張偉浩 柳賢德 樸伶華

摘要：將轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）暴露于不同濃度的3種抗生素（鹽酸慶大霉素、硫酸硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素）中24 h，觀察其熒光變化。結(jié)果表明，以ABIX野生型斑馬魚胚胎進(jìn)行毒性試驗(yàn)，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素的最高合理濃度分別為120、150、240 μg/mL。3種抗生素對CYP1A轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚藥物暴露24 h后，鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素和鹽酸萬古霉素分別在2、4、0.4 μg/mL時(shí)開始出現(xiàn)熒光。而與對照（0 μg/mL鹽酸萬古霉素）相比，F(xiàn)lk1轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎只有當(dāng)240 μg/mL鹽酸萬古霉素的高濃度暴露下才會出現(xiàn)血管被顯著抑制的效果（P<0.05）。綜上所述，F(xiàn)lk1對這3種藥物的敏感度過低，不適合用于這3種抗生素污染的檢測，而CYP1A轉(zhuǎn)基因斑馬魚幼魚對這3種抗生素的敏感度都很高，可以作為這些抗生素污染的生物監(jiān)測手段，這進(jìn)一步開發(fā)了轉(zhuǎn)基因斑馬魚在水環(huán)境檢測氨基糖苷類和糖肽類抗生素污染中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：抗生素;轉(zhuǎn)基因斑馬魚;水質(zhì)檢測

中圖分類號： X832 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）22-0269-04

近年來，在全球各地自然環(huán)境中頻繁檢測到抗生素，這些抗生素大多數(shù)為人用非處方藥、獸用抗生素和飼料添加劑，其使用量大，持續(xù)時(shí)間持久，在環(huán)境中廣泛存在，對于非靶標(biāo)生物特別是水生生物的毒性作用逐漸受到重視。以我國為例，2013年全國36種常用抗生素總消耗量約為92 700 t，其中 54 000 t 抗生素經(jīng)由人和動物排泄到體外，經(jīng)過各種污水處理系統(tǒng)，最終53 800 t抗生素進(jìn)入自然環(huán)境中[1]。畜牧業(yè)使用的抗生素絕大多數(shù)以原藥被牲畜排泄物帶進(jìn)土壤后滲入地下水形成污染;水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用的抗生素則有70%～80%最終會進(jìn)入水環(huán)境[2]。目前使用較多的抗生素的種類主要有：β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、四環(huán)素類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、糖肽類抗生素、喹諾酮類等。

斑馬魚（zebrafish，Danio rario）具有個(gè)體小、發(fā)育周期短、養(yǎng)殖費(fèi)用低、體外受精、透明、單次產(chǎn)卵數(shù)較高以及對污染物的反應(yīng)快速等優(yōu)點(diǎn)。更重要的是，斑馬魚的基因與人類基因相似度高達(dá)87%，并擁有與人相似的組織器官和系統(tǒng)，被國際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）和經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（Organization for Economic Co-operation and Development，OECD）認(rèn)定為標(biāo)準(zhǔn)魚類毒性測試生物。水體受到污染物侵入后，魚的生存環(huán)境發(fā)生轉(zhuǎn)變，污染物通過魚類鰓呼吸運(yùn)動、吞食和魚體表面滲入進(jìn)入體內(nèi)，繼而魚類的生理活動隨著水體環(huán)境的污染程度做出反應(yīng)[3-4]。其行為變化遵循環(huán)境壓力模型，即隨時(shí)間經(jīng)歷穩(wěn)定、急劇變化、恢復(fù)、逐漸消失過程，行為強(qiáng)度會隨污染物濃度和時(shí)間而變化[5-6]。相比于斑馬魚成魚，早期生命階段的斑馬魚胚胎因其快速、敏感、高通量和體外測試等優(yōu)點(diǎn)被逐漸用于環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域，成為環(huán)境監(jiān)測的“哨兵”和“指示兵”[7]。

鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素同屬氨基糖苷類化合物，作為廉價(jià)的廣譜性抗菌素，在規(guī)?；B(yǎng)殖中使用廣泛，近年來也有鹽酸慶大霉素對雞瘟治理效果很好的相關(guān)報(bào)道[8]。我國是氨基糖苷類抗生素的主要生產(chǎn)國，至2010年，鹽酸慶大霉素產(chǎn)量突破2 500 t，其他如硫酸卡那霉素、奈替米星等的產(chǎn)量合計(jì)近1 000 t[9]。氨基糖苷類抗生素脂溶性差，因此人體和畜禽的胃腸道幾乎不吸收，肌肉注射后大部分以原藥經(jīng)腎排泄[10]，因此在食物鏈中的富集情況非常嚴(yán)重。有研究認(rèn)為氨基糖苷類抗性基因是在污水、廢水和動物糞便中最頻繁檢出的一類抗性基因[11]，在天然水體中也有檢出[12]，并且很多氨基糖苷類抗性基因與可移動遺傳元件有關(guān)。然而氨基糖苷類抗生素及其抗性基因?qū)Νh(huán)境影響的相關(guān)研究并不多。鹽酸萬古霉素屬于糖肽類抗生素，其作用機(jī)制主要是通過阻礙細(xì)菌細(xì)胞壁的合成導(dǎo)致致病菌死亡，臨床上主要用于治療嚴(yán)重革蘭氏陽性菌感染，尤其是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）感染[13]。因?qū)Ω锾m氏陽性菌有很強(qiáng)的抗菌效果，所以廣泛用于家禽、家畜等飼料添加劑和獸藥[14]。但這種藥物的濫用導(dǎo)致耐藥菌快速產(chǎn)生。據(jù)報(bào)道，2003年出現(xiàn)了大量耐鹽酸萬古霉素細(xì)菌[15]。因此，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定將鹽酸萬古霉素列為禁用獸藥。本試驗(yàn)選用這3種使用比較普遍的抗生素為對象，用生物監(jiān)測手段觀察轉(zhuǎn)基因斑馬魚對不同濃度抗生素的反應(yīng)，以期開發(fā)斑馬魚對于水質(zhì)快速檢測的潛力，使水質(zhì)抗生素檢測更經(jīng)濟(jì)快捷。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)藥品：鹽酸慶大霉素、硫酸卡那霉素、鹽酸萬古霉素（Biotopped，北京）。斑馬魚：ABIX野生型、Tg（CYP1A：GFP）和Tg（Flk1：EGFP）轉(zhuǎn)基因型品系購自國家斑馬魚資源中心（CZRC）。儀器設(shè)備：斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)（愛生科技發(fā)展有限公司，北京）;BPC-250 F型生化培養(yǎng)箱（一恒科學(xué)儀器有限公司，上海）;X71熒光顯微鏡（奧林巴斯公司，日本）;一次性吸管、培養(yǎng)皿、塑料六孔細(xì)胞培養(yǎng)板（TrueLine，美國）;三卡因甲磺酸鹽麻醉劑（簡稱TMS，CAS編號：886-86-2，Sigma-Aldrich公司，美國）;氯化鈉、碳酸氫鈉等化學(xué)藥品均為分析純，購自西隴科學(xué)股份有限公司;Heal Force超純水系統(tǒng)（力康集團(tuán)，香港）。

1.2 3種抗生素的毒性試驗(yàn)

斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)：為保證對照組胚胎死亡率小于5%，排除未受精及異常胚胎對毒性評價(jià)的干擾，本試驗(yàn)選擇在受精后48 h（48 hpf）開始暴露藥物。收集到胚胎6 h后，去除異常和死胚，最后挑選出發(fā)育正常的胚胎。試驗(yàn)濃度范圍根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置，將提前配制的高濃度儲備液用藍(lán)水稀釋到不同梯度，包含1個(gè)對照組，5個(gè)處理組。每個(gè)處理組包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，20個(gè)胚胎為1個(gè)重復(fù)。試驗(yàn)在6孔板中進(jìn)行，每孔加入20個(gè)健康胚胎，盡量去除水分之后再分別加入不同濃度的處理液5 mL，對照組加入等體積藍(lán)水。采用半靜態(tài)方式進(jìn)行暴露處理，將培養(yǎng)皿置于恒溫生化培養(yǎng)箱中，暴露總時(shí)間為96 h（即從48 hpf～144 hpf），培養(yǎng)箱孵化溫度為（28±0.5） ℃，處理液pH值維持在7，電導(dǎo)率約510 μS/cm，溶氧量>6 mg/L，胚胎保持光 —暗周期為14 h—10 h。毒性試驗(yàn)對斑馬魚胚胎每24 h更換1次處理液，及時(shí)挑出死亡的胚胎。每24 h對斑馬魚胚胎進(jìn)行1次鏡檢觀察，計(jì)量不同時(shí)期的各項(xiàng)生理指標(biāo)和死亡、畸形等數(shù)據(jù)，進(jìn)行記錄。

