肌球蛋白輕鏈磷酸酶靶向亞基1在調(diào)節(jié)血管張力中的作用的研究進(jìn)展*

劉小勤 楊艷

(西南醫(yī)科大學(xué)心血管醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)電生理學(xué)教育部和四川省重點實驗室、四川省心血管疾病防治協(xié)同創(chuàng)新中心，四川 瀘州 646000)

血管張力調(diào)節(jié)是收縮與舒張的動態(tài)平衡，血管收縮主要通過肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin lightchain kinase，MLCK)調(diào)節(jié)肌球蛋白輕鏈磷酸化實現(xiàn)，血管舒張主要通過肌球蛋白輕鏈磷酸酶(Myosin light chain phosphatase，MLCP)使肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈(Myosin regulatory light chains，RLC)去磷酸化實現(xiàn)。MLCP是調(diào)節(jié)血管信號的關(guān)鍵分子。MLCP是異源三聚體蛋白磷酸酶，由肌球蛋白靶向亞基(Myosin phosphatase targeting subunit，MYPT)、38kDa催化亞基(Catalytic subunit of protein phosphatase type 1，PP1cδ)和功能未知的21kDa小亞基組成[1]。MLCP作為ROCK(Rho-associated protein kinase，ROCK)和NO/cGMP/PKG(Nitric oxide，NO；cGMP-dependent protein kinase，PKG)途徑的下游靶標(biāo)，其活性決定肌球蛋白調(diào)節(jié)輕鏈磷酸化狀態(tài)以調(diào)節(jié)血管張力。現(xiàn)就MYPT1在調(diào)節(jié)血管張力中的研究進(jìn)行闡述。

1 肌球蛋白磷酸酶靶向亞基結(jié)構(gòu)

肌球蛋白磷酸酶靶向亞基是Hubbard和Cohen在1993年發(fā)明。MYPT有MYPT1、MYPT2、MYPT3、85kDa蛋白磷酸I肌球蛋白結(jié)合亞基(Protein phosphatase 1 myosin binding-subunit of 85 kDa，MBS85)和TGF-β1抑制的膜相關(guān)蛋白(TGF-β1-inhibited，membrane-associated protein，TIMAP)。MYPT1由1032個氨基酸組成，靠近N末端有一個RVxF基序(結(jié)合催化亞基PP1cδ位點)和幾個錨蛋白重復(fù)序列，中心區(qū)域是酸性和絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域，靠近C端是亮氨酸拉鏈(Leucine zipper，LZ)可變剪接結(jié)構(gòu)域[3]。MYPT1家族主要中心(Central insert，CI)外顯子及LZ外顯子可變剪接[1]，可表達(dá)8種亞型[4]；MYPT1也具有多個可磷酸化位點。目前研究集中于亮氨酸拉鏈可變剪接和絲氨酸/蘇氨酸結(jié)構(gòu)域與血管張力調(diào)節(jié)作用。

2 MYPT1亞型與相關(guān)生理病理狀態(tài)

2.1 MYPT1亞型

哺乳動物的CI外顯子亞型轉(zhuǎn)換相對保守。雖然特異性外顯子可變剪接保守，但幾乎所有物種MYPT1的CI外顯子能產(chǎn)生可變剪接[5]，但該區(qū)域可變剪接功能尚不明確。對不同物種的MLCP組成進(jìn)行克隆和測序，確定MYPT1亞型[3,6]。近些年，主要研究MYPT1轉(zhuǎn)錄子LZ可變剪接。其剪接包含外顯子24(Exon 24，E24；鳥類的外顯子23，E23)，改變MYPT1轉(zhuǎn)錄子閱讀框架并引入一個提前終止密碼子，導(dǎo)致C末端缺乏LZ結(jié)構(gòu)。反之，則含有LZ結(jié)構(gòu)。

2.2 MYPT1亞型相關(guān)的生理病理狀態(tài)

在發(fā)育和疾病狀態(tài)下，MYPT1亞型轉(zhuǎn)換與血管張力調(diào)節(jié)相關(guān)，影響血管收縮和NO/cGMP介導(dǎo)的血管舒張。研究發(fā)現(xiàn)，在生長的發(fā)育期和成年期，平滑肌表現(xiàn)慢時相收縮表型，表達(dá)MYPT1-E24/LZ+亞型。之后表現(xiàn)快時相收縮表型，表達(dá)MYPT1-E24/LZ-亞型。De Mey等建立二級腸系膜動脈(Second-order mesenteric artery，MA2)結(jié)扎的“高血流(High flow，HF)/低血流(Low flow，LF)”模型[7]，發(fā)現(xiàn)HF和LF-MA1恢復(fù)MYPT1-E24-/LZ+亞型，但LF-MA1恢復(fù)持久[8]。8-bromoguanosine 3,5′-cyclic-monophosphate(8-Br-cGMP，cGMP激動劑)引起LF-MA1更大舒張。John[9]等誘導(dǎo)小鼠平滑肌條件性敲除E24。單個E24等位基因(轉(zhuǎn)換為MYPT1-LZ+)可增強(qiáng)收縮MA1對diethylamine-NONOate(DEA/NO)和cGMP介導(dǎo)的血管舒張。兩個E24等位基因敲除沒有加強(qiáng)血管轉(zhuǎn)換為MYPT1-E24-/LZ+亞型。MA對MYPT1亞型移位具有高度敏感性。門靜脈高壓[15]和妊娠高血壓[10]血管MYPT1亞型有類似變化。在大鼠心肌梗死和充血性心力衰竭中主動脈和髂動脈MYPT1-LZ+亞型減少[11]。肺動脈高壓大鼠肺動脈MYPT1-LZ+表達(dá)上調(diào)，但總MYPT1量不變[12]。豬冠狀動脈狹宰且不運動會改變心外膜動脈(E24-/LZ+)和阻力小動脈(E24+/LZ-)MYPT1亞型[13]。在妊娠及分娩時，人子宮平滑肌MYPT1亞型表達(dá)發(fā)生變化[14]。總之，MYPT1亞型轉(zhuǎn)換影響NO/cGMP/PKG通路介導(dǎo)舒張效應(yīng)。

