陳耀麗，俞龍春，錢 悅，宋希強(qiáng)，張 哲,2

(1.海南大學(xué) 林學(xué)院/熱帶特色林木花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，?？?570228；2.海南耀德農(nóng)業(yè)科技有限公司，?？?570228)

植物體是一個(gè)廣泛存在著各種生命物質(zhì)的微生態(tài)系統(tǒng)，微生物是其中的重要組成部分，它們分布于植物體內(nèi)外，種類及數(shù)量極為豐富，包括細(xì)菌、真菌、放線菌等，對(duì)于植物微生態(tài)系統(tǒng)平衡的維持起到重要的作用[1]。植物中的內(nèi)生菌是指其生活史的部分或全部階段均生活在植物內(nèi)部，并與植物建立了和諧共生、互利互惠關(guān)系的菌類，主要包括真菌和細(xì)菌，它們不僅可以促進(jìn)植物的健康生長(zhǎng)，還可控制植物病害的發(fā)生和發(fā)展，是重要的微生物資源[2]。內(nèi)生真菌是蘭科植物生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)階段不可或缺的關(guān)鍵因素[3]，能夠直接參與植物根系甚至整株植物的生理代謝活動(dòng)，保障植物的生長(zhǎng)、個(gè)體間的競(jìng)爭(zhēng)以及病原體的防護(hù)，而相應(yīng)地植物也會(huì)為真菌提供光合作用的產(chǎn)物[4-5]。內(nèi)生細(xì)菌也是蘭科植物內(nèi)生微生物的重要組成部分，研究表明內(nèi)生細(xì)菌能夠直接促進(jìn)植物種子萌發(fā)、光合形態(tài)建成及生長(zhǎng)發(fā)育[6-7]；此外，有些內(nèi)生細(xì)菌是促生細(xì)菌(Mycorrhiza helper bacteria)，能與菌根真菌特異性結(jié)合，刺激菌根真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)，能夠促進(jìn)菌根真菌在宿主植物根部的定殖和生長(zhǎng)，加強(qiáng)菌根化，從而間接促進(jìn)植物生長(zhǎng)及增強(qiáng)抗逆性[8-9]；有些內(nèi)生細(xì)菌還能釋放出拮抗物質(zhì)，可以阻止或減緩病原微生物的入侵，降低病蟲(chóng)害的風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。大尖囊蝴蝶蘭(Phalaenopsisdeliciosa)為多年生附生草本蘭科植物，廣泛分布于我國(guó)及東南亞的熱帶地區(qū)。筆者以大尖囊蝴蝶蘭新鮮營(yíng)養(yǎng)根為實(shí)驗(yàn)材料，對(duì)其內(nèi)生真菌和細(xì)菌進(jìn)行分離與純化，并通過(guò)形態(tài)篩選和分子鑒定，旨在分析大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌和細(xì)菌的組成及多樣性，并探討這些內(nèi)生真菌和細(xì)菌的開(kāi)發(fā)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料大尖囊蝴蝶蘭根部材料于2015年7月采自海南昌江霸王嶺國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，隨機(jī)選擇15個(gè)健康植株，每株剪取2個(gè)長(zhǎng)約2 cm的根段，共采集30個(gè)根段。裝入PE管密封，帶回實(shí)驗(yàn)室后24 h內(nèi)進(jìn)行內(nèi)生真菌和細(xì)菌的分離。

1.2 內(nèi)生真菌和細(xì)菌的分離與純化內(nèi)生真菌方面：用自來(lái)水清洗干凈供試根段表面的污垢及附著物，無(wú)菌水沖洗30 s。75%乙醇分別消毒15，30，45和60 s，2%次氯酸鈉分別消毒30，60，90和180 s，之后用無(wú)菌水沖洗4次。消毒后的根段均勻切成0.3～0.5 cm的小段，接種于配制好的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)。將得到的菌株繼續(xù)使用PDA培養(yǎng)基純化3次，并于28 ℃黑暗培養(yǎng)。將最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布于PDA培養(yǎng)基中，做空白對(duì)照，用于檢測(cè)消毒是否徹底。采用斜面低溫保存法保存菌株，將純菌株接種至PDA斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出，觀察無(wú)污染后，置于4 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)分子鑒定。

