回醫(yī)烙灸對兔膝骨性關(guān)節(jié)炎基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑表達(dá)影響的研究*

林瑞珠，陳美華，馬 川，王 月，許建峰△

(1.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，寧夏 銀川 750004; 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)回醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750004)

膝關(guān)節(jié)是人類負(fù)重主要關(guān)節(jié)之一，一些危險因素[1]包括年齡、超重、股四頭肌薄弱、性別、家族史、過度運動等使膝骨性關(guān)節(jié)炎(Knee osteoarthirtis，KOA)的發(fā)病率居高不下，據(jù)最新的KOA流行病學(xué)調(diào)查[2]，我國KOA的患病率為8.1%，提示KOA患者約有1.1億。其軟骨和骨的病理改變引起關(guān)節(jié)疼痛、僵硬和不同程度的功能障礙是其主要臨床表現(xiàn)，針對KOA的發(fā)病機制目前尚不完全清晰[3]，但越來越多的證據(jù)表明，軟骨細(xì)胞外基質(zhì)過度降解在KOA的發(fā)病中扮演重要角色，最終可導(dǎo)致軟骨損傷、破壞[4-5]。軟骨細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)主要成分為膠原和蛋白多糖，二者相互作用，膠原質(zhì)纖維提供軟骨張力能力及抗壓力作用，結(jié)合蛋白多糖的吸水性維持軟骨彈性[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶可降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞膠原纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)，膠原纖維溶解使軟骨細(xì)胞失去保護(hù)，且附著其結(jié)構(gòu)網(wǎng)上的蛋白聚糖滲透性增加導(dǎo)致組織腫脹壓力增高，綜合因素導(dǎo)致軟骨病理損害的惡性循環(huán)促進(jìn)KOA進(jìn)展[7]。而基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子能抑制膠原降解，維持膠原纖維網(wǎng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，提高軟骨保護(hù)作用[8]。有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶在KOA表達(dá)異常，打破與蛋白酶組抑制劑平衡從而導(dǎo)致ECM過度降解，引起軟骨退變[9]。

烙灸療法是具有鮮明地方特色的治療方法，是傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的一部分，具有“補腎通絡(luò)、強筋健骨”的作用[10]，團(tuán)隊前期研究發(fā)現(xiàn)烙灸療法可減少KOA軟骨細(xì)胞凋亡、延緩KOA進(jìn)展[11]，本研究在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討烙灸對兔KOA模型軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3、和TIMP-1表達(dá)的影響。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

30只成年健康新西蘭兔由寧夏醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，維持飼養(yǎng)環(huán)境一定的溫度和濕度，單籠飼養(yǎng)，12 h晝夜循環(huán)，不中斷水和食物供應(yīng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，第6天開始造模。

1.2 主要儀器、試劑和藥品

顯微鏡、凝膠成像系統(tǒng)、ABI7900 Q-PCR儀器(由寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實驗室提供)；石蠟切片機(德國徠卡RM2245)。MMP2、MMP3和TIMP1鼠抗兔多克隆抗體(Orb gen公司，AOK12761-1)，生物素-鏈霉卵白素兔免疫組化試劑盒(北京中衫金橋公司，生成批號：K142415E)，寡核苷酸引物oligo、逆轉(zhuǎn)錄酶RTase、4%多聚甲醛固定液、青霉素鈉粉針劑(80萬U/支)(銀川市偉博鑫生物科技有限公司)。烙灸所用艾絨(寧夏醫(yī)藥公司)。

2 實驗方法

2.1 模型制備

使用Hulth法制備KOA模型[12]。實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)5天后，模型對照組和烙灸干預(yù)組的所有動物進(jìn)行KOA造模。3%苯巴比妥鈉溶液(1 mL/kg)兔耳緣靜脈注射，麻醉滿意狀態(tài)下將實驗兔左后肢膝關(guān)節(jié)固定，做好局部脫毛、備皮、消毒工作，沿兔膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱向切開皮膚4 cm，暴露關(guān)節(jié)腔，探査關(guān)節(jié)腔內(nèi)有無原發(fā)病灶，切除內(nèi)側(cè)半月板，切斷前交叉韌帶，動作輕柔謹(jǐn)慎不傷及關(guān)節(jié)軟骨。止血，生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔后縫合關(guān)節(jié)囊及皮膚切口，最后碘伏棉球擦洗局部傷口，包扎敷貼，每只造模兔單籠內(nèi)自由活動。為預(yù)防傷口感染術(shù)后常規(guī)肌注青霉素鈉40萬U/只，連續(xù)3天；術(shù)后1周，每天驅(qū)趕強迫造模兔籠內(nèi)跑動15 min，2次/天，4周后可獲得穩(wěn)定的KOA模型[13]。

2.2 治療方法

造模4周后開始干預(yù)，烙灸干預(yù)組實驗兔固定在兔臺上，左膝關(guān)節(jié)局部剃毛并脫毛，將烙灸灸具放置在關(guān)節(jié)局部[14]，點燃灸槽內(nèi)艾絨3 g，烙灸灸具直接接觸兔左膝關(guān)節(jié)局部，烙灸灸具可使兔左膝關(guān)節(jié)局部皮膚發(fā)紅，每天1次，每次20 min，治療4周后進(jìn)行取材。模型對照組不予烙灸干預(yù)治療，只進(jìn)行兔臺固定步驟，20 min/天，4周后取材?？瞻讓φ战M同樣4周后取材，不予任何干預(yù)措施。

