轉了4% CSE聯合0.1 μg/ml LPS對細胞的過度增殖作用，與模型組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.2五味子乙素抑制CSE聯合LPS處理肺上皮細胞IL-8、COX-2 mRNA的表達 用4% CSE聯合0.1 μg/ml LPS作用A549細胞24 h后，采用熒光定量PCR法檢測細胞IL-8、COX-2 mRNA水平，見圖2A、B。結果表明，CSE聯合LPS能夠促進細胞中IL-8、COX-2的表達水平，與正常組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05，P<0.01)。分別加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B 作用72 h后，IL-8、COX-2的mRNA水平明顯降低，特別是20 μmol/L的Sch B作用更加明顯，與模型組比較差異具有明顯的統(tǒng)計學意義。

2.3五味子乙素減少CSE聯合LPS對A549細胞上清IL-8、COX-2的含量 用4% CSE聯合0.1 μg/ml LPS作用A549 細胞24 h后，采用ELISA法檢測細胞上清IL-8、COX-2的含量，見圖3。結果表明，CSE聯合LPS能夠增加細胞上清IL-8、COX-2的含量，與正常組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)；分別加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B 48 h后，細胞上清IL-8的含量均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01，P<0.05)，且成一定的劑量依賴性。分別加入5 μmol/L和20 μmol/L的Sch B 48 h后，細胞上清COX-2的含量均明顯減少，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.05)。

2.4五味子乙素下調CSE聯合LPS對A549細胞磷酸化NF-κB蛋白水平 用4% CSE聯合0.1 μg/ml LPS作用A549細胞24 h后，用蛋白印跡法檢測細胞磷酸化NF-κB蛋白水平，見圖4。結果表明，CSE聯合LPS能夠上調A549細胞磷酸化NF-κB蛋白水平，與正常組比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)； 分別給予5 μmol/L和20 μmol/L Sch B處理48 h后，A549細胞磷酸化NF-κB蛋白水平明顯下調，其中以20 μmol/L 的Sch B作用更為明顯。

圖1 Sch B抑制CSE聯合LPS誘導的肺上皮細胞增殖Fig.1 Sch B inhibits proliferation of lung epithelial cells induced by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05,***.P<0.01；compared with model group,#.P<0.01.

圖2 Sch B抑制CSE聯合LPS處理肺上皮細胞IL-8(A)、COX-2(B)mRNA的表達Fig.2 Sch B inhibits expression of IL-8(A) and COX-2(B)mRNA in lung epithelial cells induced by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05,***.P<0.01；compared with model group,#.P<0.05；ns.No statistical difference.

圖3 Sch B減少CSE聯合LPS對A549細胞上清IL-8(A)、COX-2(B)含量Fig.3 Sch B reduces content of IL-8(A) and COX-2(B) in supernatant of A549 cells by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05，***.P<0.01;compared with model group,#.P<0.05.

圖4 Sch B下調CSE聯合LPS對A549細胞磷酸化NF-κB蛋白水平Fig.4 Sch B down-regulates phosphorylation of NF-κB protein in A549 cells by CSE combined with LPSNote: Compared with control group,**.P<0.05;compared with model group,#.P<0.05.

3 討論

五味子，習稱“北五味子”，是木蘭科植物五味子的干燥成熟種子，是著名的滋補性中藥，功能收斂固澀，益氣生津，補腎寧心；臨床主要應用于久咳虛喘；夢遺滑精，遺尿尿頻；久瀉不止；自汗，盜汗；津傷口渴，內熱消渴；心悸失眠?，F代藥理研究表明，五味子的主要活性成分是木脂素類，而Sch B是五味子木脂素的主要活性成分之一[7，8]。據報道，Sch B具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老、保肝利膽等作用[9-12]。其中，Sch B抗炎作用已被用于哮喘，支氣管擴張，慢性阻塞性肺氣腫等疾病的治療。對Sch B抗炎作用及機制的研究，有助于更加合理有效地運用Sch B以及開發(fā)五味子的臨床應用。

COPD是一種以進行性、不完全可逆性氣流受限和肺部炎性病變?yōu)橹饕卣鞯穆苑尾考膊?，具有反復發(fā)作、進行性發(fā)展的特點[13]。各種有害氣體和顆粒是誘發(fā)肺部炎性病變的主要原因，可引起COPD急性發(fā)作及加重病情。AECOPD過程中釋放的炎癥介質，可導致一系列的生理、病理變化，急性加重期可反復發(fā)作和漸進發(fā)展，導致病情逐步加重，引起呼吸衰竭，甚至危及生命。

