覃曉娟，張金蓮，李艷華，陳廷速，李冬萍*，龍艷艷，劉增亮

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學院微生物研究所，廣西 南寧 530007; 2.廣西師范大學生命科學學院，廣西 桂林 541006)

【研究意義】香蕉枯萎病是一種由古巴?；图怄哏牭毒?Fusariumoxysporumf. sp.cubense)侵染維管束引起植株凋萎的毀滅性真菌土傳病害，是香蕉生產(chǎn)中最具摧毀性的病害之一，但目前該病害在國內(nèi)外尚缺乏有效的防控方法，嚴重制約著全球香蕉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizas，AM)真菌是一類具有重要生態(tài)功能的土壤微生物，能夠顯著促進植物生長，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[1-5]，提高宿主植物對土傳病害的抵抗能力[6-9]。廣西香蕉種植面積占全國總面積的30 %以上，是我國重要的香蕉主產(chǎn)區(qū)及優(yōu)質(zhì)香蕉貨源地。研究廣西香蕉根際土壤AM真菌資源，對利用AM真菌提高香蕉植株抗枯萎病性能具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】AM真菌對香蕉植株生長具有顯著促進作用，在溫室條件下接種AM真菌的香蕉植株在株高、葉面積、根鮮重、光合和蒸騰效率上均優(yōu)于未接種的植株[10]；AM真菌能夠提高香蕉植株對N、P、K元素的吸收[11]。AM 真菌能夠抑制植物土傳病害，如AM 真菌能夠有效降低由尖孢鐮刀菌引起的鷹嘴豆、胡麻、黃瓜、草莓、棉花、西瓜、香蕉等[12-20]作物的枯萎病發(fā)病率。香蕉根際土壤AM真菌資源豐富，李嵐嵐等[19]從海南省的海口、瓊海、儋州、三亞、萬寧等14個縣市的43份香蕉根際土壤樣品中分離并鑒定出9屬共45種AM真菌，其中無梗囊霉屬(Acaulospora)為常見屬，雙網(wǎng)無梗囊霉(A.bireticulata) 、疣狀無梗囊霉(A.tuberculata)為常見種；Joyce等[21]在非洲肯尼亞香蕉園分離到多個類型的AM真菌孢子，其中以無梗囊霉屬的孢子密度最大?！颈狙芯壳腥朦c】土壤AM真菌資源多樣性受氣候、土壤和耕作方式等多因素影響[22-23]。廣西南寧市地處亞熱帶季風氣候區(qū)，特殊的氣候條件造就了豐富而獨特的 AM真菌資源。目前尚少見有關(guān)于廣西香蕉根際土壤AM真菌資源的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】對廣西南寧市武鳴區(qū)的健康和患枯萎病香蕉植株根際土壤AM真菌孢子進行單孢分離和形態(tài)鑒定，比較分析健康和患枯萎病香蕉植株根際土壤AM真菌的差異，旨在探討AM真菌與香蕉枯萎病的關(guān)系，為利用AM真菌實現(xiàn)香蕉枯萎病的綠色防控、改善蕉園土壤生態(tài)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試土壤樣品2016年5月采集于廣西南寧市武鳴區(qū)香蕉種植園。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 隨機選定5個健康和5個患枯萎病香蕉植株樣本后，采集5～20 cm深度的根際土樣，每個植株樣本取1份土樣，混勻四分法取2 kg裝塑料袋密封，注明標簽。帶回實驗室放陰涼處自然風干待用。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)測定 土壤的有機質(zhì)、總氮、有效磷、交換性Mg2+含量和pH由廣西農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與檢測技術(shù)研究所按相關(guān)國家標準測定。

1.2.3 土壤AM真菌孢子的分離和鑒定 參考陳廷速等[24]方法，取自然風干土樣50 g，采用濕篩傾析-蔗糖離心法，分離AM真菌孢子，每個土樣重復3次。將所分離的孢子材料置于Olympus顯微鏡下觀察并記錄孢子數(shù)量和形態(tài)特征，參考相關(guān)文獻并對照《VA 菌根真菌鑒定手冊》和http://invam.wvu.edu/網(wǎng)站提供的圖片及菌種描述，根據(jù)孢子顏色、形狀大小、孢壁結(jié)構(gòu)、連孢菌絲及孢壁紋飾等形態(tài)結(jié)構(gòu)進行孢子種屬鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

從表1可以看出，健康土和病土有機質(zhì)平均含量分別為22.3和20.8 g/kg，總氮平均含量分別為0.142 %和0.201 %，有效磷平均含量分別為198.2和166.3 mg/kg，交換性Mg2+平均濃度分別為0.37和0.29 cmol/kg，平均pH分別為5.14和4.81。健康土和病土的有機質(zhì)平均含量差異不顯著，病土的總氮平均含量極顯著高于健康土，健康土的有效磷、交換性Mg2+平均含量和平均pH極顯著高于病土。