1.3 抗生素對血管發(fā)育的影響

3種抗生素的不同濃度對48 hpf的Flk1斑馬魚胚胎暴露24 h，然后用熒光顯微鏡觀察節(jié)間血管的直徑。

1.4 抗生素對CYP1A蛋白表達(dá)的影響

在對CYP1A和Flk1的試驗(yàn)中，斑馬魚胚胎于48 h用滅過菌的鑷子顯微鏡下手動破膜，并挑選出正常發(fā)育的幼魚。3種抗生素的不同濃度對48 hpf的CYP1A斑馬魚胚胎暴露 24 h，然后用熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度。

1.5 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2017年5月至2018年2月，在海南大學(xué)熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)與開發(fā)利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

CYP1A斑馬魚胚胎觀察其頭部熒光強(qiáng)度，用軟件Image J反轉(zhuǎn)成灰度值分析出其熒光強(qiáng)度，最終以熒光強(qiáng)度值相互比較;Flk1斑馬魚胚胎觀察其血管發(fā)育情況，選取中間部位的節(jié)間血管用Image-Pro plus分析出血管的直徑，試驗(yàn)每組每個(gè)濃度胚胎數(shù)量至少20個(gè)。所有數(shù)據(jù)用SPSS分析，graphpad作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚胚胎毒性試驗(yàn)

2.1.1 鹽酸鹽酸慶大霉素對胚胎死亡率的影響 根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，藥物暴露96 h后，900 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，所以筆者選用900 μg/mL為鹽酸慶大霉素的最高濃度。如圖1-A，藥物暴露24 h后鹽酸慶大霉素的毒性開始顯露，當(dāng)鹽酸慶大霉素為180 μg/mL時(shí)胚胎開始出現(xiàn)極少數(shù)死亡，死亡率只有2.5%。

2.1.2 硫酸硫酸卡那霉素對胚胎死亡率的影響 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，藥物暴露96 h后，1 000 μg/mL濃度組幼魚全部死亡，藥物暴露24 h后從200 μg/mL開始出現(xiàn)死亡（圖1-B）。

2.1.3 鹽酸萬古霉素對胚胎死亡率的影響 鹽酸萬古霉素不同濃度暴露96 h后，筆者發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽酸萬古霉素濃度為 1 200 μg/mL 時(shí)幼魚全部死亡，因此將1 000 μg/mL設(shè)為處理的最高濃度。藥物暴露24 h后當(dāng)鹽酸萬古霉素濃度為 300 μg/mL 時(shí)胚胎開始出現(xiàn)死亡，表明鹽酸萬古霉素的毒性發(fā)生點(diǎn)在200 μg/mL濃度持續(xù)處理24 h處（圖1-C）。

2.2 抗生素對血管發(fā)育的影響

根據(jù)抗生素對胚胎處理24 h毒性的影響（圖1），鹽酸慶大霉素選用40、80、120 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;硫酸卡那霉素選用50、100、150 μg/mL濃度處理Flk1幼魚;鹽酸萬古霉素選用80、160、240 μg/mL濃度處理幼魚。鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素處理組的節(jié)間血管發(fā)育與對照（0 μg/mL）相比無顯著差異，當(dāng)鹽酸萬古霉素濃度為240 μg/mL處理時(shí)胚胎血管直徑與對照出現(xiàn)顯著差異（P<0.05）（圖2、圖3），節(jié)間血管的直徑減少至2 μm以下。