AECOPD的病因及發(fā)病機制尚未完全清楚，目前研究認為氣道和肺組織對香煙、煙霧、職業(yè)性粉塵等有害氣體或有害顆粒所引起的異常炎性反應具有密切的關系。研究認為，有害氣體或有害顆?？梢酝ㄟ^其毒性損傷、氧化應激等方式引發(fā)氣道的異常炎癥反應。單香煙而言，其煙霧含有500多種化學物質組成的高毒性復雜混合物，如尼古丁、一氧化碳、甲醛、乙醛、丙烯醛、苯酚和氰化物等有害成分。香煙煙霧暴露可激活并聚集氣道及肺泡的炎性反應細胞，使其釋放多種炎性反應遞質及細胞因子，破壞氣道和肺的結構，進一步促進炎性反應，造成氣管狹窄、不完全堵塞，導致COPD的發(fā)生[14]。

LPS是細菌內毒素的主要成分之一，可以刺激組織細胞，進而釋放出多種炎癥介質(包括細胞因子和趨化因子等)，誘導炎癥反應，是常用的細胞炎癥模型的造模工具。已有多項研究采用香煙煙霧提取物聯合LPS制備COPD急性加重期體外模型[15]，本研究結果也表明，香煙煙霧提取物聯合LPS模型組細胞數明顯增加，細胞炎癥水平升高，與正常組比較具有統(tǒng)計學意義，說明CSE聯合LPS可造成肺上皮細胞炎癥性損傷，體外損傷模型制備成功。

IL-8和環(huán)氧合酶-2(COX-2)是重要的炎癥介質[16，17]，是參與AECOPD炎癥反應過程的重要因子，大量文獻報道研究表明，在AECOPD的炎癥反應過程中，IL-8和COX-2水平是上調的，給予相應濃度的藥物后，可以下調IL-8和COX-2的水平[18，19]，本研究也表明，給予五味子乙素后，能夠下調IL-8、COX-2的基因和蛋白水平，與其他人的研究結果相一致。

核因子-κB(Nuclear factor kappa B，NF-κB)，是一類可與免疫球蛋白κB輕鏈基因增強子特異性結合的核蛋白因子，廣泛存在于真核細胞中，是一種重要的核轉錄因子，激活后能夠調控多種與細胞生長、生存、凋亡等相關的轉錄因子，參與細胞的炎癥反應、免疫反應、增殖、凋亡等生理活動。研究發(fā)現，NF-κB在正常組織和癌旁組織中不表達或者微表達，并且處于激活和失活的平衡狀態(tài)，從而使細胞處于生理平衡狀態(tài)，維持正常的生理功能。但在病理情況下，NF-κB往往處于高表達狀態(tài)。已有研究表明，香煙提取物可以明顯上調肺上皮細胞NF-κB信號通路[20]，下調磷酸化NF-κB蛋白水平，可能是COPD急性發(fā)作期的一種治療策略。本實驗提取了肺上皮A549細胞總蛋白，分別檢測細胞中總的以及磷酸化NF-κB的表達水平。結果表明CSE聯合LPS模型組磷酸化NF-κB表達水平增加，說明NF-κB通路參與了COPD炎癥反應過程，通過調控這條信號通路，有望在COPD的發(fā)展過程中，減少或抑制炎癥介質的釋放，從而改善COPD的炎癥微環(huán)境，降低COPD的發(fā)病[21]。本研究結果也證實，給予五味子乙素后，A549細胞磷酸化NF-κB蛋白表達水平明顯下調，表明五味子乙素可能在COPD急性發(fā)作期有一定的治療價值。

總之，采用CSE聯合LPS誘導肺上皮細胞A549炎癥損傷，以此建立COPD急性加重期細胞模型，并同時給予五味子乙素干預。本研究結果表明五味子乙素能夠抑制CSE聯合LPS誘導的肺上皮細胞的過度增殖，抑制模型細胞的炎癥因子表達，顯示具有較好的抗炎作用，其機制可能是通過調控NF-κB信號通路，下調與炎癥密切相關的IL-8、COX-2等的表達，從而改善炎癥微環(huán)境有關。本研究結果也與其他研究者發(fā)現的五味子乙素具有的抗炎以及抗氧化的結果相一致[22]。