2.3 軟骨取材及SP免疫組化方法檢測

采取空氣栓塞法處死所有試驗動物，立即切開左膝關(guān)節(jié)腔，迅速切取、剝離脛骨平臺和股骨內(nèi)側(cè)髁的軟骨，一分為二：取一份立即放入液氮保存?zhèn)溆茫坏诙荼锨谐杉s0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小組織塊，4%多聚甲醛液固定、10%乙烯二胺四乙酸脫鈣，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，一份進(jìn)行常規(guī)HE染色，其余采用SP免疫組化方法檢測MMP2、MMP3和TIMP-1的表達(dá)。SP免疫組化切片采用Image-ProPlus 5.1圖像分析系統(tǒng)分析，隨機選取5個視野計算其平均值，灰度值反映陽性表達(dá)率。

2.4 免疫印跡(Western blot,WB)法檢測MMP2、MMP3和TIMP-1蛋白表達(dá)

取液氮保存的軟骨約50 mg，研磨至粉末狀，細(xì)胞裂解法提取軟骨總蛋白并測濃度，SDS-Page凝膠電泳，剝膠，轉(zhuǎn)膜，分別加入MMP2、MMP3和TIMP-1(1∶500)一抗，二抗IgG孵育。逐一顯影、定影、洗片、凝膠、成像，采用Image too 3.0影像軟件分析，參照β-actin條帶灰度值分析目標(biāo)蛋白條帶相對應(yīng)灰度值。

2.5 半定量RT-PCR檢測

取液氮保存的軟骨約10 mg置于Trizol液勻漿，氯仿混勻，離心后取上清加入等體積異丙醇，再離心，棄上清，完成總RNA提?。环蛛x總RNA之后，經(jīng)DEPC處理的雙蒸水稀釋，分光光度儀測定含量，分裝，-80℃保存?zhèn)溆?。以GAPDH作為內(nèi)參照，用半定量RT-PCR檢測各組MMP2、MMP3和TIMP-1 mRNA 表達(dá)水平。①反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總RNA樣品2 μL，加上MD(寡核苷酸引物)，經(jīng)AMV(家禽成髓細(xì)胞性白血病病毒)逆轉(zhuǎn)錄酶作用下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。②PCR擴增：擴增條帶，95℃，5 min；95℃變性，1 min后65℃退火，30 s；72℃延伸，60 s，上述條件下進(jìn)行40個循環(huán)擴增。各組引物序列按基因庫設(shè)計并合成如下：MMP2上游5′-GTGGATGATGCCTTTGCTCG-3′，下游5′-AGTCCGTCCTTACCGTCAAA-3′，152 bp；MMP3上游5′-CAAGTCCCTCAGGATTCTCGAAC-3′，下游5′-GGTGTGGATGCTTCTTGGGTAA-3′，187 bp；TIMP1上游5′-ATGGCGCCC-TTTGCATCTCT-3′,下游5′-TCAGGCTTCAGCTTTTGCCA-3′,654 bp；GAPDH上游5′-ATGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3′,下游5′-TTACTCCTTGGAGGCCATG-T-3′，317 bp。相應(yīng)的擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳后于成像系統(tǒng)攝片，光密度掃描，相對量分析時以GAPDH作校正。

2.6 觀察指標(biāo)

①SP免疫組化觀察MMP2、MMP3和TIMP-1表達(dá)；②Western blot檢測軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3和TIMP-1蛋白水平；③半定量RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3和TIMP-1的mRNA表達(dá)。

2.7 統(tǒng)計方法

3 結(jié)果

3.1 3組SP免疫組化檢測結(jié)果比較

MMP2、MMP3和TIMP-1在軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的陽性表達(dá)呈黃色或棕黃色顆粒，均分布于細(xì)胞質(zhì)。烙灸干預(yù)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中MMP2、MMP3的表達(dá)增多，高于空白對照組，但明顯低于模型對照組(P<0.05)；烙灸干預(yù)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的TIMP-1的表達(dá)減少，低于空白對照組，但明顯高于模型對照組(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 3組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中MMP2、MMP3和TIMP-1灰度值比較

注：與空白對照組比較,*P<0.01；與模型對照比較,#P<0.05。

圖1 3組實驗兔軟骨組織病理切片圖(100×)

3.2 3組Western blot檢測結(jié)果比較

烙灸干預(yù)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的MMP2、MMP3蛋白表達(dá)量增多，高于空白對照組，相對于模型對照組明顯減低(P<0.05)；烙灸干預(yù)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的TIMP-1蛋白表達(dá)較模型對照組明顯增高(P<0.05)。見圖2、3。

圖2 3組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3和TIMP-1蛋白相對表達(dá)水平

注：與空白對照組相比，*P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05。圖3 3組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3和TIMP-1蛋白相對表達(dá)量

