西酞普蘭對(duì)小鼠角膜上皮細(xì)胞和淚膜功能的影響*

閔幼蘭 ，劉佳祥 ，賀贏 ，馬明洋 ，徐曉瑋 ，姜楠 ，劉康成，袁晴 ，朱佩文，葉蕾 ，邵毅

（1.南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 眼科，江西 南昌 330006；2.廈門大學(xué) 眼科研究所，福建 廈門 361102）

隨著電子時(shí)代的到來(lái)，電子產(chǎn)品的使用越發(fā)頻繁，在提高生活質(zhì)量的同時(shí)也難以避免對(duì)身體健康造成威脅。過(guò)度使用電子產(chǎn)品，不僅影響睡眠，而且對(duì)眼表也會(huì)造成一定損害?？挂钟羲幬镂魈仗m對(duì)快動(dòng)眼睡眠有一定程度的抑制作用，從而可以治療抑郁癥，但有文獻(xiàn)報(bào)道[1]，其在發(fā)揮治療作用的同時(shí)也影響眼睛濕潤(rùn)度，進(jìn)而導(dǎo)致眼干燥癥（ophthalmoxerosis）。眼干燥癥是一種伴隨眼表癥狀的以淚膜穩(wěn)態(tài)喪失為特征的多因子疾病，近幾年發(fā)病率逐步上升，常見(jiàn)病因包括淚膜不穩(wěn)定、淚液高滲性、眼表炎癥與損傷、神經(jīng)感覺(jué)異常等，主要因淚液質(zhì)和/或量的改變而引起眼部不適，因而出現(xiàn)眼睛干澀、疲勞、視物模糊等癥狀[2]，嚴(yán)重者會(huì)損傷角膜而影響視力[3]。由于工作強(qiáng)度的增加，人們長(zhǎng)時(shí)間處于緊張的工作狀態(tài)會(huì)提高抑郁癥的發(fā)生率[4]，所以西酞普蘭也使用得更加廣泛。有部分研究表明抗抑郁藥物和眼干燥癥相關(guān)[5-6]。閔幼蘭等[7]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明，單獨(dú)使用西酞普蘭對(duì)角膜厚度無(wú)影響，但未探索其是否對(duì)淚液功能有影響。本研究主要探討西酞普蘭對(duì)小鼠淚膜和角膜上皮組織的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

36只BABL/c雄性小鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重18～22 g，均為無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，分別用眼底鏡和裂隙燈顯微鏡進(jìn)行檢查并確認(rèn)眼部無(wú)異常。小鼠分成3組，每組12只，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程均在標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境下飼養(yǎng)[8]。A組：空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何處理）；B組：生理鹽水組，以10 mg/kg腹腔注射生理鹽水；C組：西酞普蘭組，以10 mg/kg腹腔注射西酞普蘭。分別在實(shí)驗(yàn)第1、4和7天行淚液分泌試驗(yàn)（SchirmerⅠ test, SIT）、淚膜破裂時(shí)間（break-up time, BUT）檢測(cè)，于實(shí)驗(yàn)第7天進(jìn)行角膜熒光素染色（Fluorescein, FL），處死所有小鼠后取眼球做掃描電鏡及HE染色觀察角膜上皮損傷情況。本研究符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求[9]。

1.2 儀器與試劑

眼底鏡和裂隙燈顯微鏡（蘇州66視覺(jué)科技股份有限公司），掃描電鏡（日本Hitachi公司），西酞普蘭粉末（美國(guó) Selleckchem公司），酚紅棉線（天津晶明新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司），熒光素鈉（廣州白云山明興制藥有限公司）。

1.2 西酞普蘭的制備與應(yīng)用

將西酞普蘭粉末以1∶100溶于生理鹽水，西酞普蘭本身難溶，故制成混懸液，放于4℃冰箱保存?zhèn)溆?，在注射前?fù)溫至室溫，以免因注射溫度過(guò)低對(duì)小鼠造成刺激。注射劑量為10 mg/kg，1次/d，于上午8：00注射。

1.3 SIT試驗(yàn)

剪取酚紅棉線1.5 cm用于淚液檢查，左手固定小鼠頭部并使其眼瞼處于自然狀態(tài)，右手持鑷子夾住棉線一端，將另一端置于小鼠內(nèi)眥處并保持姿勢(shì)固定，等待15 s，取出后拉直，記錄棉線浸濕的長(zhǎng)度。保證由同一操作者在相同環(huán)境（溫度、濕度、時(shí)間、光照強(qiáng)度）下完成測(cè)試。

1.4 BUT檢測(cè)

參照文獻(xiàn)[10]，將1 μl濃度為10 g/L的熒光素鈉用移液槍滴入到小鼠眼球表面（眼表），并輔助其瞬目，此刻熒光素鈉已經(jīng)很好地附著在眼表。應(yīng)用裂隙燈顯微鏡（鈷藍(lán)光下）對(duì)小鼠角膜染色區(qū)進(jìn)行觀察，待出現(xiàn)第1個(gè)破裂點(diǎn)時(shí)記錄出現(xiàn)時(shí)間，即淚膜破裂時(shí)間，注意移液槍的槍頭不要觸及小鼠眼表，以免造成不必要的損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 FL檢測(cè)

