田曉春 ，吳雪娥 ，詹東平 ，趙峰 ，姜艷霞 ，孫世剛

1廈門大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，福建 廈門 361005

2中國(guó)科學(xué)院城市環(huán)境研究所，中國(guó)科學(xué)院城市污染物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361021

1 引言

生物電化學(xué)系統(tǒng)利用微生物催化不同氧化還原反應(yīng)實(shí)現(xiàn)電子轉(zhuǎn)移，已應(yīng)用于污染物強(qiáng)化轉(zhuǎn)化和微生物產(chǎn)電等領(lǐng)域1，是一種發(fā)展前景廣闊的能源物質(zhì)轉(zhuǎn)化新技術(shù)。目前，電化學(xué)活性微生物的胞外電子傳遞途徑主要包括直接電子傳遞和間接電子傳遞2，其中，電子穿梭體介導(dǎo)的間接電子傳遞可提高生物電化學(xué)系統(tǒng)的能量轉(zhuǎn)化率3,4，其相關(guān)研究能推動(dòng)污染修復(fù)及生物能源的發(fā)展5。

伏安法、恒電位法是研究微生物在電極/溶液界面轉(zhuǎn)移電子的重要手段6–8。Marsili等9利用循環(huán)伏安和恒電位，測(cè)得Shewanella生物膜分泌的flavins能介導(dǎo)電子傳遞并在微生物細(xì)胞和胞外固體間進(jìn)行周期性氧化還原循環(huán)。但是，這種間接電子傳遞途徑是基于生物膜層面的推測(cè)，由于生物膜內(nèi)部組成復(fù)雜，其中包含的各種分泌物10、胞外聚合物等也具有電子傳遞以及氧化還原能力11,12，因此這種機(jī)制有待于進(jìn)一步確認(rèn)。

掃描電化學(xué)顯微鏡(SECM)13,14的微電極具有準(zhǔn)確定位、靈敏度高的特點(diǎn)，已用于監(jiān)測(cè)生物膜的形成及其微區(qū)環(huán)境的變化，如pH15,16、銅離子濃度分布17、H2O2濃度18,19等。SECM的微電極在三維空間的位置能夠準(zhǔn)確控制，當(dāng)微電極沒(méi)有直接接觸到微生物細(xì)胞且二者距離超過(guò)10 nm，微電極不會(huì)收集到由直接電子傳遞途徑所產(chǎn)生的電流。如果有電子中介體在微生物和探針電極之間介導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移，那么探針電極收集的電流僅來(lái)自間接電子傳遞的貢獻(xiàn)；此外，利用SECM的穿透模式能夠得到微電極穿過(guò)生物膜過(guò)程中的電流變化，從而反映微生物在電極/溶液界面的分布。因此，本論文構(gòu)建SECM體系，利用穿透模式研究微生物在電極/溶液界面的電子傳遞方式和空間分布。另外，在構(gòu)建SECM體系時(shí)，需要選擇合適的電子穿梭體，考慮到自然界中廣泛存在微生物與含鐵礦物的相互作用以及地球化學(xué)鐵循環(huán)的意義，選擇電化學(xué)性質(zhì)簡(jiǎn)單、明確的可溶性鐵化合物二茂鐵甲醇(FcMeOH)作為電子穿梭體介導(dǎo)Shewanella的間接電子傳遞過(guò)程。本研究基于SECM 的穿透模式，通過(guò)微電極收集來(lái)自間接電子傳遞產(chǎn)生的電流，測(cè)定電極/溶液界面生物膜的厚度等空間分布信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑和材料

試劑：二茂鐵甲醇(FcMeOH，購(gòu)買于Sigma-Aldrich)；蛋白胨和酵母提取物由英國(guó)Oxoid公司生產(chǎn)，為生物技術(shù)級(jí)。NaCl、KCl、NaH2PO4和Na2HPO4均為分析純。

材料：氧化銦錫導(dǎo)電玻璃(ITO，厚1.1 mm，表面電阻＜ 17 Ω·□-1)購(gòu)買于珠海凱為光電科技有限公司；鉑絲(直徑25 μm)購(gòu)買于阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司；飽和甘汞電極和Ag/AgCl參比電極購(gòu)買于上海辰華儀器有限公司。

