胡穎，李洪軍，賀稚非*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715) 2(重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

食用單核細(xì)胞增生李斯特菌、沙門菌、彎曲桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等致病菌污染的食物，會引起食源性疾病甚至死亡，造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，這對食品工業(yè)和醫(yī)療行業(yè)是全球性的挑戰(zhàn)。我國衛(wèi)計委網(wǎng)絡(luò)直報系統(tǒng)在2009-2013年共收到食源性疾病暴發(fā)事件1224起，累計中毒人數(shù)38 958人，死亡人數(shù)749人，其中微生物和生物毒素引發(fā)的食源性疾病暴發(fā)事件數(shù)、患者和死亡人數(shù)分別占到72%、76%和66%，說明病原微生物防控依然是我國食品安全的剛性需求[1]。而在美國，每年約有940萬人因食用包括致病菌污染在內(nèi)的食物而患病，其中單純與食源性疾病爆發(fā)有關(guān)的疾病約46%是因未使用抗菌劑的即食產(chǎn)品[2]?？梢?，抗菌劑的使用對食源性疾病的防控起著重要作用。然而，細(xì)菌耐藥性問題日趨嚴(yán)峻，耐藥菌會導(dǎo)致嚴(yán)重疾病甚至死亡。每年僅在美國感染耐藥菌的200萬人中就有2.3萬人死亡，而因食源性病原菌引發(fā)的食品安全問題也日趨嚴(yán)重[3]。傳統(tǒng)抗菌劑對食源性耐藥病原菌的控制也逐漸顯現(xiàn)出不足，對抗細(xì)菌耐藥的新型抗菌劑的研發(fā)成為當(dāng)前的研究熱點之一。

早在20世紀(jì)初，噬菌體就作為天然抗菌劑被廣泛使用。如今，因其特異性裂解細(xì)菌且不易引起細(xì)菌抗性的特點受到廣大研究者的青睞。在食品工業(yè)中，噬菌體也越來越多被用于食源性致病菌的防控[4]。

目前，國內(nèi)對噬菌體在食品工業(yè)中應(yīng)用的概述多集中于噬菌體在檢測技術(shù)中的作用，而噬菌體在具體食品中對致病菌作用的分析總結(jié)相對比較缺乏。因此，本文對噬菌體在肉及肉制品、乳制品、果蔬制品中的應(yīng)用進(jìn)行概述，以期為噬菌體作為食品抗菌劑研究提供一定的參考。

1 噬菌體概述

噬菌體(bacteriophage, phage)由法籍加拿大微生物學(xué)家D′HERELLE根據(jù)其發(fā)現(xiàn)于1917年在會議上正式提出[5]。而追溯對噬菌體的相關(guān)報道最早應(yīng)該在1915年，TWORT觀察到葡萄球菌培養(yǎng)物的濾液可將其他葡萄球菌菌株裂解并形成清晰的噬菌斑，并將這一現(xiàn)象進(jìn)行報道[5]。

1.1 生物學(xué)特性

噬菌體是最大的病毒群體，可存在于多種生態(tài)環(huán)境中，種類繁多，數(shù)量巨大，約達(dá)到1031種，并且能利用細(xì)菌和古細(xì)菌作為宿主進(jìn)行繁殖，其大小通常在20～200 nm之間[6]。噬菌體多為有尾結(jié)構(gòu)，按尾部形狀，可將其分為多面體(二十面體或準(zhǔn)二十面體)、絲狀體、多形性噬菌體[7]。噬菌體的尾絲含有能識別宿主細(xì)胞壁表面分子的蛋白，這使得噬菌體能專一吸附于宿主細(xì)胞。大多數(shù)噬菌體較為穩(wěn)定，能在pH值5～9環(huán)境下存活，60 ℃加熱30 min才能使其失活。噬菌體的生長繁殖分為吸附、侵入、增殖、裝配和裂解5個階段。根據(jù)其生命周期可分為裂解性噬菌體和溶源性噬菌體兩類[8]。裂解性噬菌體往往能造成細(xì)菌的直接死亡。在其生長繁殖過程中，裂解性噬菌體將自身的基因注入到宿主體內(nèi)，再復(fù)制裝配成子代噬菌體顆粒使宿主細(xì)胞壁發(fā)生裂解，并最終釋放出多個噬菌體顆粒，釋放的顆粒數(shù)取決于噬菌體的類型，整個裂解周期通常在1～2 h即可完成。而溶源性噬菌體則不會使宿主細(xì)胞裂解死亡，而是通過改變宿主表型而增強(qiáng)宿主的致病力，它們通常整合自身的遺傳物質(zhì)到宿主的核染色體，長期伴隨宿主基因組DNA同步復(fù)制[9]。