將1%熒光素鈉滴眼液（1滴）應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)小鼠并助其瞬目，評(píng)分系統(tǒng)參考文獻(xiàn)[11]標(biāo)準(zhǔn)。0分：無(wú)任何染色；1分：輕微散點(diǎn)狀染色＜30個(gè)點(diǎn)；2分：點(diǎn)狀染色＞30點(diǎn)，但未發(fā)生融合；3分：染色呈浸潤(rùn)彌漫性，未出現(xiàn)斑塊；4分：有熒光素斑塊。

1.6 角膜HE染色

對(duì)小鼠角膜進(jìn)行HE染色：①制片，晾干；②固定（冰丙酮），沖洗；③染色（蘇木精3 min），著色后沖洗；④分化（1%鹽酸酒精），沖洗；⑤染色（伊紅），漂洗；⑥脫水（依次在70%、80%、98%、100%乙醇中脫水）；⑦透明（二甲苯）2次，晾干；⑧封片。在顯微鏡下觀察小鼠角膜上皮細(xì)胞的情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用GraphPad Prism 5.00統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組比較采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析或單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組SIT比較

3組小鼠SIT結(jié)果比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①3組不同時(shí)間點(diǎn)的SIT有差異（F=9.749，P=0.008）；②3組間的SIT有差異（F=11.234，P=0.002），C組SIT較B組減少，相對(duì)治療效果較好；③3組的SIT變化趨勢(shì)有差異（F=16.438，P=0.000），見(jiàn)表1。

表1 3組干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段SIT比較（n =12，mm，±s）

表1 3組干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段SIT比較（n =12，mm，±s）

干預(yù)后第1天 第4天 第7天A 組 6.68±1.09 6.65±1.03 6.58±1.04 6.53±1.08 B 組 6.64±1.01 6.69±0.99 6.52±1.09 6.48±1.11 C 組 6.65±1.17 6.21±1.12 5.02±0.83 3.32±0.54組別 干預(yù)前

2.2 3組BUT比較

3組小鼠BUT結(jié)果比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①3組不同時(shí)間的BUT有差異（F=10.427，P=0.019）；②3組間的 BUT有差異（F=14.842，P=0.012），C組BUT較B組減少，相對(duì)治療效果較好；③3組的BUT變化趨勢(shì)有差異（F=11.753，P=0.001）。見(jiàn)表2。

2.3 3組FL比較

3組小鼠FL結(jié)果比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①3組不同時(shí)間點(diǎn)的FL有差異（F=6.752，P=0.032）；②3組的FL有差異（F=5.337，P=0.029），C組FL較B組增多，相對(duì)治療效果較好；③3組的FL變化趨勢(shì)有差異（F=16.431，P=0.002）。見(jiàn)表3。

表2 3組干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段BUT比較（n =12，s，±s）

表2 3組干預(yù)前和干預(yù)后各時(shí)段BUT比較（n =12，s，±s）

組別 干預(yù)前干預(yù)后第1天 第4天 第7天A 組 6.78±1.83 6.73±2.01 6.81±1.82 6.77±1.75 B 組 6.66±1.79 6.71±1.93 6.74±1.79 6.64±1.84 C 組 6.58±1.91 6.49±1.23 5.01±1.04 3.14±0.98

表3 3組干預(yù)后各時(shí)段角膜FL比較（n =12，分，±s）

表3 3組干預(yù)后各時(shí)段角膜FL比較（n =12，分，±s）

干預(yù)后第1天 第4天 第7天A 組 0.59±0.21 0.55±0.27 0.49±0.32 B 組 0.56±0.24 0.54±0.19 0.47±0.26 C 組 0.57±0.27 1.13±0.29 3.65±0.95組別

2.4 HE染色結(jié)果

3組小鼠第7天HE染色結(jié)果顯示，A組和B組小鼠角膜上皮細(xì)胞呈緊密排列，由4～6層上皮細(xì)胞組成，整齊且未見(jiàn)缺損；注射西酞普蘭后，C組小鼠角膜上皮層數(shù)未見(jiàn)增加，基底細(xì)胞層為單層柱狀上皮，角膜厚度無(wú)明顯改變，表層上皮光滑，無(wú)脫落和損傷。干預(yù)后第7天結(jié)果：①3組上皮細(xì)胞層數(shù)無(wú)差異（F=0.631，P=0.076）；②3組上皮空泡細(xì)胞數(shù)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.749，P=0.013）。見(jiàn)圖1。