3.3 3組RT-PCR檢測結(jié)果比較

烙灸干預(yù)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的MMP2、MMP3 mRNA表達(dá)量增多，高于空白對照組，相對于模型對照組明顯降低(P<0.05)；烙灸干預(yù)組軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的TIMP-1 mRNA表達(dá)較模型對照組明顯增高(P<0.05)。見圖4。

注：與空白對照組相比，*P<0.01；與模型對照組相比，#P<0.05。圖4 半定量RT-PCR檢測軟骨外基質(zhì)MMP2、MMP3和TIMP-1 mRNA的表達(dá)

4 討論

膝骨性關(guān)節(jié)炎在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中屬“痹證”范疇，屬于“骨痹”，發(fā)病主要與風(fēng)寒濕邪、勞損、氣血不足、肝腎虧虛等因素相關(guān)[15]，與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的流行病學(xué)因素相符合；病機為風(fēng)寒濕侵入機體，痹阻關(guān)節(jié)筋絡(luò)，導(dǎo)致腎虛骨痹，其治則為驅(qū)邪扶正，驅(qū)除風(fēng)寒濕瘀之邪，溫腎壯骨以扶正。依據(jù)《回回藥方·針灸門》“是凡一體內(nèi)，多有惡潤凝聚以致本體，……必以火灸之，則本體病根盡去”[16]中所闡述的回醫(yī)烙灸療法，是中醫(yī)化膿灸的發(fā)展與深化，具有刺激面積大、施灸量可控及鐵制灸具傳遞熱量迅速和均勻等優(yōu)點，具有濃郁的民族特色。通過局部的溫?zé)嶙饔渺畛肮潜浴本植课垩簼?、凝聚等病理產(chǎn)物，是具有地方民族特色的治療方法，起到“溫腎散寒、強筋壯骨”的作用，符合“膝痹”的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)治療原則。

軟骨外基質(zhì)的主要成分涉及膠原和蛋白聚糖，而基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的主要作用是通過水解酶類作用對細(xì)胞基質(zhì)分解代謝起催化作用，過度降解ECM成分，破壞關(guān)節(jié)軟骨纖維和膠原網(wǎng)結(jié)構(gòu)，使彈性喪失，對軟骨保護(hù)作用降低，加強軟骨代謝，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎[17]；根據(jù)底物特異性和結(jié)構(gòu)分為5種不同亞型，MMP2、MMP3分屬明膠酶和間質(zhì)溶酶素。MMP2屬于明膠酶A，可直接參與ECM的降解[18]，主要降解各型明膠、多糖、IV、V、VII、X型膠原等；MMP3可特異性降解蛋白多糖、層粘連蛋白及纖維粘連蛋白等，屬于間質(zhì)溶素；在正常的ECM中也有表達(dá)，但如果過度表達(dá)時，可激活MMPs的其他亞型，加速膠原的病理降解[19]。金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinase,TIMPs)屬于MMPs生理性抑制劑，其中，TIMP-1是TIMPs抑制MMPs活性最強的酶[20]，通過與MMPs不可逆的結(jié)合，抑制MMPs對ECM的降解，防止膠原、蛋白聚糖過度降解[21]。TIMPs與MMPs二者的平衡可以保持ECM合成和降解的平衡，如果二者動態(tài)失衡將導(dǎo)致軟骨ECM的過度降解而致軟骨細(xì)胞過度凋亡,促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。

本實驗通過烙灸治療兔KOA模型，觀察到烙灸可以顯著抑制兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3的蛋白、mRNA表達(dá)，而上調(diào)TIMP1的蛋白、mRNA表達(dá)，究其原因，可能與烙灸治療過程中，艾絨燃燒時發(fā)生熱的傳遞與滲透，熱能到達(dá)病變局部，調(diào)節(jié)了細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的合成代謝，有效降低細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解，維護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境的穩(wěn)定。同時，前期研究發(fā)現(xiàn)烙灸可以減輕兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡[11]，結(jié)合本次實驗發(fā)現(xiàn)烙灸可以改善細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝，驗證了KOA發(fā)病發(fā)展過程中軟骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)二者可以相互影響的關(guān)系。

烙灸可以降低軟骨細(xì)胞外基質(zhì)MMP2、MMP3表達(dá)，提高TIMP1的表達(dá)，同樣的結(jié)果在其他研究學(xué)者的實驗上也得到證實，闞衛(wèi)兵等學(xué)者[22]應(yīng)用基因芯片測定家兔KOA模型滑膜組織MMP2、MMP3，發(fā)現(xiàn)二者表達(dá)均增高。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，KOA軟骨細(xì)胞MMP2、MMP3表達(dá)經(jīng)針灸干預(yù)后顯著下調(diào)，而TIMP-1表達(dá)上調(diào)，達(dá)到糾正二者失衡、抑制ECM的過度降解、保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的作用[23-25]。綜上所述，烙灸療法對膝骨性關(guān)節(jié)炎的保護(hù)可能是通過烙灸下調(diào)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶、上調(diào)其蛋白酶抑制劑而起作用。