楊 培，譚建華，李慧勇，郭長(zhǎng)虹，熊小婷，夏澤敏，李少飛，莫庭源，廖惠媚

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院，廣東 廣州 510000)

天然植物中存在豐富的生物活性物質(zhì)，早在1985年，已有1 600多種植物被報(bào)道具有抗真菌、抗細(xì)菌等防止有害生物的活性[1]。隨后，國(guó)內(nèi)外的大量研究證明多種植物提取物含有抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化等多種生物活性成分[2-4]。隨著植物源活性成分研究的深入，以及“天然”理念在產(chǎn)品設(shè)計(jì)中的推崇，越來越多的植物源活性成分被應(yīng)用于牙膏的配方中，如牡丹皮提取物的丹皮酚(Pae)[5]，厚樸提取物中的厚樸酚(Mag)、和厚樸酚(Hon)[6]，甘草的主要成分甘草次酸(Gly)[7]，百里香屬植物揮發(fā)油的主要成分麝香草酚(Thy)[8]等。此類化合物均為藥物成分，具有一定的藥性[9]：甘草味甘、性平，但甘草中甘草次酸的結(jié)構(gòu)和作用類似于腎上腺皮質(zhì)激素，長(zhǎng)期濫用會(huì)產(chǎn)生身體浮腫、血鈉濃度升高等不良反應(yīng)[10-11]；厚樸、和厚樸酚類雖具有較大的臨床功效，但報(bào)道顯示中藥減肥人群中腎功能衰竭與防己、厚樸有關(guān)[12]；麝香草酚對(duì)HEK293 細(xì)胞和Vero細(xì)胞的最大無毒濃度分別為62.5 mg/L和50 mg/L[13]。因此，牙膏中過量添加此類藥用成分可能有潛在危害。為監(jiān)控產(chǎn)品質(zhì)量，保障消費(fèi)者的健康，亟需建立牙膏中該5種化合物的檢測(cè)方法。

目前，僅QB/T 2966-2014《功效性牙膏》[14]中規(guī)定了丹皮酚的測(cè)試方法，牙膏中麝香草酚等其他4種物質(zhì)尚無標(biāo)準(zhǔn)，該4種物質(zhì)的相關(guān)研究主要集中于膠囊、軟膏、藥丸、藥材、口服液等藥物領(lǐng)域，分析方法包括氣相色譜法(GC)[15-18]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[19-21]、超臨界流體色譜法(SFC)[22]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(HPLC-MS)[23]、毛細(xì)管電泳法(CE)[24]、電化學(xué)法[25]、近紅外光譜法(NIR)[26-27]及液相色譜法[28-31]。本研究采用超高效液相色譜建立了牙膏中丹皮酚、麝香草酚、和厚樸酚、厚樸酚、甘草次酸5種植物源活性成分的快速測(cè)定方法，方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、準(zhǔn)確，可滿足牙膏中5種植物源活性成分的檢測(cè)要求，已成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜儀配PDA二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司)，Milli-Q 超純水器(美國(guó)Millipore公司)，Allegra 64R centrifuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)，超聲儀(上海Kudos公司)，電子分析天平(精確至0.01 mg和0.1 mg)。標(biāo)準(zhǔn)品：丹皮酚、厚樸酚、和厚樸酚、甘草次酸(純度98%，上海Nature Standard公司)，麝香草酚(純度99.5%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。甲酸(純度98%,上海阿拉丁試劑有限公司)，乙腈、甲醇(色譜純,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)，其他試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分別稱取丹皮酚、麝香草酚、厚樸酚、和厚樸酚、甘草次酸標(biāo)準(zhǔn)品各0.1 g(精確至0.000 1g)于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配成質(zhì)量濃度為2 000 mg/L 的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中，用90%(體積分?jǐn)?shù))甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為1、5、10、25、50、75、100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，待測(cè)。

1.3 樣品的提取

稱取牙膏樣品1 g(精確至0.001 g)于10 mL具塞比色管中，以90%甲醇定容，加入適量石英砂，于渦旋振蕩器上振蕩混勻，超聲提取15 min，靜置至室溫，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，濾液待測(cè)。必要時(shí)以90%甲醇稀釋濾液，備用。

1.4 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?HSS C18(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：3 μL，柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：0.1%甲酸(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序：0～1.5 min，70%～60% A；1.5～5.5 min，60%～0% A；5.5～6.0 min，0% A；6.0～6.5 min，0%～70% A；6.5～9.0 min，70% A。檢測(cè)波長(zhǎng)：丹皮酚、麝香草酚為275 nm；和厚樸酚、厚樸酚、甘草次酸為250 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

圖1 甲醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)樣品加標(biāo)響應(yīng)面積的影響Fig.1 Effect of volume fraction of methanol on response area of the sample

