李凱，王元林，徐元高，儲(chǔ)鑄鋼，徐述雄，石華

(貴州省人民醫(yī)院 泌尿外科,貴州 貴陽 550002)

膀胱癌是常見的泌尿生殖系統(tǒng)腫瘤，生物學(xué)行為常表現(xiàn)為多發(fā)、侵襲和復(fù)發(fā)等，給治療和預(yù)防工作帶來了巨大的挑戰(zhàn)[1- 2]。目前研究顯示，在膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展的過程中，常伴有細(xì)胞凋亡和增殖過程的異常，其中以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的p53蛋白同源物基因PTEN異常表達(dá)最為突出[3- 4]。作者將膀胱移行細(xì)胞癌患者與良性前列腺增生患者的膀胱組織作對(duì)比，探究了PTEN甲基化及p53異常表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌發(fā)生的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2016年1月至2017年12月收治的71例膀胱移行細(xì)胞癌患者作為觀察組，患者年齡48～68歲，平均(58.35±8.24)歲；單發(fā)性癌灶49例，多發(fā)癌灶22例。臨床分期：非肌層浸潤性48例，肌層浸潤性23例；病理分級(jí)：G1、G2期52例，G3期19例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例。同時(shí)選取正常膀胱組織標(biāo)本(來自良性前列腺增生患者)71例作為對(duì)照組，患者年齡47～69歲，平均(57.27±8.61)歲。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 PTEN甲基化的檢測(cè) 使用德國Qiagen公司QIAamp DNA FFPE組織試劑盒提取觀察組和對(duì)照組膀胱組織的DNA，置于-20 ℃保存。應(yīng)用亞硫酸氫鹽對(duì)甲基化和非甲基化的DNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行修飾，并作為甲基化和非甲基化的對(duì)照。對(duì)兩組患者膀胱組織的DNA進(jìn)行亞硫酸氫鹽修飾并提純，置于-20 ℃保存。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5]，選取外顯子556- 971bp高CpG區(qū)域，即PTEN基因啟動(dòng)子高度甲基化區(qū)域進(jìn)行甲基化狀態(tài)的研究。對(duì)上述經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾處理后的組織進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序的引物設(shè)計(jì)如下：PTEN基因甲基化測(cè)序的PCR正向排序?yàn)椋?′- TATAGATTTGGGGGAAGGGGGAATT- 3′,反向排序?yàn)?′- CCCTTACCTCTACCCCTAAATTTC- 3′，引物加生物素修飾。按照試劑盒說明書進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系：H2O 34.8 μl、5倍緩沖液GC 10 μl、上下游引物各1 μl、全基因組DNA樣本2 μl、Taq酶0.2 μl，共48 μl。循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，最適溫度下退火30 s，72 ℃延伸10 min，總計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃的條件下延伸10 min。再將產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸法測(cè)序：在96孔PCR反應(yīng)板中加入反應(yīng)結(jié)合珠2 μl、結(jié)合緩沖液38 μl以及PCR產(chǎn)物40 μl，室溫混勻。將結(jié)合珠和PCR產(chǎn)物應(yīng)用真空泵吸出，并依次浸入70%乙醇溶液、0.2 mol·L-1氫氧化鈉溶液和沖洗液中，每次5 s。停用真空泵后取下結(jié)合珠與PCR產(chǎn)物，并一同置入40 μl退火緩沖液中，在85 ℃下變性處理2 min，然后將其冷卻至室溫進(jìn)行雜交。在儀器中加入底物混合物、反應(yīng)所需酶以及脫氧核苷酸；將試劑艙和96孔反應(yīng)板放入焦磷酸測(cè)序檢測(cè)儀中檢測(cè)，并應(yīng)用Pyro Q- CpG軟件對(duì)甲基化位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。本次實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)甲基化率的位點(diǎn)為連續(xù)的胸腺嘌呤和胞嘧啶片段，而片段中共有4個(gè)胸腺嘌呤和胞嘧啶連續(xù)片段，因此，樣本中4個(gè)胸腺嘌呤和胞嘧啶位點(diǎn)的甲基化率總和即為樣本中PTEN基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率。

1.2.2 p53蛋白表達(dá)的檢測(cè) 將樣本5 μm厚切片，行HE染色和免疫組化染色。免疫組化法應(yīng)用p53鼠抗人單克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)公司提供)。操作步驟參照試劑盒說明書。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

p53蛋白染色陽性為黃色或棕黃色染色。在400倍的顯微鏡下觀察3個(gè)高倍視野，每個(gè)視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，并計(jì)數(shù)平均陽性細(xì)胞數(shù)及比率。陽性細(xì)胞比率<10%為陰性，10%～25%為弱陽性，26%～50%為陽性，≥51%為強(qiáng)陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組PTEN基因甲基化的情況

PTEN基因甲基化率觀察組為(21.73±7.92)%，顯著高于對(duì)照組的(7.54±2.35)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 膀胱癌組織PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率與臨床病理學(xué)的關(guān)系

見表1。

表1膀胱癌組織PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率與臨床病理學(xué)的關(guān)系

