體外培養(yǎng)乳牙牙髓干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞定向分化的實(shí)驗(yàn)研究*

劉瓊，文軍 ，吳小明，錢虹

[南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院（廣東省口腔醫(yī)院）1.兒童口腔科，2.牙體牙髓科，廣東 廣州 510280]

近年來提出的干細(xì)胞治療是指利用干細(xì)胞來替代、修復(fù)，并且加強(qiáng)受損組織與器官的生物學(xué)功能，最終達(dá)到臨床組織再生或修復(fù)的目的[1]。干細(xì)胞是一群具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞，在組織器官生長、發(fā)育及損傷修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。許多組織器官的更新是通過干細(xì)胞來維持的。迄今為止，在諸多組織器官中都發(fā)現(xiàn)了成體干細(xì)胞，如骨骼肌、脂肪、神經(jīng)、軟骨滑膜團(tuán)等[2]。在干細(xì)胞治療中，種子細(xì)胞是組織工程研究中的核心問題之一。

迄今分離到的6種牙源性干細(xì)胞包括：乳牙牙髓干細(xì)胞、成人牙髓干細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞、牙周膜干細(xì)胞、根尖乳頭干細(xì)胞及牙囊細(xì)胞[3]。本研究中用于研究的乳牙牙髓干細(xì)胞起源于神經(jīng)嵴外胚層，當(dāng)其移動遷徙到頜面部后形成了外胚間充質(zhì)[4]。乳牙牙髓干細(xì)胞的首次分離是MIURA等[5]在2003年完成的，其具有自我更新和高度增殖的特性，并且具有間充質(zhì)干細(xì)胞的典型生物學(xué)特征。諸多文獻(xiàn)報(bào)道骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的相關(guān)性，且具有向內(nèi)皮細(xì)胞分化的潛能[6]。既往研究表明，乳牙牙髓干細(xì)胞可以在體外完成向神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化[7]，誘導(dǎo)物決定其分化方向。在不同誘導(dǎo)物提供的具有不同細(xì)胞外基質(zhì)、轉(zhuǎn)錄因子、生長因子，以及信號分子的微環(huán)境中，牙髓干細(xì)胞可根據(jù)不同條件分化為不同類型的組織細(xì)胞[8]。本研究選取的乳牙牙髓干細(xì)胞具有以下優(yōu)點(diǎn)：①乳牙牙髓干細(xì)胞的增殖活性高于成人牙髓干細(xì)胞及其他牙源性干細(xì)胞[9]；②取材容易，可實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)取材；③降低醫(yī)療成本；④可在短期內(nèi)獲得組織工程需要的細(xì)胞量[10]；⑤患兒及家長易接受，所受倫理爭議較少；⑥具有較低的凋亡性和衰老性，有研究表明其第10代細(xì)胞仍可保持細(xì)胞形態(tài)[11]；⑦可用于自體移植，理論上可有效避免免疫排斥反應(yīng)[12]；⑧用于自體移植時，可降低交叉感染的風(fēng)險(xiǎn)[13]。