內(nèi)生細(xì)菌方面：用自來(lái)水清洗干凈供試根段表面的污垢及附著物，無(wú)菌水沖洗30 s并置于濾紙上晾干。將供試根段切成小段并稱取0.1 g，用75%乙醇分別消毒15，30，45和60 s，然后置于2%的次氯酸鈉消毒30，60，90和180 s，最后用無(wú)菌水沖洗4遍。將根段置于研缽中，加0.9 mL無(wú)菌水和適量石英砂，充分研磨后，用移液槍吸取勻漿液，經(jīng)梯度10-1，10-2，10-3，10-4和10-5g·L-1稀釋，取各濃度的漿液各50 μL，滴入配制好的NA培養(yǎng)基，每個(gè)處理重復(fù)3次。用滅菌后的涂抹棒將NA培養(yǎng)基上的漿液涂抹均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。待有菌長(zhǎng)出，根據(jù)菌落形態(tài)均勻、顏色、大小、透明度、邊緣整齊度以及菌苔的干濕程度等情況挑取具有代表性的菌落使用NA培養(yǎng)基連續(xù)純化3次。將最后一次沖洗的無(wú)菌水涂布于NA培養(yǎng)基中，做空白對(duì)照，用于檢測(cè)消毒是否徹底。本實(shí)驗(yàn)中，10-1g·L-1濃度下細(xì)菌菌體相互覆蓋重疊，不利于挑選細(xì)菌；10-5g·L-1濃度下細(xì)菌數(shù)量較少，因此，選擇(10-2～10-4) g·L-1濃度的菌液進(jìn)行保存處理。采用斜面低溫保存法保存菌株，將純菌株接種至NA斜面培養(yǎng)基上，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)，待菌落長(zhǎng)出，觀察無(wú)污染后，放于4 ℃的冰箱中保存，用于后續(xù)分子鑒定。

1.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增真菌DNA提?。簠⒖糋UO等[12]的改良CTAB法。細(xì)菌DNA提?。簩⒓兓募?xì)菌接種到NA液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)(180 r·min-1) 1 d，之后使用細(xì)菌試劑盒(DP302-02, 北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行基因組DNA提取。

真菌擴(kuò)增采用的引物為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)。采用20 μL 的PCR反應(yīng)體系，包含6 μL ddH2O，各1 μL引物，1 μLTaq酶，1 μL DNA模板和10 μL 2×PCRmix；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，之后35個(gè)循環(huán)(包括94 ℃變性30 s, 55 ℃復(fù)性45 s, 72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。

細(xì)菌采用16S rDNA通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')。采用50 μL PCR反應(yīng)體系，包含19 μL ddH2O，各2 μL引物，2 μLTaq酶，2 μL DNA模板和25 μL 2×PCRmix；反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，之后35個(gè)循環(huán)(包括94 ℃變性1 min; 55 ℃復(fù)性1 min; 72 ℃延伸1.5 min)，最后72 ℃延伸10 min。

1.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè)及測(cè)序PCR產(chǎn)物檢測(cè)采用1.6%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測(cè)，選取條帶清晰的PCR產(chǎn)物，委托北京諾賽基因組研究中心有限公司Sanger測(cè)序?qū)嶒?yàn)室測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析將測(cè)序得到的ITS或16s rDNA序列匯總成本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)，用QIIME 1.8.0完成序列的預(yù)處理和可操作分類單元(Operational taxonomic units, OTUs)的劃分及代表序列挑選[13-14]。將OTU代表序列在GenBank中進(jìn)行在線BLAST(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)比對(duì)，分別將相似性大于99%，介于95%和99%的序列列為參考種和參考屬[15]。采用鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建內(nèi)生真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[16-17]?？瘴槐痪幋a為丟失數(shù)據(jù)，Bootstraps值設(shè)為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌和細(xì)菌的分離與純化最佳表面消毒時(shí)間：以對(duì)照組是否殘余菌落的最低消毒時(shí)間為原則，真菌方面使用75%乙醇消毒30 s，之后用2%次氯酸鈉消毒90 s為最佳消毒組合(表1)。細(xì)菌方面以75%乙醇消毒30 s，2%次氯酸鈉浸泡30 s為最佳消毒組合。菌株數(shù)量：通過(guò)分離純化培養(yǎng)，共獲得代表性內(nèi)生真菌菌株38株，內(nèi)生細(xì)菌菌株54株。

2.2 內(nèi)生真菌的分子鑒定38株代表性內(nèi)生真菌菌株經(jīng)分子鑒定可劃分為5個(gè)OTUs (Pd-fun1～Pd-fun5) (表1)，隸屬于1門2綱4目4科5屬，包括球二孢屬(Lasiodiplodia)、曲霉屬(Aspergillus)、鐮刀菌屬(Fusarium)、假赤殼屬(Pseudocosmospora)和多絲菌屬(Setophoma)。其中優(yōu)勢(shì)屬為球二孢屬，占總菌株數(shù)的33.33%；次優(yōu)勢(shì)屬為曲霉屬，占26.68% (表1)。代表性內(nèi)生真菌菌株形態(tài)(圖1)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖2)。