2.3 抗生素對CYP1A蛋白表達(dá)的影響

預(yù)試驗(yàn)表明，隨著藥物處理時(shí)間的延長，幼魚最先出現(xiàn)綠色熒光的是腦部。由圖4可知，藥物暴露24 h后，這3種抗生素低濃度時(shí)可以促進(jìn)CYP1A蛋白質(zhì)的表達(dá)，并有濃度依賴性。由圖4、圖5可知，2 μg/mL鹽酸慶大霉素處理組開始出現(xiàn)熒光，隨著濃度增加各組間熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)并具有顯著差異（P<0.05）;4 μg/mL硫酸卡那霉素處理組開始出現(xiàn)熒光，6 μg/mL處理組的熒光強(qiáng)度是4 μg/mL組的4倍，各組與對照組均具有顯著差異（P<0.05）;其中，CYP1A蛋白對鹽酸萬古霉素的敏感性比鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更強(qiáng)，在0.4 μg/mL處理組就開始出現(xiàn)熒光，相比于氨基糖苷類的鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素更敏感。

3 討論

氨基糖苷類抗生素具有較強(qiáng)的腎毒性和耳毒性[16]，其濫用濫排現(xiàn)象已對人類和動物的生存環(huán)境構(gòu)成威脅。鹽酸萬古霉素屬糖肽類抗生素，起初因良好的耐藥菌治療效果在畜牧行業(yè)大量使用，因其濫用造成耐鹽酸萬古霉素菌快速形成。這些表明，環(huán)境中抗生素的污染不容小覷，因此，抗生素的早期檢測是非常重要的。筆者希望轉(zhuǎn)基因斑馬魚在作為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)模式動物“寵兒”的同時(shí)，也能在水環(huán)境監(jiān)測中起到作用。

Flk1（EGFP）斑馬魚是針對血管發(fā)綠色熒光的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，Cross等運(yùn)用G-RCFP標(biāo)記插到VEGF2基因的啟動子序列表達(dá)，從而得到了有綠色熒光血管的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，能很清楚地觀察到血管的狀態(tài)[17]。利用血管的可視化，可以快速準(zhǔn)確地看出藥物對血管的作用，本試驗(yàn)結(jié)果表明，鹽酸慶大霉素和硫酸卡那霉素在一定濃度下對血管發(fā)育沒有明顯影響，而鹽酸萬古霉素在較高濃度時(shí)才有抑制血管生成的作用，這說明Flk1轉(zhuǎn)基因斑馬魚不適用于這3種抗生素的快速檢測。

CYP1A屬于細(xì)胞色素P450超家族，廣泛分布于腦、肝及其他很多部位中，參與烴類致癌物的代謝，CYP1A2在肝組織中有特異性表達(dá)，參與許多前致癌物和前毒物的代謝活化[18]。CYP1A轉(zhuǎn)基因斑馬魚目前在水質(zhì)檢測方面較多應(yīng)用于多環(huán)芳香烴類化合物的檢測[19]，很少用于其他污染物的檢測。Ohlsen等檢測醫(yī)院廢水中的抗生素濃度，其中鹽酸慶大霉素的濃度不低于0.01 mg/L[20]。本試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，鹽酸慶大霉素和硫酸硫酸卡那霉素濃度分別為2 μg/mL和4 μg/mL時(shí)，CYP1A斑馬魚頭部開始出現(xiàn)熒光。鹽酸萬古霉素濃度為0.4 μg/mL時(shí)，幼魚頭部開始出現(xiàn)熒光，這表明CYP1A對鹽酸萬古霉素更敏感。所以CYP1A具有作為氨基糖苷類化合物生物監(jiān)測手段的潛力。

4 結(jié)論

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)也越來越成熟。本試驗(yàn)得出，CYP1A斑馬魚在用于檢測鹵化芳香族碳?xì)浠衔锏耐瑫r(shí)，也可以作為其他部分化合物的生物標(biāo)記。Flk1斑馬魚對這3種抗生素的敏感程度太低，所以不適合作為這3種抗生素的檢測手段。這說明一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚在用于醫(yī)學(xué)定向研究的同時(shí)可能還具有用于檢測水體中化合物污染的作用，這進(jìn)一步擴(kuò)展了轉(zhuǎn)基因斑馬魚的用途，為水體環(huán)境污染的快速監(jiān)測提供了更經(jīng)濟(jì)方便的手段。

參考文獻(xiàn)：

[1]Zhang Q Q，Ying G G，Pan C G，et al. Comprehensive evaluation of antibiotics emission and fate in the river basins of China：source analysis，multimedia modeling，and linkage to bacterial resistance[J]. Environmental Science & Technology，2015，49（11）：6772-6782.