1.2 抑菌機(jī)理

1.2.1 作用宿主細(xì)胞

噬菌體對病原菌的殺菌機(jī)制主要是通過裂解宿主細(xì)胞完成的。裂解過程中主要依賴裂解酶和早期蛋白。相較活性噬菌體，噬菌體裂解酶更易于定向操作，具有更寬的裂解譜，不增殖且?guī)缀醪划a(chǎn)生細(xì)菌抗性。內(nèi)溶素是目前研究報道最多的噬菌體裂解酶，通常在噬菌體裂解后期釋放，其本質(zhì)是蛋白酶，在噬菌體發(fā)揮裂解過程中起關(guān)鍵作用，可特異性作用于細(xì)菌細(xì)胞壁[10]。

與裂解酶不同，早期蛋白則是通過抑制宿主細(xì)胞的正常分裂而達(dá)到殺菌抑菌的目的。早期蛋白在噬菌體利用宿主資源的過程中起到關(guān)鍵作用，可以抑制宿主DNA的復(fù)制，干擾宿主菌的轉(zhuǎn)錄過程[11-12]。

1.2.2 作用宿主菌膜

生物被膜、生物膜或生物菌膜(biofilm，BF)是由食源性致病菌在食品及加工器械表面黏附生長，并在菌體或者菌體與接觸面的相互作用下，通過菌體增殖、分泌胞外基質(zhì)而形成的具有一定空間結(jié)構(gòu)的細(xì)菌聚集體。其形成是一個動態(tài)過程，包括細(xì)菌起始黏附、擴(kuò)張、分化和成熟擴(kuò)散等階段。生物膜細(xì)菌對抗生素和宿主免疫防御機(jī)制的抗性很強(qiáng)，食源性致病菌BF已經(jīng)造成多起食源性食物中毒事件[13]?；贐F的危害性，對其進(jìn)行破除已成為致病菌防控的重要手段。而噬菌體及其編碼的酶類在破解BF的過程中體現(xiàn)出極強(qiáng)的效果。

噬菌體對細(xì)菌BF的破除主要依賴3條途徑，分別是誘導(dǎo)[14]、裂解[15]和抑制[16]，如表1所示。

表1 噬菌體裂解BF機(jī)制

1.3 噬菌體安全性

與傳統(tǒng)抗菌藥物如抗生素相比，噬菌體具有足夠安全的使用歷史，研究聲稱由于噬菌體是細(xì)菌病毒，不可能感染哺乳動物細(xì)胞。綜合目前對于噬菌體使用的研究報道，表2從噬菌體來源、作用對象、作用方式、作用劑量、免疫反應(yīng)等方面簡單總結(jié)噬菌體的安全性。

表2 噬菌體安全評價

然而，由于噬菌體病毒的本質(zhì)，其某些結(jié)構(gòu)組分可能是病原性的，加之編碼的一些調(diào)控因子能夠促使宿主毒力因子的表達(dá)，將其用作抗菌劑保障食品安全的安全性始終遭受部分學(xué)者質(zhì)疑[32]。某些研究結(jié)果暗示噬菌體存在著一定的潛在安全隱患。O’FLYNN等[33]在利用噬菌體混合物清除大腸埃希菌的實驗中，出現(xiàn)對噬菌體不敏感突變體。這些突變株與親代菌株具有相近的生長速率，但在形態(tài)學(xué)則更傾向于球菌體，盡管這些突變株的發(fā)生頻率非常低，且不會阻礙噬菌體作為生物防治劑的使用，但是突變體的出現(xiàn)讓噬菌體使用的安全性受到一定的質(zhì)疑。此外，SANTANDER等[34]發(fā)現(xiàn)在利用噬菌體作用腸炎沙門菌的過程中，出現(xiàn)缺失噬菌體吸附所需O-多糖層而對噬菌體不敏感的突變株，但這種突變同時也使腸炎沙門菌的毒力喪失。因此，作者提出可通過選擇具有低轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率的噬菌體來預(yù)防致病菌毒力的轉(zhuǎn)導(dǎo)。