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

待測(cè)化合物的化學(xué)性質(zhì)各異，且待測(cè)化合物作為牙膏的添加成分，與牙膏中其他基礎(chǔ)成分(摩擦劑、發(fā)泡劑、保濕劑、增稠劑等)間的化學(xué)性質(zhì)不同，因此待測(cè)化合物間、待測(cè)化合物與牙膏其他基礎(chǔ)成分間于不同溶劑中的溶解度均有差異。本文分別考察了不同有機(jī)溶劑以及有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)對(duì)加標(biāo)樣品提取效果的影響。

實(shí)驗(yàn)考察了不同有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、四氫呋喃)對(duì)加標(biāo)樣品提取效果的影響，結(jié)果表明，以甲醇為溶劑時(shí)的提取效率較高，且雜質(zhì)干擾較小。另考察了甲醇的體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響,由圖1可知，當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)由10%增至90%時(shí)，5種化合物的響應(yīng)值逐漸增大；繼續(xù)增大甲醇的體積分?jǐn)?shù)，5種化合物的響應(yīng)值基本不變。由于牙膏的發(fā)泡劑成分(如十二烷基硫酸鈉、十二?；“彼徕c)、增稠劑成分(如羧甲基纖維素鈉、黃原膠)的水溶性較好，為保證牙膏樣品在提取溶劑中的分散效果，本文選擇90%甲醇為提取溶劑。

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察了流動(dòng)相pH值(2.0、2.8、4.0、5.0、6.0、7.0)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明，當(dāng)pH≥6.0時(shí)，甘草次酸的色譜峰變寬，出峰時(shí)間逐漸提前。色譜峰變寬可能是由于pH≥6.0時(shí)甘草次酸離子化后與固定相殘留的硅醇基相互作用增強(qiáng)；出峰時(shí)間提前是由于甘草次酸離子化后極性增強(qiáng)，在反相色譜柱中的保留變?nèi)?。因此?yīng)選擇流動(dòng)相pH<6.0，以避免甘草次酸離子化。由于pH 2.8時(shí)丹皮酚、麝香草酚、厚樸酚、和厚樸酚的半峰寬較小，分離度較高，且甘草次酸的峰對(duì)稱性及分離度滿足實(shí)驗(yàn)要求，因此采用0.1% 甲酸(pH 2.8)為流動(dòng)相。

2.4 線性關(guān)系、檢出限及定量下限

取“1.2”中配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖見圖2。以Pae、Thy、Hon、Mag和Gly的質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積(Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。由表1可知，Pae、Thy、Hon和Mag在2～100 mg/L 范圍內(nèi)，Gly在5～100 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999。采用基質(zhì)樣品加標(biāo)方法，通過計(jì)算其樣品加標(biāo)的響應(yīng)與背景噪音的比值分別確定方法檢出限(S/N≈3)和定量下限(S/N≈10)，得到5種化合物的方法檢出限(LOD)為0.2～1.0 mg/kg，定量下限(LOQ)為0.8～3.5 mg/kg(表1)。

CompoundLinear equationLinear range(mg/L)rLOD(mg/kg)LOQ(mg/kg)PaeY=192 558X+93 8392～1000.999 10.20.8ThyY=830X+16 5432～1000.999 60.51.7HonY=70 734X+47 0292～1000.999 00.51.7MagY=25 366X+31 6202～1000.999 80.51.7GlyY=13 612X+24 7715～1000.999 51.03.5

2.5 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

為驗(yàn)證該方法對(duì)不同基質(zhì)牙膏的適用性，選取3種不同配方體系的空白牙膏樣品——水合硅石(SiO2)、磷酸氫鈣(CaHPO3)和碳酸鈣(CaCO3)體系，分別加入4個(gè)濃度的Pae、Thy、Hon、Mag和Gly混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)。由表2可知，5種化合物在4個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率為90.5%～99.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.7%～5.1%，表明方法具有較高的準(zhǔn)確度，且精密度良好。

表2 牙膏中添加5種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 2 Recoveries and relative standard deviations(RSDs) of toothpaste spiked mixed standard solutions(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)50支市售牙膏樣品進(jìn)行Pae、Thy、Hon、Mag和Gly含量的測(cè)定。結(jié)果顯示，10支牙膏檢出Pae，含量為100 ～500 mg/kg；2支牙膏均檢出Mag、Hon，Mag含量分別為428、453 mg/kg，Hon含量分別為467、473 mg/kg。

3 結(jié) 論

本研究建立了超高效液相色譜同時(shí)檢測(cè)牙膏中5種植物源活性成分的分析方法。樣品采用90%甲醇超聲提取，保證了在分析測(cè)試過程中的提取效率。本方法靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡(jiǎn)單、分析快速、準(zhǔn)確可靠，可滿足牙膏中丹皮酚、麝香草酚、厚樸酚、和厚樸酚、甘草次酸的檢測(cè)要求。