[2]葉必雄，張 嵐. 環(huán)境水體及飲用水中抗生素污染現(xiàn)狀及健康影響分析[J]. 環(huán)境與健康雜志，2015，32（2）：173-178.

[3]Depledge M H，Aagaard A，Gyrks P. Assessment of trace metal toxicity using molecular，physiological and behavioural biomarkers[J]. Marine Pollution Bulletin，1995，31（1/2/3）：19-27.

[4]Wang W X. Dietary toxicity of metals in aquatic animals：recent studies and perspectives[J]. Chinese Science Bulletin，2013，58（2）：203-213.

[5]Ren Z M，Zha J M，Ma M，et al. The early warning of aquatic organophosphorus pesticide contamination by on-line monitoring behavioral changes of Daphnia magna[J]. Environmental Monitoring & Assessment，2007，134（1）：373-383.

[6]Li Y，Lee J M，Chon Tae-soo，et al. Analysis of movement behavior of zebrafish （DANIO RERIO） under chemical stress using Hidden Markov model[J]. Modern Physics Letters B，2013，27（2）：1350014.

[7]馬中雨，陳家全，陳興廳，等. 斑馬魚對水源特定污染物的水質(zhì)監(jiān)測預(yù)警[J]. 中國環(huán)境監(jiān)測，2015，31（1）：146-151.

[8]趙運(yùn)吉. 鹽酸慶大霉素治雞瘟有特效[J]. 今日畜牧獸醫(yī)，2018，34（7）：81.

[9]Aruguete D M，Kim B，Jr H M，et al. Antimicrobial nanotechnology：its potential for the effective management of microbial drug resistance and implications for research needs in microbial nanotoxicology[J]. Environmental Science Processes & Impacts，2013，15（1）：93-102.

[10]張 紅，程寒飛. 水環(huán)境中氨基糖苷類抗性基因污染及研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2018，41（10）：121-130.

[11]Heuer H，Krgerrecklenfort E，Wellington E M H，et al.[J]. Fems Microbiology Ecology，2002，42（2）：289-302.

[12]Hsu C Y，Hsu B M，Ji W T，et al. A potential association between antibiotic abuse and existence of related resistance genes in different aquatic environments[J]. Water Air & Soil Pollution，2015，226（1）：2235.

[13]鹽酸萬古霉素臨床應(yīng)用劑量專家組. 鹽酸萬古霉素臨床應(yīng)用劑量中國專家共識[J]. 中華傳染病雜志，2012，30（11）：641-646.

[14]何方洋，羅曉琴，張 禹，等. 牛奶中鹽酸萬古霉素殘留的膠體金免疫層析法測定試驗(yàn)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2013（15）：82-193.

[15]Fridkin S K，Hageman J，McDougal L K，et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin，United States，1997-2001[J]. Clinical Infectious Diseases，2003，36（4）：429-439.

[16]柳林整. 氨基糖苷類抗生素耳毒性機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 青島醫(yī)藥衛(wèi)生，2003（3）：221-223.

[17]Cross L M，Cook M A，Lin S，et al. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay[J]. Arteriosclerosis Thrombosis & Vascular Biology，2003，23（5）：911-912.

[18]孫智慧，賈順姬，孟安明. 斑馬魚：在生命科學(xué)中暢游[J]. 生命科學(xué)，2006，18（5）：431-436.

[19]Guiney P D，Walker M K，Spitsbergen J M，et al. Hemodynamic dysfunction and cytochrome P4501A mRNA expression induced by 2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin during embryonic stages of lake trout development[J]. Toxicology and Applied Pharmacology，2000，168（1）：1-14.

[20]Ohlsen K，Ternes T，Werner G，et al. Impact of antibiotics on conjugational resistance gene transfer in Staphylococcus aureus in sewage[J]. Environmental Microbiology，2003，5（8）：711-716.