就目前研究報道結(jié)果，噬菌體的使用絕大多數(shù)是安全的，而耐受噬菌體突變體的出現(xiàn)卻又有發(fā)生。因此，作為在食品使用的噬菌體，由于最終面向消費者，更應(yīng)具有能夠保障其安全性的一些特性。如極強(qiáng)的溶解性、能作用于所有重要的流行病學(xué)目標(biāo)微生物菌株、具有盡可能低的轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率而防止抗性基因的轉(zhuǎn)移、對于抗菌譜較窄的噬菌體則能夠通過噬菌體混合液達(dá)到改善[35]。

2 噬菌體在食品工業(yè)中對食源性致病菌的作用

由于噬菌體來源廣泛，具有安全的使用歷史，已被嘗試用于食品工業(yè)多個領(lǐng)域中食源性致病菌的防控。

2.1 肉及肉制品中的應(yīng)用

O’FLYNN等[33]將e11/2, e4/1c，pp01噬菌體混合液應(yīng)用于肉類表面， 77%的樣本中大腸桿菌O157∶H7被徹底根除。HUDSON等[36]描述了噬菌體AHEc1的分離及特性，并將其用于感染大腸桿菌O157∶H7的牛肉片上，模擬熱去骨和常規(guī)尸體冷卻模式下的作用效果，并對噬菌體作用條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明噬菌體以3.2×107PFU/4 cm2的濃度作用牛肉片對大腸桿菌O157：H7清除效果最好。ZHANG等[37]用不同種類的志賀菌污染即食五香雞肉，再以1×108PFU/g單一噬菌體和3×108PFU/g噬菌體混合液進(jìn)行噴涂處理，處理后實驗樣品置于37 ℃培養(yǎng)72 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是單一噬菌體還是噬菌體混合液均能一定程度的降低樣品中志賀菌的數(shù)量，其中噬菌體混合液能在72 h內(nèi)將樣品中污染的志賀菌完全清除，其清除效果優(yōu)于單一噬菌體。

除單獨利用噬菌體對致病菌進(jìn)行防控外，還有研究者將噬菌體與山梨酸鉀、乳酸鈉等傳統(tǒng)抗菌劑進(jìn)行效果對比研究。WANG等[38]在沙門菌感染的冷鮮豬肉上應(yīng)用噬菌體，并將其與傳統(tǒng)抗菌劑山梨酸鉀和乳鏈球菌素進(jìn)行效果對比研究。結(jié)果表明，噬菌體與乳鏈球菌素以及山梨酸鉀復(fù)配使用能取得最好效果。FIGUEIREDO ACL等[39]用單核細(xì)胞增生李斯特菌的混合物接種即食豬肉火腿片，再將噬菌體P100，乳酸鏈球菌肽和乳酸鈉單獨或聯(lián)合施用于即食豬肉火腿片的表面，從而考察對單核細(xì)胞增生李斯特菌的抑制效力。研究結(jié)果表明，單獨處理中噬菌體P100是最有效的，乳酸鈉效果最差。

2.2 乳及乳制品中的應(yīng)用

噬菌體作為致病菌的抗菌劑，在乳及乳制品中也有不少應(yīng)用研究。TOMAT等[40]從糞便中分離出2種噬菌體，并將它們在牛奶發(fā)酵過程中作為致病性大腸桿菌的生物防治劑。結(jié)果顯示所選噬菌體DT1和DT6單獨或混合作用，均能有效降低牛奶發(fā)酵過程中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin- producingEscherichiacoli, STEC)的數(shù)量，并且不會對發(fā)酵劑嗜熱鏈球菌的培養(yǎng)性能產(chǎn)生任何的不利影響。GUENTHER等[41]對具有廣泛抑菌譜的裂性噬菌體FO1-E2在巧克力牛奶中減少鼠傷寒沙門菌的作用效果進(jìn)行了實驗。樣品加入1×103CFU/g鼠傷寒沙門菌后，用3×108PFU/g噬菌體處理，于8 ℃或15 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。牛奶中鼠傷寒沙門菌在8 ℃無存活，在15 ℃降低5 lg CFU / mL，說明裂性噬菌體FO1-E2對污染牛奶的鼠傷寒沙門菌能起到有效防治。

