張忠華，劉素平，譚紫仙，楊 琨

（西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 榆中 730124）

牦牛是青藏高原地區(qū)標(biāo)志性的土著動(dòng)物之一，是已經(jīng)在形態(tài)和生理上適應(yīng)了青藏高原高寒、低氧環(huán)境的牛種，也是青藏高原地區(qū)各種生活資源的主要來(lái)源之一。

低氧誘導(dǎo)因子家族（HIFs）是一類重要的適應(yīng)性低氧反應(yīng)的調(diào)控因子[1]。低氧誘導(dǎo)因子2α（hypoxia inducible factor-2α，HIF-2α）是低氧誘導(dǎo)因子家族的異構(gòu)體之一，是肺血管對(duì)急性和慢性低氧做出反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，具有調(diào)控血管再生的功能，包括細(xì)胞增殖、血細(xì)胞成熟、血管生成、肺血管發(fā)育和胚胎發(fā)育等[2，3]。在高寒和低氧條件下，適量的增加低氧誘導(dǎo)因子2α在牦牛肺臟器官的含量能夠提高細(xì)胞對(duì)低氧的適應(yīng)力，使ATP產(chǎn)能增加、減少氧化物產(chǎn)量[4]。

該研究以1歲牦牛的肺臟為試驗(yàn)材料，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色和HE染色的方法檢測(cè)HIF-2α蛋白在牦牛肺臟中的表達(dá)分布并為牦牛的低氧研究提供形態(tài)學(xué)資料，為HIF-2α在高原動(dòng)物適應(yīng)高寒低氧環(huán)境生化機(jī)制的研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為1歲健康牦牛的肺臟組織，在牦牛被放血后立即收集,并用4%多聚甲醛溶液立即固定采集的組織。材料于2018年5月份在西寧屠宰場(chǎng)獲取。

1.2 材料處理

取大約1 cm3的肺臟組織制成石蠟切片（厚4～5 μm），用于HE染色和免疫組織化學(xué)染色試驗(yàn)。

1.3 試驗(yàn)試劑

主要的試驗(yàn)試劑包括HIF-2α兔多克隆抗體（bs-1447R）、SP試劑盒(兔)（SP-0023）和DAB染色試劑盒（C02-04001，均購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組化檢測(cè)

采用HIF-2α兔多克隆抗體作為HIF-2α抗體，按1∶100的比例稀釋，加入一抗(HIF-2α兔多克隆抗體)的組織在37℃環(huán)境下孵育2～3 h。試驗(yàn)操作步驟根據(jù)SP試劑盒和DAB染色試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。陰性對(duì)照試驗(yàn)不加HIF-2α兔多克隆抗體。

1.5 結(jié)果判定

免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)、中性陽(yáng)性表達(dá)、弱陽(yáng)性表達(dá)和陰性表達(dá)。顯色結(jié)果為深棕黃色是強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)、棕黃色比背景色深是弱陽(yáng)性表達(dá)、位于強(qiáng)陽(yáng)性和弱陽(yáng)性之間為中性陽(yáng)性表達(dá)、陰性表達(dá)為棕黃色。

2 結(jié)果

2.1 牦牛肺臟的組織學(xué)結(jié)構(gòu)

牦牛肺臟HE染色及HIF-2α蛋白免疫組化染色如圖1所示。通過(guò)對(duì)HE染色的肺臟組織切片進(jìn)行組織學(xué)觀察，1歲健康牦牛肺臟的肺泡壁較薄，由Ⅰ型上皮細(xì)胞襯覆。牦牛肺臟具有豐富的肺泡，近似為多面形或半球形的囊泡結(jié)構(gòu)，并且開(kāi)口于肺泡囊和呼吸性細(xì)支氣管等，肺泡間有大量的毛細(xì)血管網(wǎng)，如圖A所示。

圖1 牦牛肺臟HE染色及HIF-2α蛋白免疫組化染色

2.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)VEGF蛋白表達(dá)

在1歲牦牛肺臟組織中，免疫組化染色結(jié)果顯示HIF-2α蛋白在血管外膜、肺泡導(dǎo)管、終末支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在肺泡I型細(xì)胞、肺泡II型細(xì)胞、呼吸性細(xì)支氣管上皮細(xì)胞、肺血管和肌細(xì)胞中為陽(yáng)性表達(dá)（詳見(jiàn)圖B）；陰性對(duì)照無(wú)陽(yáng)性反應(yīng)（詳見(jiàn)圖C）。

3 討論

牦牛是高原地區(qū)的典型動(dòng)物，在高寒低氧環(huán)境下生活的牦牛已在形態(tài)和生理上適應(yīng)了高原的嚴(yán)酷條件[4]，牦牛的肺臟在結(jié)構(gòu)方面與生活在低海拔地區(qū)動(dòng)物的肺臟相比具有差異，牦牛肺臟的肺血-空氣屏障比低海拔的動(dòng)物都要薄，這有利于增加氣體交換過(guò)程中的氧擴(kuò)散；當(dāng)生活在低海拔的黃牛暴露在高海拔環(huán)境下時(shí)，很容易發(fā)生嚴(yán)重肺動(dòng)脈高壓和右心衰竭[5]；與奶牛和黃牛的血管外徑與肺微動(dòng)脈中膜的平滑肌厚度的百分比相比，牦牛的百分比更小，這說(shuō)明高原地區(qū)的牦牛肺動(dòng)脈高壓，牦牛更適合在高海拔的環(huán)境下生活[6]。

氧氣是調(diào)節(jié)HIF-2α表達(dá)的關(guān)鍵因素[1]，且HIF-2α是細(xì)胞對(duì)低氧適應(yīng)和肺血管對(duì)急性和慢性低氧做出反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[2]。在正常的氧濃度水平時(shí)HIF-2α的表達(dá)量較低，僅具有維持血管密度平衡的作用，然而在缺氧時(shí)HIF-2α的表達(dá)量顯著升高，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)HIF-2α的缺失能夠?qū)е轮旅暮粑狡染C合征（RDS），這是由于肺泡II型細(xì)胞表面活性劑生產(chǎn)不足所導(dǎo)致的[7]。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-2α在1歲牦牛肺臟中血管外膜、肺泡導(dǎo)管、終末支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞的表達(dá)量很高，表明低氧能夠提高HIF-2α在1歲牦牛肺臟中的表達(dá)水平，進(jìn)而影響牦牛的肺功能，這可能是牦牛能在高寒低氧的環(huán)境下生存的重要影響因素。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過(guò)研究HIF-2α在1歲牦牛肺臟中的表達(dá)分布情況，發(fā)現(xiàn)該蛋白于牦牛肺臟中血管外膜、肺泡導(dǎo)管、終末支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞高表達(dá)，結(jié)合HIF-2α對(duì)肺臟血管有促進(jìn)功能，得出低氧能促進(jìn)HIF-2α在牦牛肺臟中的表達(dá)，進(jìn)而推測(cè)HIF-2α因子對(duì)牦牛適應(yīng)高原低氧環(huán)境有著重要作用。