理論上牙髓干細(xì)胞可以分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[14]。牙髓中的血管系統(tǒng)可以通過提供營養(yǎng)物質(zhì)及運(yùn)輸代謝廢物質(zhì)來維持牙髓代謝的平衡，目前血管移植技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床，在腫瘤、創(chuàng)傷、心血管疾病、顯微外科手術(shù)及器官移植中都有著重要地位[15]。在血管性疾病的組織工程學(xué)研究中，自體血管移植雖然具有組織相容性好、無免疫排異反應(yīng)等優(yōu)勢，是最為理想的血管移植物，但是自體血管移植具有一定的局限性[16]。血管內(nèi)皮細(xì)胞是一類具有諸多生理功能的細(xì)胞，包括維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、維持正常免疫功能等；此外，其在心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展等方面也具有重要作用[17]。若血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生功能障礙，則可能引起血管痙攣、血管增生、血管異常收縮及血栓形成等典型的病理生理變化[18]。血管內(nèi)皮細(xì)胞可以移植用于修復(fù)血管內(nèi)膜及重建血管網(wǎng)[19]，血管內(nèi)皮細(xì)胞是血管組織工程化的核心，但由于其來源有限且增殖能力不強(qiáng)，在臨床應(yīng)用中仍存在一定阻礙。故具有上述優(yōu)點(diǎn)的乳牙牙髓干細(xì)胞如果能在體外誘導(dǎo)分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，對其在細(xì)胞及組織工程學(xué)中的應(yīng)用具有重要意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月—2017年9月南方醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院牙科29例健康兒童的滯留乳牙。充分消毒牙體周圍組織后拔牙，置于預(yù)冷的含有高倍雙抗的α-DMEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室，在4 h內(nèi)進(jìn)行原代提取。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有研究對象及其家屬對本研究知情同意，并簽署知情同意書；②所有研究對象年齡在6～10歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①牙根吸收＞1/2乳前牙標(biāo)本；②存在牙體牙髓疾病的標(biāo)本；③存在遺傳性疾病的研究對象；④存在嚴(yán)重呼吸、循環(huán)、消化及其他系統(tǒng)疾病的研究對象。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司），細(xì)胞培養(yǎng)孵箱（美國Thermo Scientific公司），Multiskan Mk3酶標(biāo)儀（美國Thermo公司），水浴箱（上海中新儀器設(shè)備公司），SWCJ-1FD型凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠），EPICS-XL型流式細(xì)胞儀（美國Beckman Corlter公司），胎牛血清（fatal bovine serun, FBS）（美國Gibco公司），達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM）（美國Sigma公司），胰蛋白酶（美國Gibco公司），雙抗（美國Hyclone公司），基質(zhì)蛋白酶1單克隆抗體（stromal cell antigen-1,Stro-1）（美國Santa Cruz公司），Vimentin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司），包被抗小鼠IgM Micro Beads的免疫磁珠試劑盒（德國Miltenyi Biotec公司），人血管來源內(nèi)皮細(xì)胞（南京凱基生物有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原代細(xì)胞提取 參考文獻(xiàn)的經(jīng)典方法[20]，將標(biāo)本置入超凈臺中用磷酸鹽緩沖溶液（PBS）反復(fù)沖洗，采用拔髓針拔取出牙髓組織。完全培養(yǎng)液浸潤下剪碎，將終濃度為3 g/L的Collagenase Type I（美國Gibco公司）和4 g/L的Dispase（美國Gibco公司）混合，在37℃水浴中消化1 h牙髓組織，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入培養(yǎng)液混勻沉淀，輕柔吹打，用70μm的濾網(wǎng)過濾后獲得細(xì)胞懸液，加入含20% FBS的α-DMEM培養(yǎng)液接種，置于37℃、5%二氧化碳CO2敷箱中培養(yǎng)。當(dāng)達(dá)到生長融合時以1∶2的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3.2 乳牙牙髓干細(xì)胞的分選 選取生長狀態(tài)良好的第3代乳牙牙髓細(xì)胞，胰酶消化制成細(xì)胞懸液后過30μm細(xì)胞篩，以含1% FBS的FBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/ml。向細(xì)胞懸液中加入FcR封閉液，置于4℃中孵育20 min。再加入Stro-1單克隆抗體），置于4℃中孵育1 h。用含0.1% FBS的PBS清洗3次后過30μm細(xì)胞篩。加入包被抗小鼠IgM MicroBeads的免疫磁珠，其是一種用于牙髓干細(xì)胞磁性標(biāo)記的與Stro-1單克隆抗體相特異性偶聯(lián)的超順磁化微粒，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行分選操作，收集從分選柱流出的乳牙牙髓細(xì)胞置于37℃、5%CO2敷箱中培養(yǎng)以供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.3 乳牙牙髓干細(xì)胞的鑒定 采用免疫組織化學(xué)染色法對分選出的乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將分選后的乳牙牙髓干細(xì)胞用PBS清洗3遍，取95%乙醇固定20 min，用0.3%過氧化氫H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min。用10% FBS封閉20 min，選取Vimentin單克隆抗體及Stro-1單克隆抗體作為其表面標(biāo)記物，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)將一抗室溫孵育2 h，之后嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行染色。

1.3.4 乳牙牙髓干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向分化 血管內(nèi)皮細(xì)胞向誘導(dǎo)：選取分選后生長狀態(tài)良好的乳牙牙髓細(xì)胞，調(diào)整密度為1×105個/孔，采用常規(guī)培養(yǎng)液將其接種到6孔板上，待乳牙牙髓細(xì)胞完全貼壁融合后，將培養(yǎng)液更換為血管內(nèi)皮細(xì)胞向誘導(dǎo)培養(yǎng)基，更換培養(yǎng)液1次/2 d。

1.3.5 血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)培養(yǎng)基成分[21]α-DMEM培養(yǎng)基：2% FBS，50 μg/L的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF），10 μg/L的bFGF，0.1 mg/L的地塞米松，2 g/L的牛血清白蛋白，1%的抗生素。

1.3.6 乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞的鏡下形態(tài)觀察 分別取第3代的乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)14 d后的細(xì)胞置于倒置顯微鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照留存。

1.3.7 乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞血管生成實(shí)驗(yàn) 分別取第3代的乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞向誘導(dǎo)14 d后的細(xì)胞，在4℃冰上融化Matrigel膠（美國Sigma公司），50 μl Matrigel膠包被96孔板，注意不要有氣泡，37℃、含5% CO2飽和濕度的敷箱中孵育培養(yǎng)30 min，加入1×105個/孔的細(xì)胞懸液，在倒置顯微鏡下觀察其體外血管生成過程。