2.5 SEM結(jié)果

A、B組可見(jiàn)界限分明的上皮細(xì)胞和整齊排列的微絨毛和褶皺，視野內(nèi)可見(jiàn)較多的光亮細(xì)胞；C組上皮細(xì)胞形態(tài)大小均等，邊界較清晰，無(wú)明顯異常，微絨毛和褶皺排列整齊，微絨毛數(shù)量減少。干預(yù)后第7天結(jié)果：3組微絨毛數(shù)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.917，P=0.092）。見(jiàn)圖 2。

圖1 3組小鼠經(jīng)不同處理后第7天角膜HE染色情況 （光鏡×400）

圖2 3組小鼠經(jīng)不同處理后第7天角膜掃描情況 （電鏡×10 000）

3 討論

有研究證實(shí)，診斷為眼干燥癥的受試者更可能存在著嚴(yán)重的抑郁、焦慮等情緒[12]，而西酞普蘭是目前臨床治療抑郁癥的主要藥物，有研究表明抗抑郁藥特別是選擇性5羥色胺再吸收抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitors, SSRIs）有抑制淚液分泌的作用[1-13]。

由于小鼠角膜、淚膜等眼表結(jié)構(gòu)和人類似，外胚層逐漸分化形成角膜上皮細(xì)胞并將角膜分層，處于非角化狀態(tài)[14]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用下調(diào)控位于眼表的腺體分泌，當(dāng)淚膜受到損傷，眼表則出現(xiàn)光滑度變差，或上皮細(xì)胞缺失，調(diào)控作用隨之下降[15]，因此，對(duì)淚膜穩(wěn)定性的保護(hù)需要更加重視。

淚膜厚度較薄，僅約3 μm，因此更容易發(fā)生損傷。淚膜不同的層面有其各自的功能，其中瞼板腺分泌脂質(zhì)層，起到最外屏障的作用，位于中間的水液層由主、副淚腺分泌，角膜和結(jié)膜上皮則分泌黏蛋白形成黏蛋白層[16]。因此，淚膜對(duì)維持眼表水份穩(wěn)定[17]、視力清晰起到不可或缺的作用。當(dāng)眼表水分丟失時(shí)，淚膜的功能受損，導(dǎo)致眼部出現(xiàn)的各種不適癥狀稱為眼干燥癥[18]。當(dāng)患者出現(xiàn)眼干燥癥后，則可出現(xiàn)各種眼部不適的癥狀，如視疲勞、異物感、眼皮抽搐、視物模糊等[2]。因此，有效地保護(hù)淚膜對(duì)降低眼干燥癥發(fā)病率起到重要作用。

導(dǎo)致眼干燥癥的因素有很多，吸煙、電子產(chǎn)品的過(guò)度使用、維生素缺乏和性激素失調(diào)等[19-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，腹腔注射西酞普蘭第7天，小鼠的SIT和BUT減少，F(xiàn)L值升高，這意味著西酞普蘭對(duì)小鼠的淚膜產(chǎn)生一定程度的影響，并出現(xiàn)眼干燥癥的癥狀。一些研究表明，抗抑郁劑的使用，特別是三環(huán)類抗抑郁藥和選擇性5-羥色胺再吸收抑制劑的使用，以及淚液分泌的減少可能是引起眼干燥癥的原因[23-24]。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果在一定程度上可驗(yàn)證這一猜想。5-羥色胺的釋放可能參與了淚液分泌的調(diào)節(jié)，具有抗膽堿能作用的5-羥色胺去甲腎上腺素再攝取抑制劑與部分眼干燥癥相關(guān)，但作為SSRIs的西酞普蘭，不具有抗膽堿能作用。因此筆者假設(shè)實(shí)驗(yàn)使用西酞普蘭后，眼干燥癥的出現(xiàn)與抗膽堿能系統(tǒng)以外的機(jī)制相關(guān)。

在本研究中使用西酞普蘭的小鼠確實(shí)出現(xiàn)眼干燥癥，但第7天時(shí)HE染色與空白對(duì)照組結(jié)果無(wú)差異，這可能是由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，西酞普蘭的作用尚未累及角膜上皮細(xì)胞或角膜上皮細(xì)胞發(fā)生的變化還不明顯，難以被檢出。同時(shí)，使用西酞普蘭并不能使小鼠角膜一直暴露，只是單純地抑制快動(dòng)眼睡眠。

有研究表明[23]，社會(huì)心理問(wèn)題已經(jīng)與眼干燥癥相關(guān)聯(lián)，表現(xiàn)出睡眠和情緒障礙的眼干燥癥患者增加。也有報(bào)道眼干燥癥患者的焦慮和抑郁癥的發(fā)生頻率增加[24-25]。因此，臨床上眼干燥癥出現(xiàn)的相關(guān)原因還需要進(jìn)一步的探究才可確定。

總之，西酞普蘭作為常用的SSRIs，在一定程度上影響小鼠淚膜功能的穩(wěn)定性，但對(duì)角膜上皮組織未造成損傷，這可以對(duì)臨床上患者應(yīng)用西酞普蘭后可能產(chǎn)生的眼干燥癥做出一定的解釋，但其具體的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。