表1 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌代表性菌株序列的相似性比較

Tab.1 rDNA-ITS sequence similarity between representative strains and reference taxa of the endophytic fungi inPhalaenopsisdeliciosa

操作單元OTU科Family屬Genus參考物種Close relative登錄號(hào)Accession No.同源性/%Identity相對(duì)分離比例/%Relative isolation proportion Pd-fun1AspergillaceaeAspergillusAspergillus nigerKT726919.19926.68Pd-fun2BotryosphaeriaceaeLasiodiplodiaLasiodiplodia pseudotheobromae KT728915.110033.33Pd-fun3NectriaceaeFusariumFusarium keratoplasticumKT716207.1996.68Pd-fun4NectriaceaePseudocosmosporaPseudocosmospora viliorKP050600.19913.33Pd-fun5PhaeosphaeriaceaeSetophomaSetophoma terrestrisKP191631.19920.00

圖1 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌代表菌株的菌株形態(tài)

圖2 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定54株代表性內(nèi)生細(xì)菌菌株經(jīng)分子鑒定可劃分為17個(gè)OTUs (Pd-bac1～Pd-bac17) (表2)，隸屬3門5綱6目9科12個(gè)屬，分別是無(wú)色菌屬(Achromobacter)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、不動(dòng)細(xì)菌屬(Acinetobacter)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、金黃桿菌屬(Chryseobacterium)、腸桿菌屬(Enterobacter)、賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、泛菌屬(Pantoea)、沙門氏菌屬(Salmonella)、志賀氏菌屬(Shigella)和葡萄球菌屬(Staphylococcus)。其中優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌屬，占總菌株數(shù)的24.07%，次優(yōu)勢(shì)屬為腸桿菌屬，占16.67%(表2)。部分代表性內(nèi)生細(xì)菌菌株形態(tài)(圖3)，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖4)。

表2 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細(xì)菌代表性菌株序列相似性比較

圖3 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細(xì)菌的代表菌株形態(tài)

圖4 大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細(xì)菌16s rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 討 論

本研究的大尖囊蝴蝶蘭根部?jī)?nèi)生真菌的分離率較低，與其他研究結(jié)果相似，都反映了熱帶附生蘭科植物內(nèi)生真菌的低侵染率[18]。對(duì)很多附生蘭科植物而言，菌絲團(tuán)的分離相當(dāng)困難，因?yàn)槠涓挡](méi)有被菌根真菌大量侵染[19]。尤其是在熱帶地區(qū)，附生蘭科植物中觀察到的菌絲團(tuán)往往很快就會(huì)被消解掉[20]。

大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生真菌的5個(gè)OTUs均屬于子囊菌門(Ascomycetes)，其中優(yōu)勢(shì)屬為球二孢屬(Lasiodiplodia)和曲霉屬(Aspergillus)。目前研究表明，大部分的蘭科植物內(nèi)生真菌都屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycete)和子囊菌門(Ascomycetes)[21]。盡管目前普遍認(rèn)為蘭科植物大都與絲核菌類(Rhizoctonia-like fungi)真菌共生，主要涉及擔(dān)子菌門的角擔(dān)菌科(Ceratobasidiaceae)、膠膜菌科(Tulasnellaceae)和蠟殼菌科(Sebacinaceae)，這些類群被歸為菌根內(nèi)生真菌[22]。但近年來(lái)不斷有研究發(fā)現(xiàn)擔(dān)子菌門的其他種類，甚至子囊菌門真菌也可以與蘭科植物形成蘭科菌根[22]。另外，子囊菌門也是蘭科植物中分離頻率最高的內(nèi)生真菌[23]。陳娟等[24]研究了5種藥用蘭科植物的可培養(yǎng)內(nèi)生真菌多樣性，241株菌株被鑒定屬于子囊菌門，僅有10株菌株屬于擔(dān)子菌門。陳娟等[25]、王亞妮[26]發(fā)現(xiàn)蘭科石斛屬(Dendrobium)中分離出的大部分內(nèi)生真菌同樣屬于子囊菌門(約占總種類的80%)，僅有少數(shù)屬于擔(dān)子菌門。柯海麗等[27]從五唇蘭(Phalaenopsispulcherrima)根部分離到的內(nèi)生真菌大部分也屬于子囊菌門。