2.2 AM真菌孢子形態(tài)特征

供試土樣共分離到6種類型335個孢子，分別屬于2科2屬，其中無梗囊霉屬4個類型，球囊霉屬2個類型。

2.2.1 地表球囊霉Glomusversiforme孢子單生，未見孢子果。淺黃棕色，近球形，85.0～122.0 μm。孢壁2層，壁厚5.0 ～7.5 μm，外層L1半透明，0.5～1.0 μm，有時脫落，在Melzer試劑中不著色；內(nèi)壁L2，層壁狀，桔棕色，4.5～6.5 μm。連孢菌絲直，連點寬8.0～12.0 μm。2層孢壁均深入連絲，連孢菌絲無色透明，易斷，連點處有彎隔結(jié)構(gòu)(圖1)。

表1 供試土樣理化性質(zhì)

注：同列數(shù)據(jù)后大小寫字母分別表示在0.01和0.05水平下差異顯著。

Notes: Different capital and lowercase letters in same column represented significant difference at 0.01 and 0.05 levels,respectively.

圖1 地表球囊霉(A.水浸; B.Melzer試劑浸)Fig.1 Glomus versiforme (A.Soaked in water; B.Soaked in Melzer’s reagents )

2.2.2 長孢球囊霉Glomusdolichosporum孢子棕色，卵形，橢圓形，(120.0 ～190.0) μm ×(60.0～110.0)μm。孢壁3層，壁厚5.0～9.0 μm，外層L1無色透明，約1.0 μm；L2層狀壁，黃棕色，3.5～6 μm；L3緊貼第二層，壁厚0.5～1.0 μm。連孢菌絲黃棕色，寬10.0～15.0 μm；連點呈小漏斗形或喇叭形，寬15.0～25.0 μm，雙層，連點處無隔結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.2.3 雙網(wǎng)無梗囊霉Acaulosporabiretichlata孢子土壤中單生。黃棕色，球形至橢圓形，直徑(120.0～150.0) μm × (140.0 ～175.0) μm。孢子易碎，表面有明顯雙層網(wǎng)紋，網(wǎng)孔呈不規(guī)則多邊形。孢壁呈不易區(qū)分的多層結(jié)構(gòu)，壁厚(2.0～3.0) μm，在Melzer試劑中反應不明顯。孢子內(nèi)見透明小油滴內(nèi)含物(圖3)。

2.2.4 細凹無梗囊霉屬AcaulosporaScrobiculata孢子淺黃色，球形或近球形，直徑111.5～164.0 μm；孢子表面布滿圓形或不規(guī)則形狀小凹坑紋飾，凹坑直徑1.0～3.4 μm。孢壁2層，L1透明，厚約1 μm，L2淺棕黃色，厚約3.0～4.7 μm。發(fā)芽壁2層：GW1雙層，無色透明，厚約1 μm，GW2雙層，無色透明；外層附有珠狀顆粒，厚約1 μm，內(nèi)層在Melzer試劑中呈紫紅色(圖4)。

圖2 長孢球囊霉(A.水浸; B.Melzer試劑浸試劑; C.PVLG浸)Fig.2 Glomus dolichosporum (A.Soaked in water; B.Soaked in Melzer’s reagents; C.Soaked in PVLG)

圖3 雙網(wǎng)無梗囊霉(A.水浸; B.Melzer 試劑浸; C.PVLG浸)Fig.3 Archaeospora biretichlata (A.Soaked in water; B.Soaked in Melzer’s reagents; C.Soaked in PVLG)

圖4 細凹無梗囊霉屬(A.水浸; B.Melzer 試劑浸)Fig.4 A.Scrobiculata (A.Soaked in water; B.Soaked in Melzer’s reagents)

2.2.5 空洞無梗囊霉屬Acaulosporacavernata孢子淺黃色至棕色，圓形，直徑140.0～170.0 μm。孢子表面布滿卵形小凹坑紋飾，凹坑直徑2.0 ～5.0 μm。孢壁雙層，L1淺黃色至棕色，厚約5.0～6.6 μm，L2透明，厚約1.2～3.5 μm。發(fā)芽壁3層：GW1單層，透明膜狀壁，厚約0.7～1.6 μm，GW2雙層，L1透明，1.2～3.0 μm；L2透明不定型壁，厚約1.0～1.5 μm 外層附有珠狀顆粒，在Melzer試劑中呈紅色(圖5)。