2.2 微生物的培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)中使用的菌株 Shewanella oneidensis MR-1在pH為7.0的Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基中32 °C恒溫培養(yǎng)18 h。其中，LB培養(yǎng)基的組成為蛋白胨10 g·L-1、酵母提取物5 g·L-1和氯化鈉5 g·L-1。

本實(shí)驗(yàn)中將微生物富集在 ITO電極表面的步驟如下：首先，以5000 r·min-1的轉(zhuǎn)速離心菌液，除去發(fā)酵上清液；用100 mmol·L-1的PBS (pH 7.0)溶液重新分散后離心清洗；重復(fù)兩次后，用移液槍移取沉淀覆蓋在電極表面，自然風(fēng)干至微生物附著在電極表面不會(huì)脫落。

2.3 電化學(xué)實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)中使用上海辰華儀器有限公司生產(chǎn)的CHI660D電化學(xué)工作站研究微生物的電化學(xué)性質(zhì)。掃描電化學(xué)顯微鏡使用CHI920C電化學(xué)工作站，構(gòu)建三電極體系時(shí)，飽和甘汞電極(SCE)或飽和Ag/AgCl作參比電極，鉑絲作對(duì)電極，工作電極為ITO或富集有S. oneidensis MR-1的ITO，探針電極使用自制的直徑為25 μm的Pt微電極，制備方法及表征如圖 S1–S3 (Supporting Information)。

微生物的基本電化學(xué)性質(zhì)測(cè)定用磷酸鹽緩沖溶液(PBS：100 mmol·L-1，pH 7.0)作為電解液；在研究微生物與電子穿梭體相互作用的電極過(guò)程以及穿透模式時(shí)，電解液中含 1 mmol·L-1FcMeOH。

圖1 SECM的穿透模式測(cè)定S. oneidensis MR-1生物膜的示意圖(a)和照片(b)Fig. 1 (a) Schematic diagram for penetration mode and (b) image of SECM cell.

圖2 Pt微電極和Shewanella/ITO基底電極的循環(huán)伏安圖，掃描速率為50 mV·s–1Fig. 2 CVs of Pt microelectrode and S. oneidensis MR-1/ITO substrate, respectively.Scan rates are 10 mV·s-1.

3 結(jié)果與討論

3.1 構(gòu)建SECM體系測(cè)定電極/溶液界面的微生物

穿透模式是SECM的模式之一，利用探針電極穿透微結(jié)構(gòu)獲取電化學(xué)信息20。構(gòu)建SECM體系利用微電極穿透電極/溶液界面的生物膜并獲取電化學(xué)信息，原理如圖1a所示。首先，確定可用于SECM實(shí)驗(yàn)體系的基底。排除生物膜組成復(fù)雜的影響，將培養(yǎng)好的S. oneidensis MR-1離心清洗后滴加至 ITO 電極表面形成 S. oneidensis MR-1/ITO基底，5 min后向電解池中加入電解液，此時(shí) S. oneidensis MR-1不會(huì)立刻擴(kuò)散至電解液中，因此能保持清晰的溶液/微生物界面，如圖1b所示。其次，以25 μm的Pt微電極作為探針電極。

利用穿透模式測(cè)定電極/溶液界面的微生物時(shí)，首先要討論電子穿梭體分別在探針電極和基底電極的氧化還原過(guò)程。微電極置于含有 1 mmol·L-1FcMeOH 的電解液中，同時(shí)記錄微電極和基底電極的循環(huán)伏安曲線，結(jié)果如圖2所示。其中，曲線 1為 Pt微電極在本體溶液中測(cè)得的循環(huán)伏安曲線，在-0.2 – +0.6 V范圍內(nèi)呈“S”形，檢測(cè)到的FcMeOH的氧化電流在0.26 V達(dá)到穩(wěn)態(tài)為3.2 nA，此值與微電極在1 mmol·L-1FcMeOH溶液中得到的穩(wěn)態(tài)氧化電流值一致(圖 S2)，這說(shuō)明微生物的存在對(duì)本體溶液的FcMeOH的濃度無(wú)影響。曲線2為S. oneidensis MR-1/ITO基底電極的氧化還原過(guò)程，其中氧化和還原峰 I分別為 S.oneidensis MR-1的氧化和還原(圖S4)，這是其表面與直接電子傳遞相關(guān)的細(xì)胞色素 c的氧化和還原21,22；在電位高于0.25 V時(shí)，氧化電流逐漸增加，此電流來(lái)自于FcMeOH的氧化。