TABLA等[42]在巴氏滅菌的全脂牛奶中，通過25 ℃下培養(yǎng)牛奶48 h進(jìn)行冷鏈斷裂模擬，以期考察噬菌體vB_SauS-phi-IPLA35(phiIPLA35)和vB_SauS-phi-IPLA88(phiIPLA88)及高靜水壓(HHP)對金黃色葡萄球菌Sa9的聯(lián)合作用效果，實驗對金黃色葡萄球菌設(shè)置初染濃度分別為1×104CFU/mL和1×106CFU/mL。結(jié)果顯示在2種初染濃度下，高靜水壓(HHP)和噬菌體之間均有協(xié)同作用，聯(lián)合作用能將初始金黃色葡萄球菌污染降低至檢測限(<10 CFU/mL)以下。在此過程中，噬菌體能使高靜水壓(HHP)的處理條件更溫和，因此噬菌體可認(rèn)為是最低限度加工食品的一種有效設(shè)置。

2.3 蛋及蛋制品中的應(yīng)用

GUENTHER等[41]在蛋黃中對具有廣泛抑菌譜的裂性噬菌體FO1-E2作用鼠傷寒沙門菌的效果進(jìn)行研究，樣品加入1×103CFU/g鼠傷寒沙門菌后用3×108PFU/g噬菌體處理，于8 ℃或15 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。結(jié)果顯示抑菌效果出現(xiàn)在第2天，且作用效果持續(xù)性較差。作者推測噬菌體顆粒容易被蛋黃基質(zhì)固定，從而喪失擴(kuò)散和感染靶細(xì)胞的能力，使最初的殺傷作用得不到補(bǔ)償，以至于在實驗結(jié)束時，出現(xiàn)了抗噬菌體的沙門菌，但實驗結(jié)果依然能證明裂性噬菌體FO1-E2可以作為食品中的沙門菌生物防治的有效措施。

關(guān)于蛋黃基質(zhì)對噬菌體作用致病菌的影響在另一項研究也得到證實。HONG等[43]將1種廣譜沙門菌噬菌體vB_SalS_SJ_2(SJ2,108PFU; MOI=10)用于受沙門菌污染的豬肉和雞蛋液中，以量化食物基質(zhì)中的噬菌體抗性株的發(fā)展。在不同的時間點用單一噬菌體處理能顯著降低豬肉和雞蛋液中腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的污染。在對沙門菌控制過程中作者發(fā)現(xiàn)，噬菌體的抑菌效果與溫度有關(guān)，較高溫度能更有效抑制沙門菌的生長。實驗還對噬菌體抗性株進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示室溫下培養(yǎng)48 h后，噬菌體抗性株在雞蛋液中顯著升高，而豬肉樣品中無顯著變化。說明食物基質(zhì)可能會影響噬菌體抗性菌株的出現(xiàn)，且噬菌體抗性菌株在不復(fù)雜的食物中發(fā)展地更快。

2.4 水產(chǎn)品中的應(yīng)用

在魚、海鮮等水產(chǎn)品中，噬菌體對致病菌也有很好的防控效果。GUENTHER等[41]對具有廣泛抑菌譜的裂性噬菌體FO1-E2在海鮮中減少鼠傷寒沙門菌的作用效果進(jìn)行研究，鼠傷寒沙門菌以1×103CFU/g濃度污染樣品，噬菌體以3×108PFU/g濃度進(jìn)行處理后，8 ℃和15 ℃恒溫培養(yǎng)6 d。結(jié)果顯示噬菌體FO1-E2在8 ℃條件下能使沙門菌全部死亡。15 ℃時，沙門氏菌降低3 log CFU/g。GALARCE等[44]將腸炎沙門菌接種于混合海鮮組織中，再用噬菌體混合液處理，分別在4 ℃和18 ℃培養(yǎng)10 d。研究結(jié)果表明，噬菌體能將混合海鮮組織中的腸炎沙門菌顯著降低1.9個對數(shù)單位。AHMADI等[45]研究了裂性噬菌體(VP)和高靜水壓力(HHP)對鮭魚、貽貝中霍亂弧菌的滅活效果。結(jié)果顯示，樣品在條件為550 MPa或350 MPa HHP作用5 min后添加噬菌體處理，能使霍亂弧菌完全失活。因此，HHP和VP的聯(lián)合使用，可作為海鮮加工中防控致病菌的有效柵欄技術(shù)。