1.3.8 乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞免疫表型鑒定 采用免疫組織化學(xué)染色法來鑒定細(xì)胞的免疫表型，具體步驟如下：①分別取第3代的乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞向誘導(dǎo)2周后的細(xì)胞接種于預(yù)先已經(jīng)置入玻片的12孔板上，待細(xì)胞貼壁融合1 h后，向12孔板內(nèi)加入常規(guī)培養(yǎng)液；②24 h后取出玻片，PBS沖洗后采用甲醇固定20 min，再用PBS充分清洗；③加入兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原抗體，37℃、5% CO2敷箱中培養(yǎng)1 h，PBS沖洗3次；④加入辣根過氧化物酶標(biāo)識的羊抗兔二抗，37℃、5%CO2敷箱中培養(yǎng)30 min，PBS沖洗3次；⑤DAB顯色5 min，蒸餾水沖洗10 min，蘇木精襯染2 min；⑥采用鹽酸復(fù)染，吹干，并用中性樹膠封片；⑦在顯微鏡下進(jìn)行對比觀察并拍照存檔。

另取一組人血管來源內(nèi)皮細(xì)胞，采用相同的方法制作切片作為參照組。計(jì)數(shù)免疫組織化學(xué)染色陽性細(xì)胞所占百分率。每組細(xì)胞隨機(jī)觀察切片5個不同視野，取5個視野的平均值，根據(jù)細(xì)胞著色判斷。①陰性：不著色；②弱陽性：淺黃色；③中等陽性：中黃色或棕色且無背景著色，或深棕色，但背景色為淺棕色；④強(qiáng)陽性：深棕色或棕褐色，且無背景著色。陽性表達(dá)率（%）=陽性（弱陽性+陽性+強(qiáng)陽性）表達(dá)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人乳牙牙髓干細(xì)胞的鑒定結(jié)果

人乳牙牙髓干細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色可見波形蛋白染色和Stro-1染色呈強(qiáng)陽性。見圖1、2。

2.2 鏡下形態(tài)觀察結(jié)果

鏡下未經(jīng)誘導(dǎo)的乳牙牙髓干細(xì)胞呈長梭形，少數(shù)為多角形橢圓形，胞體豐滿，體積較?。ㄒ妶D3A）。經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導(dǎo)14 d后的乳牙牙髓干細(xì)胞呈多角形或梭形相互嵌合排列，呈典型的鵝卵石或鋪路石樣，細(xì)胞間相互連接緊密（見圖3B）。

圖1 人乳牙牙髓干細(xì)胞表達(dá) （波形蛋白染色×10）

圖2 人乳牙牙髓干細(xì)胞表達(dá) （Stro-1染色×40）

2.3 血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導(dǎo)14 d后的乳牙牙髓干細(xì)胞接種于基質(zhì)膠后，6 h后在鏡下可呈現(xiàn)明顯的血管樣結(jié)構(gòu)（見圖4A）。而未經(jīng)誘導(dǎo)的乳牙牙髓干細(xì)胞在血管生成實(shí)驗(yàn)中，接種于基質(zhì)膠后6 h細(xì)胞集聚成團(tuán)狀，不能形成血管樣結(jié)構(gòu)（見圖4B）。

2.4 免疫表型鑒定結(jié)果

乳牙牙髓干細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞染色陽性率為（80.377±4.489）%，與作為參照組的人血管來源內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞染色陽性率（82.191±5.012）%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.645，P=0.479）。

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，乳牙牙髓干細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)14 d后其細(xì)胞表型發(fā)生變化，倒置顯微鏡下可見胞漿內(nèi)存在棕褐色沉淀，其中核周最為明顯（見圖5A）；未經(jīng)誘導(dǎo)的乳牙牙髓干細(xì)胞細(xì)胞因子相關(guān)抗原染色呈陰性（見圖5B）。

圖4 血管生成實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （×10）

圖5 免疫表型鑒定結(jié)果 （×10）

3 討論

乳牙牙髓組織中含有牙本質(zhì)細(xì)胞、未分化間充質(zhì)細(xì)胞，以及成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞成分，因此想要分離得到純化的乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，就需要從這些混合細(xì)胞中分離出所需要的細(xì)胞。目前針對干細(xì)胞的分離方法主要包括流式細(xì)胞儀分選法、單細(xì)胞克隆法、密度梯度離心法、貼壁篩選法、免疫磁珠分選法等[22]。免疫磁珠分選法是指將偶聯(lián)在抗體上的磁珠標(biāo)記在細(xì)胞上，利用抗體對細(xì)胞表面抗原的特異性識別，在磁場的作用下分選需要的細(xì)胞，其具有細(xì)胞處理量大、分離純度高、分選后細(xì)胞活力好等優(yōu)點(diǎn)[23]。本研究采用此法成功分離出純化的乳牙牙髓干細(xì)胞。