臨床病理資料nPTEN基因甲基化率/%t值P值年齡 ≥50歲4920.83±6.580.497>0.05 <50歲2221.06±7.02腫瘤長徑 ≤5 cm6019.96±8.331.687>0.05 >5 cm1121.87±8.581.687>0.05組織學(xué)分級(jí) 0、Ⅰ級(jí)4817.62±5.723.112<0.05 Ⅱ、Ⅲ級(jí)2322.88±4.97淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性4115.74±5.337.064<0.05 陽性3124.35±5.61

表1顯示，組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ、Ⅲ級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性的患者，組織PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于組織學(xué)為0、1級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性的患者，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而年齡、腫瘤長徑與PTEN基因啟動(dòng)子甲基化率無關(guān)。

2.3 兩組患者膀胱組織中p53蛋白表達(dá)水平比較

見表2。

表2兩組患者膀胱組織中p53蛋白水平比較

組 別np53蛋白表達(dá)情況弱陽性陽性強(qiáng)陽性陰性p53表達(dá)陽性率/%對(duì)照組714316311.27觀察組712128101283.10χ2值73.501P值<0.05

表2顯示，p53蛋白表達(dá)陽性率觀察組顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 膀胱癌組織p53蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)關(guān)系

見表3。

表3膀胱癌組織p53蛋白表達(dá)與臨床病理學(xué)關(guān)系

臨床病理資料np53蛋白陽性/例t值P值年齡 ≥50歲4945(91.84%)8.597<0.05 <50歲2214(63.64%)腫瘤長徑 ≤5 cm4332(74.42%)5.849<0.05 >5 cm2827(96.43%)組織學(xué)分級(jí) 0、Ⅰ級(jí)3828(73.68%)5.159<0.05 Ⅱ、Ⅲ級(jí)3331(93.94%)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 陰性4030(75.00%)4.278<0.05 陽性3129(93.55%)

表3顯示，年齡、腫瘤長徑及組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均與p53蛋白表達(dá)有關(guān)。

3 討 論

膀胱癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其發(fā)病率居我國泌尿系統(tǒng)腫瘤的首位，在全球范圍內(nèi)占成年惡性腫瘤的8%，其中膀胱移行細(xì)胞癌是最常見的病理類型(占90%)[6- 7]。膀胱癌的發(fā)病機(jī)制目前仍不明確，目前學(xué)術(shù)界的主要觀點(diǎn)是膀胱癌患者存在原癌基因與抑癌基因尤其是抑癌基因的異常表達(dá)。焦磷酸測(cè)序方法可以從分子水平上對(duì)于DNA序列和甲基化水平進(jìn)行分析。該方法不但所需樣本少，而且具有較好的檢測(cè)精度。PTEN是10q23染色體上的磷酸酶基因，與張力蛋白同源[8]。PTEN基因的異常表達(dá)可導(dǎo)致Cowden綜合征、宮頸癌等一系列腫瘤的產(chǎn)生。PTEN基因啟動(dòng)子出現(xiàn)甲基化，激活了PIP3通路，使得細(xì)胞的凋亡過程受抑，或進(jìn)入分裂周期進(jìn)程，造成細(xì)胞分裂增殖的失控，引發(fā)癌癥。對(duì)于PTEN在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，目前學(xué)術(shù)界并無統(tǒng)一結(jié)論。本研究發(fā)現(xiàn)，膀胱癌組織中的PTEN基因甲基化率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，提示PTEN基因甲基化與膀胱癌的發(fā)生密切相關(guān)；組織學(xué)分級(jí)較高、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移為陽性的患者，PTEN基因的甲基化率也明顯升高，說明其與膀胱癌的發(fā)展有關(guān)。

與PTEN基因相似，p53蛋白也是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)。p53蛋白被認(rèn)為是一個(gè)具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子。p53基因轉(zhuǎn)錄形成2.5 kb的mRNA并最終翻譯為393個(gè)氨基酸的p53蛋白，是目前被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展最為密切的蛋白。最初認(rèn)為p53基因是一種癌基因，后研究發(fā)現(xiàn)p53基因有兩種——野生型和突變型的p53，前者可以抑制過度的細(xì)胞增殖從而抑制癌癥，而后者則無這一作用，此時(shí)細(xì)胞的增殖不受抑制，大大提高了癌癥發(fā)生的可能性[9]。本研究所檢測(cè)的是半衰期較長的突變型p53，而其在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)顯著高于正常的膀胱組織(P<0.05)。提示p53基因的異常表達(dá)在膀胱移行細(xì)胞癌的發(fā)生、進(jìn)展及轉(zhuǎn)移中均有重要作用，給膀胱移行細(xì)胞癌的診斷與治療提供了新思路，使靶向治療成為可能[10]。

綜上所述，PTEN基因的甲基化和p53蛋白的表達(dá)在膀胱移行細(xì)胞癌患者中均呈明顯的上升趨勢(shì)，關(guān)于兩者之間是否存在某種相關(guān)性仍需進(jìn)一步探究。深入探討膀胱癌可能發(fā)生的分子結(jié)構(gòu)異常，對(duì)于闡明膀胱癌的發(fā)生機(jī)制及藥物可能的作用機(jī)理意義深遠(yuǎn)。