盡管非菌根內(nèi)生真菌與蘭科植物是否存在共生關(guān)系還不明確，但有研究表明許多非菌根內(nèi)生真菌也具備多方面的促生能力，是不可忽視的微生物資源。例如，子囊菌門鐮刀菌屬的部分種類可刺激蘭花種子發(fā)芽[28]；帥紅艷[29]發(fā)現(xiàn)鐮刀菌對(duì)鐵皮石斛(Dendrobiumcatenatum)幼苗也具有促生作用；Chen等[30]發(fā)現(xiàn)鐮刀菌能提高環(huán)草石斛(D.loddigesii)的生長(zhǎng)速度和生物量。Wang等[31]從華石斛(D.sinense)根部分離到的木霉屬(Trichoderma)菌株能夠極顯著促進(jìn)華石斛組培苗的生長(zhǎng)，能夠協(xié)助華石斛植株提高礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和內(nèi)源激素含量，并提高光合性能。本研究從大尖囊蝴蝶蘭的根部分離到的鐮刀菌屬真菌可能極具開(kāi)發(fā)潛力，球二孢屬和炭角菌屬也是蘭科植物中常見(jiàn)的內(nèi)生真菌，其與蘭科植物的關(guān)系還需要進(jìn)一步探索。

蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌方面的研究也是內(nèi)生微生物研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一，目前從蘭科植物的不同器官(根、莖、葉等)均成功分離到了內(nèi)生細(xì)菌。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，這些內(nèi)生細(xì)菌隸屬于近60屬[32]。本研究的大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細(xì)菌菌株劃分為17個(gè)OTUs，隸屬12個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)屬為其芽孢桿菌屬(Bacillus)和腸桿菌屬(Enterobacter)。與已報(bào)導(dǎo)的蘭科物種比較，大尖囊蝴蝶蘭內(nèi)生細(xì)菌多樣性較高，例如，華石斛根部分離出的內(nèi)生細(xì)菌僅有7個(gè)屬，優(yōu)勢(shì)屬是芽孢桿菌屬[33]；從五唇蘭(P.pulcherrima)根部分離的內(nèi)生細(xì)菌有芽孢桿菌屬、伯克氏菌屬、草酸菌屬(Pandoraea)等7個(gè)屬，其中優(yōu)勢(shì)屬為芽孢桿菌屬[7]。Wilkinson等[34]研究了13種地生蘭的內(nèi)生細(xì)菌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬(Pseudomonas)細(xì)菌是最優(yōu)勢(shì)屬，并認(rèn)為蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌的種類和數(shù)量會(huì)隨生境、宿主種類和根齡的不同而變化。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，附生蘭與地生蘭的內(nèi)生細(xì)菌種類有所差異，其中附生蘭的基生根與氣生根內(nèi)的細(xì)菌種類也不同，而氣生根內(nèi)的細(xì)菌更豐富，也更適合細(xì)菌的定殖[35]。

內(nèi)生細(xì)菌對(duì)蘭科植物具有多種多樣的促生作用。從杓唇石斛(Dendrobiummoschatum)根部分離的鞘氨醇菌屬(Sphingomonas)和分枝菌屬(Mycobacterium)細(xì)菌可顯著提高種子的萌發(fā)率[6]；芽孢桿菌屬細(xì)菌則被證明可以防治葉斑病[11]、產(chǎn)IAA[36]、促進(jìn)種子的萌發(fā)和植株生長(zhǎng)[7]；土壤桿菌屬、類芽孢桿菌屬、泛菌屬和伯克氏菌屬等菌種也發(fā)現(xiàn)具有促進(jìn)植株生長(zhǎng)的作用[7]；念珠藍(lán)細(xì)菌屬(Nostoc)兼具固氮和光合作用等[37]。因此，從大尖囊蝴蝶蘭根部分離到的芽孢桿菌屬細(xì)菌可能極具開(kāi)發(fā)潛力，假單胞菌屬、土壤桿菌屬、類芽孢桿菌屬、泛菌屬和伯克氏菌屬等菌種也具一定的研究?jī)r(jià)值，在今后的工作中，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注這些類群與大尖囊蝴蝶蘭的互利共生機(jī)理。

致謝：海南霸王嶺林業(yè)局王進(jìn)強(qiáng)工程師在野外試驗(yàn)中提供了幫助；海南大學(xué)吳文碟、吳姝漪和李靜靜在微生物分離和純化方面提供了指導(dǎo)和協(xié)助，一并致謝！