另外，圖2中微電極和Shewanella/ITO基底電極經(jīng)過(guò)連續(xù)兩周循環(huán)伏安掃描，得到的循環(huán)伏安曲線幾乎重合，這說(shuō)明 ITO與 S. oneidensis MR-1形成的界面穩(wěn)定，該實(shí)驗(yàn)體系適用于Shewanella的電化學(xué)性質(zhì)測(cè)定。

3.2 S. oneidensis MR-1與電子中介體相互作用的電極過(guò)程

為了進(jìn)一步確定 FcMeOH與 S. oneidensis MR-1互相作用的界面過(guò)程，降低電解液中的FcMeOH濃度至0.01 mmol·L-1，結(jié)果如圖3a。其中，曲線2為測(cè)定FcMeOH在ITO表面的氧化還原峰(II)電位分別為0.24和0.15 V；當(dāng)S. oneidensis MR-1在電極/溶液界面時(shí)，只能觀察到 FcMeOH的氧化過(guò)程(III)，而沒(méi)有隨后 FcMeOH+被還原的過(guò)程，并且氧化電流達(dá)到最大值的電位約為 0.4 V，由此可以推測(cè)氧化過(guò)程產(chǎn)生的 FcMeOH+被電極表面的微生物還原。電極反應(yīng)如圖3b所示：開(kāi)路時(shí)，F(xiàn)cMeOH在本體溶液和電極界面以還原態(tài)存在，不存在被電極和微生物還原的反應(yīng)；當(dāng)電極電勢(shì)控制為氧化過(guò)程時(shí)，電極氧化FcMeOH為FcMeOH+，此時(shí)S. oneidensis MR-1能夠?qū)a(chǎn)生的FcMeOH+還原為 FcMeOH，這個(gè)過(guò)程促進(jìn)FcMeOH在微生物和電極之間的氧化還原；當(dāng)電極電勢(shì)控制為還原過(guò)程時(shí)，電極和微生物同時(shí)競(jìng)爭(zhēng)還原在氧化過(guò)程產(chǎn)生的 FcMeOH+，F(xiàn)cMeOH+還未及時(shí)擴(kuò)散到電極表面已經(jīng)被微生物還原，因此電極未檢測(cè)到 FcMeOH+的還原峰。因此，F(xiàn)cMeOH能夠作為外源性電子穿梭體介導(dǎo)Shewanella與電極之間的電子傳遞。

圖3 (a) ITO和S. oneidensis MR-1/ITO在0.01 mmol·L-1 FcMeOH溶液中的循環(huán)伏安曲線，掃描速率50 mV·s-1；(b) S. oneidensis MR-1與FcMeOH在電極/溶液界面的相互作用Fig. 3 (a) CV curves of ITO and S. oneidensis MR-1 in PBS with 0.01 mmol·L-1 FcMeOH. Scan rate was 50 mV·s-1； (b) Reaction between S. oneidensis MR-1 and FcMeOH at ITO/solution interface during the oxidation and reduction process.

另外，圖3a中的循環(huán)伏安曲線1的氧化峰(I)和還原峰(I)均更明顯，這對(duì)氧化還原峰與圖 2中曲線 2的氧化還原峰(I)是一致的。此結(jié)果也表明FcMeOH未破壞微生物表面的細(xì)胞色素 c的電化學(xué)活性，是本研究所需要的電子穿梭體。

3.3 穿透模式研究電極/溶液界面Shewanella生物膜的空間結(jié)構(gòu)

圖4 Pt微電極從本體溶液到生物膜的漸進(jìn)曲線(a)及其示意圖(b)，探針電勢(shì)為0.3 V；(c)探針電極穿透生物膜不同距離時(shí)的循環(huán)伏安曲線，掃描速率為50 mV·s-1Fig. 4 (a) Approaching curve and (b) schematic diagram of Pt tip from bulk solution into biofilm. Probe E = 0.3 V；(c) Cyclic voltammograms of Pt microelectrode which penetrated different distance into biofilm.Scan rates are 50 mV·s-1.