在國外研究中，KARBANOVá等[24]選擇20 μg/L質(zhì)量濃度的VEGF誘導(dǎo)牙髓干細(xì)胞，7 d后檢測到血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物vWF的表達(dá)。ISHKITIEV等[25]發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓干細(xì)胞形成的微血管可以與宿主的脈管系統(tǒng)相吻合。SAKAI等[26]發(fā)現(xiàn)，乳牙牙髓干細(xì)胞在VEGF的作用下可表達(dá)血管內(nèi)皮細(xì)胞特有的表面標(biāo)志物。

但在這一領(lǐng)域國內(nèi)相關(guān)研究數(shù)量甚少，針對乳牙牙髓干細(xì)胞的分化多為成骨以及成脂向的研究。血管內(nèi)皮細(xì)胞呈扁平多角形，邊界清楚，典型形態(tài)為倒置顯微鏡下呈鵝卵石或鋪路石樣。本研究中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件為：α-DMEM培養(yǎng)基，2% FBS，0.1μmol/L地塞米松，50μg/L VEGF，10μg/L bFGF，2 g/L牛血清白蛋白，1%抗生素，在此條件下對乳牙牙髓干細(xì)胞進(jìn)行血管向誘導(dǎo)并分別對乳牙牙髓干細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞的鏡下形態(tài)觀察，進(jìn)行血管生成實(shí)驗(yàn)以及免疫表型鑒定。結(jié)果表明鏡下未經(jīng)誘導(dǎo)的乳牙牙髓干細(xì)胞鏡下呈長梭形，少數(shù)為多角形橢圓形，胞體豐滿，體積較小，與既往研究中報(bào)道的相一致[27]。經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導(dǎo)14 d后的乳牙牙髓干細(xì)胞，呈多角形或梭形相互嵌合排列，呈典型的鵝卵石或鋪路石樣，細(xì)胞間相互連接緊密，說明其已經(jīng)具有血管內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)特征。在血管生成實(shí)驗(yàn)中，未經(jīng)誘導(dǎo)的乳牙牙髓干細(xì)胞不能形成血管樣結(jié)構(gòu)，而經(jīng)過血管內(nèi)皮定向誘導(dǎo)14 d后的乳牙牙髓干細(xì)胞可呈現(xiàn)明顯的血管樣結(jié)構(gòu)，表明經(jīng)過誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有了血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成這項(xiàng)生物學(xué)功能。在免疫表型鑒定的研究中，未經(jīng)誘導(dǎo)的乳牙牙髓干細(xì)胞細(xì)胞因子相關(guān)抗原染色呈陰性，而乳牙牙髓干細(xì)胞血管內(nèi)皮細(xì)胞定向誘導(dǎo)后的細(xì)胞的細(xì)胞染色陽性率為（80.377±4.489）%，說明經(jīng)過誘導(dǎo)后的細(xì)胞具有了血管內(nèi)皮細(xì)胞的免疫表型。以上結(jié)果證實(shí)在本研究中的誘導(dǎo)條件下，成功將乳牙牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)為血管內(nèi)皮細(xì)胞，證明乳牙牙髓干細(xì)胞具有血管生成的分化能力。

雖然在國內(nèi)外已經(jīng)有很多研究關(guān)于牙髓干細(xì)胞的血管生成研究，但在國內(nèi)針對牙髓干細(xì)胞多為成骨研究，針對血管生成領(lǐng)域仍屬于摸索研究階段。在本研究的基礎(chǔ)上，本課題組可進(jìn)行血管生成后續(xù)相關(guān)的研究，如分化后的細(xì)胞人乳牙牙髓干細(xì)胞在牙科材料學(xué)上的應(yīng)用等，牙髓干細(xì)胞的血管生成這一基礎(chǔ)性研究為明確牙髓干細(xì)胞的特性特點(diǎn)并使其進(jìn)一步得到實(shí)際應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。目前尚有以下幾點(diǎn)問題待進(jìn)一步研究解決：一是誘導(dǎo)乳牙牙髓干細(xì)胞血管生成的最佳VEGF濃度尚待探索，是否存在優(yōu)于本研究方案的誘導(dǎo)培養(yǎng)基條件；二是誘導(dǎo)后的血管內(nèi)皮細(xì)胞在組織工程中實(shí)際應(yīng)用是否可達(dá)到預(yù)期的效果。隨著對乳牙牙髓干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化的深入研究，并建立起乳牙牙髓干細(xì)胞分離培養(yǎng)的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，乳牙牙髓干細(xì)胞有可能成為血管生成的理想種子細(xì)胞。