2.5 果蔬類制品中的應(yīng)用

鮮切農(nóng)產(chǎn)品行業(yè)在過去的10年中一直是食品零售市場增長最快的部分，能為消費者提供便利和營養(yǎng)。然而，由于鮮切果蔬切割表面營養(yǎng)物質(zhì)的暴露，相較完整產(chǎn)品更容易被病原菌侵染而引起食品安全問題。LEVERENTZ等[46]發(fā)現(xiàn)接種單核細(xì)胞增生李斯特菌并在10 ℃貯存7 d后，鮮切蘋果中單核細(xì)胞增生李斯特菌的含量僅略有增加，而在鮮切蜜瓜中卻顯著增加。此外，他們通過噴灑和注射2種方法對人工污染單核細(xì)胞增生李斯特菌的蜜瓜和蘋果施用噬菌體，并對噬菌體特異性裂解單核細(xì)胞增生李斯特菌的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示，與對照組相比，噬菌體與乳酸鏈球菌肽聯(lián)合使用，可使單核細(xì)胞增生李斯特菌在蜜瓜切片和蘋果切片分別減少5.7 lg CFU/g和2.3 lg CFU/g，且噬菌體抑菌作用與單增李斯特菌的初始濃度有關(guān)。

PERERA等[47]將2×103CUF/g濃度的單核細(xì)胞增生李斯特菌菌液以10 mL/kg的量作用于生菜表面作為測試組，相同劑量的無菌水處理對照組，室溫下定殖60 min后，測試組給予1×107PFU/g濃度的噬菌體制劑ListShieldTM處理。處理后每組均取樣25 g至225 mL蛋白胨水均質(zhì)，并涂布于單核細(xì)胞增生李斯特菌選擇培養(yǎng)基于(35±2) ℃溫育(24±2) h，以測定單核細(xì)胞增生李斯特菌的濃度。而鮮切蘋果片則被1×104CFU/g濃度的單增李斯特菌以1.0 mL/kg的比例處理，相同劑量無菌水處理作為對照組，允許菌液在蘋果片表面定殖10 min。然后測試組分別用抗氧化劑AS，1.1×106PFU/g噬菌體制劑ListShieldTM或AS與1.1×106PFU/g噬菌體制劑ListShieldTM聯(lián)合處理。處理后所有蘋果片樣品均置于4 ℃儲存，并分別于24、48、72 h取樣進(jìn)行單核細(xì)胞增生李斯特菌濃度的測試。結(jié)果表明,噬菌體制劑ListShieldTM處理后，生菜中單核細(xì)胞增生李斯特菌顯著減少91%(1.1 lg)(P<0.05)；而單獨使用噬菌體制劑ListShieldTM或與抗氧化劑AS聯(lián)合使用，4 ℃ 24 h后蘋果片上單核細(xì)胞增生李斯特菌的污染顯著性減少93%(1.1 lg)(P<0.001)。且樣品的顏色，味道等感官品質(zhì)不受任何影響。因此，噬菌體制劑ListShieldTM可用于降低食物受單核細(xì)胞增生李斯特菌污染的風(fēng)險。

3 展望

噬菌體是自然存在于周圍環(huán)境的細(xì)菌天敵。目前，將其在獸醫(yī)、臨床、食品等領(lǐng)域作為傳統(tǒng)抗生素和抗菌劑替代物的研究都展開了相關(guān)工作。

綜合研究結(jié)果，單就食品領(lǐng)域致病菌的防控，未來還需要深入探索,比如，雖然噬菌體在食物中永遠(yuǎn)存在，然而消費者對食物添加病毒的看法依然會成為噬菌體廣泛用于食品中致病菌生物控制中需要克服的最關(guān)鍵障礙；在食品中對噬菌體功效的研究幾乎都是將致病菌進(jìn)行人工接種，因此這些實驗不一定能全面反映真實情況；此外，還應(yīng)注意致病菌防控過程中抗性菌株的出現(xiàn)，以及食品基質(zhì)對噬菌體作用效果的影響。