以循環(huán)伏安實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，在穿透模式下，控制微電極從本體溶液起逐漸靠近基底，穿透溶液/微生物/電極的界面，并收集變化的探針電極電流，結(jié)果如圖4a，b所示。其中，圖4a中橫坐標(biāo)d為探針電極從本體溶液向生物膜漸進(jìn)過(guò)程中行進(jìn)的距離。首先設(shè)置探針處于本體溶液，當(dāng)它在本體溶液中沿 z軸方向漸進(jìn)時(shí)，收集到的電流平穩(wěn)，來(lái)自于本體溶液中的FcMeOH的氧化反應(yīng)；在探針電極移1100 μm時(shí)，電流開(kāi)始增加，此時(shí)微電極進(jìn)入微生物/溶液界面，根據(jù)圖3b中的氧化過(guò)程，可以推斷此時(shí)電流的增加來(lái)源于微生物與電極之間的正反饋；當(dāng)探針移動(dòng)約2100 μm時(shí)，探針電流達(dá)到最大值并且穩(wěn)定，表明生物膜/溶液界面內(nèi)的此區(qū)域里 FcMeOH的濃度相對(duì)均勻區(qū)域，厚度約為500 μm；在2600 μm后電流開(kāi)始呈線性減小，此時(shí)探針電極已進(jìn)入生物膜內(nèi)部，受微生物的阻礙能擴(kuò)散到探針電極表面的 FcMeOH減少，同時(shí)，微生物能夠?qū)⒋藭r(shí)產(chǎn)生的FcMeOH+完全還原，因此探針電極電流持續(xù)減小。當(dāng)探針漸進(jìn)約3700 μm時(shí)電極微電極觸碰ITO基底，因此得到實(shí)驗(yàn)中生物膜的厚度約為1100 μm。

為了確認(rèn)生物膜內(nèi)探針電極收集到的電流減小的原因，控制探針電極首先在生物膜/溶液的界面處(圖4a中1位置)測(cè)量循環(huán)伏安曲線，隨后依次漸進(jìn) 200 μm在生物膜內(nèi)測(cè)試循環(huán)伏安曲線(圖4a中2–5位置)，結(jié)果如圖 4c中曲線1–5所示。當(dāng)探針電極進(jìn)入生物膜之前，得到的循環(huán)伏安曲線1已經(jīng)不同于其在本體溶液中得到的“S”形，但此時(shí)氧化過(guò)程產(chǎn)生的FcMeOH+在還原過(guò)程中仍能被探針電極檢測(cè)到，約為-1.2 nA。當(dāng)微電極進(jìn)入生物膜之后(循環(huán)伏安曲線2–5)，隨著深度增加，氧化電流的起始電位正移；相同氧化電位下的氧化電流逐漸減小，氧化電流在0.5 V之前均未達(dá)到穩(wěn)態(tài)。另外，探針電極位于生物膜內(nèi)時(shí)，還原電位對(duì)應(yīng)的電流明顯消失。這些實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象反映的結(jié)果能夠進(jìn)一步確定如圖 3b所示的 FcMeOH與Shewanella相互作用的電極反應(yīng)機(jī)理。

4 結(jié)論

本文研究了S. oneidensis MR-1與電子穿梭體FcMeOH相互作用的電極反應(yīng)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了溶液/微生物/電極界面結(jié)構(gòu)的測(cè)定，得到了電子中介體在微生物/溶液進(jìn)行氧化還原反應(yīng)區(qū)域的厚度約為500 μm，生物膜的厚度為1100 μm；根據(jù)FcMeOH在微電極與微生物之間的正反饋?zhàn)饔?，利用微電極收集到僅來(lái)自于微生物間接電子傳遞過(guò)程的電流?；谠撗芯矿w系，未來(lái)可開(kāi)展其他電子穿梭體與不同微生物之間介導(dǎo)的電子傳遞機(jī)制研究；也可通過(guò)基底表面微生物的有序排列以及探針電極納米化，實(shí)現(xiàn)單層生物膜甚至微生物個(gè)體的空間檢測(cè)。該工作從物理化學(xué)基礎(chǔ)層面增進(jìn)了對(duì)溶液/微生物/電極界面的胞外電子傳遞機(jī)制的理解，也為利用電子穿梭體提高微生物電化學(xué)系統(tǒng)的效率奠定了基礎(chǔ)。

Supporting Information:available free of charge via the internet at http://www.whxb.pku.edu.cn.