2.2.6 疣狀無梗囊霉屬Acaulosporatuberculata孢子橙紅色至紅棕色，圓形，直徑120.0～280.0 μm。孢壁3層，L1透明，厚約1.0～3.5 μm，L2棕色層狀壁，厚約8.3～11.5 μm，有多邊形突起；L3黃棕色至紅棕色。孢壁4層，GW1雙層，透明，厚約0.5～0.8 μm，GW2雙層，L1透明，0.8～2.0 μm，有珠粒狀紋飾；L2透明不定型壁，在Melzer試劑中呈淺紅至棕紅色(圖6)。

2.3 健康與患枯萎病香蕉植株根際土壤AM真菌差異

健康土分離到4種AM真菌，病土分離到6種AM真菌(表2)，病土的孢子種類數(shù)顯著高于健康土。健康土和病土孢子密度分別為289/100和46/100 g干土，且健康土極顯著高于病土。健康土和病土的共有種為雙網(wǎng)無梗囊霉、細凹無梗囊霉、空洞無梗囊霉；健康土的特有優(yōu)勢種為地表球囊霉；病土的特有種為長孢球囊霉和疣狀無梗囊霉，但未見有優(yōu)勢種。健康土的地表球囊霉、雙網(wǎng)無梗囊霉、細凹無梗囊霉孢子密度極顯著高于病土；長孢無梗囊霉、疣狀無梗囊霉孢子密度低于病土，分別達到極顯著和顯著水平；空洞無梗囊霉孢子密度差異不顯著。

圖5 空洞無梗囊霉屬(A.水浸; B.Melzer 試劑浸)Fig.5 A.cavernata (A.Soaked in water; B.Soaked in Melzer’s reagents)

圖6 疣狀無梗囊霉屬(A.水浸; B.Melzer 試劑浸; C.Melzer’s試劑 + PVLG浸 )Fig.6 A.tuberculata (A.Soaked in water; B.Soaked in Melzer’s reagents; C.Soaked in Melzer’s reagents and PVLG)

土樣Soil sample孢子種類數(shù)Spore variety孢子密度(個/100g 風干土)Spore densityG.versiformeG.dolichosporumA.biretichlataA.scrobiculataA.cavernataAtuberculata健康土Healthy soil4 bA289 aA205 aA0 bB33 aA48 aA3 aA0 bA病土Diseased soil6 aA46 bB0 bB11 aA5 bB6 bB5 aA19 aA

注：同列數(shù)據(jù)后大小寫字母分別表示在0.01和0.05水平下差異顯著。

Notes: Different capital and lowercase letters in same column represented significant difference at 0.01 and 0.05 levels,respectively.

3 討 論

本研究首次對廣西香蕉AM真菌進行研究，從供試土樣中分離鑒定了2屬 7 種AM 真菌，主要為球囊霉屬和無梗囊霉屬。與海南[17]14個縣市和非洲肯尼亞[21]50個農(nóng)場香蕉根際土壤AM真菌種類組成有一定的相似性。與廣西東南沿海蔗區(qū)[22]的根際土壤、廣西柳江生姜[25]根際土壤、貴州金佛山方竹[26]及牡丹[27]主栽培區(qū)根圍的AM真菌種類組成具有一定的相似性。這進一步說明球囊霉屬和無梗囊霉屬具有較強的適應性。AM 真菌的組成和分布與生境因子等諸多因素密切有關(guān)。李嵐嵐等[19]從海南昌江患枯萎病粉蕉根際土樣中僅分離到疣狀無梗囊霉，本研究從患枯萎病病香蕉植株根際土壤中也分離到了疣狀無梗囊霉，同時也分離到了長孢球囊霉，與其有一定相似性。本研究發(fā)現(xiàn)健康香蕉根際土壤AM真菌孢子密度高于患病植株，且具有特有種，這與廣西柳江健康和患病生姜根際土壤AM真菌研究結(jié)果一致[25]。本研究采樣點的土壤類型為典型的赤紅壤，分離到的AM真菌主要為球囊霉屬和無梗囊霉屬兩大類，該結(jié)果再次驗證了球囊霉屬和無梗囊霉屬較多地出現(xiàn)在潮土、棕壤、紅壤、赤紅壤、磚紅壤土壤類型中的研究結(jié)論[28]。

4 結(jié) 論

廣西香蕉根際土壤AM真菌資源豐富。健康和患枯萎病香蕉植株根際土壤AM真菌種類差異明顯，健康香蕉植株根際土壤AM真菌孢子密度明顯高于患病植株，且健康土樣有優(yōu)勢AM真菌，患病土樣未見有優(yōu)勢AM真菌。健康土樣優(yōu)勢AM真菌在提高香蕉植株抗枯萎病性能方面很可能扮演重要角色。