3 MYPT1磷酸化位點與血管張力調(diào)節(jié)及相關(guān)生理病理狀態(tài)

3.1 MYPT1磷酸化位點與血管張力調(diào)節(jié)

MYPT1有近130個磷酸化位點參與其磷酸化[15-19]。MYPT1能增強(qiáng)PP1cδ與肌球蛋白結(jié)合的催化活性和特異性[20]。調(diào)節(jié)PP1cδ對RLC活性的MYPT1上多個磷酸化位點是調(diào)節(jié)收縮或舒張效應(yīng)的調(diào)節(jié)點[21]。與調(diào)節(jié)血管張力有關(guān)的MYPT1磷酸化位點主要有：T697、T855、S696、S854、S669。ROCK磷酸化MYPT1-T697和T855位點[22]，磷酸化蘇氨酸位點結(jié)合至PP1cδ，抑制PP1cδ接近LC20底物以減弱MLCP活性[28]。在血管主動脈平滑肌細(xì)胞中，血管緊張素II，內(nèi)皮素-1或(5Z)-7-[(1R,4S,5S,6R)-6-[(1E,3S)-3-Hydroxy-1-octenyl]-2-oxabicyclo[2.2.1]hept-5-yl]-5-heptenoic acid(U46619)明顯增加MYPT1-T696磷酸化水平[23]。MYPT1-T697/T855磷酸化與血管平滑肌收縮有關(guān)。S696和S854可被cAMP依賴性蛋白激酶(cAMP-dependent protein kinase，PKA)和PKG磷酸化[24]，作用于MLCP以引起舒張反應(yīng)。ROCK相關(guān)位點磷酸化阻止PKA磷酸化S696和S854[25,26]，抑制MLCP活性以引起收縮反應(yīng)。S669磷酸化速度比S696更快并且在MYPT1-S696處預(yù)磷酸化可以增強(qiáng)S669磷酸化率。S669磷酸化與NO/cGMP引起舒張效應(yīng)有關(guān)，8-Br-cGMP處理的大鼠腦動脈pS696-MYPT1水平?jīng)]有增加[27]。Nakamura等[28]用cGMP刺激股動脈，其S696磷酸化增加，但雙磷酸化的pS696pT697-MYPT1沒有變化。S668是PKG作用MYPT1的新穎位點，PKG必須存在MYPT1-LZ結(jié)構(gòu)域，使MYPT1-S668磷酸化并激活MLCP[29]。MYPT1通過與PP1c直接相互作用，或作用不同激酶磷酸化及可能影響RLC磷酸化蛋白質(zhì)支架，在調(diào)節(jié)MLCP活性中發(fā)揮重要作用[1,30]。未來可將Phos-tag-SDS-PAGE蛋白質(zhì)印跡與已驗證磷酸化特異性抗體結(jié)合，進(jìn)一步研究PKG與MYPT1磷酸化位點如何整合以控制平滑肌中MLCP活性。

3.2 MYPT1磷酸化位點與生理病理狀態(tài)

老年雜合子MYPT1-T696A/+敲除小鼠基底動脈增加MLC20-S19和MYPT1-T853基礎(chǔ)磷酸化以抑制MLCP活性，具更高血管收縮反應(yīng)性[31]。大鼠尾動脈遇冷，MYPT1-T855磷酸化增加[32]。雄性小鼠腦動脈收縮調(diào)節(jié)與MYPT1-T696、S695/S668磷酸化有關(guān)[33]。麻醉藥氟醚和異氟醚舒張KCl引起大鼠主動脈收縮，抑制MYPT1-T853磷酸化，不影響MYPT1-T696；舒張Ang II誘導(dǎo)大鼠主動脈收縮，抑制MLC和MYPT1-T853磷酸化[34]。DEA/NO抑制豬冠狀動脈MYPT1-T853磷酸化，直徑較大冠狀動脈對硝基類血管擴(kuò)張劑響應(yīng)更強(qiáng)，部分原因是PKG1和MYPT1活性增加[35]。糖尿病小鼠股動脈超收縮反應(yīng)與MYPT1-T696/T853位點磷酸化增加有關(guān)，與MYPT1-S695位點磷酸化無關(guān)[36]。高原缺氧母羊肺動脈ROCK活性增加，即增加MYPT1-T696和T850磷酸化來抑制PKG作用[37]。在T696和T853(人序列)上的p-MRLC和p-MYPT1水平與張力水平一致[38]。

4 MYPT1亞型及MYPT1磷酸化位點與NO/cGMP/PKG

MYPT1-LZ+/-與NO/cGMP/PKG途徑介導(dǎo)血管舒張有關(guān)。當(dāng)缺乏LZ時，PKG會直接結(jié)合MYPT1-LZ-[39]。當(dāng)表達(dá)LZ時，NO下游的cGMP、PKG和MLCP活性增加，這需要PKG1α磷酸化MYPT1。這可能要形成MYPT1-LZ+/PKG復(fù)合物，改變MYPT1構(gòu)象，影響MLCP活性。Huang QQ等證實MYPT1-LZ+是結(jié)合PKG1α-LZ和cGMP使MLCP活化必需的結(jié)構(gòu)域[40]。MYPT1-LZ+表達(dá)降低的平滑肌細(xì)胞對NO敏感性降低[41]。研究證實MYPT1-LZ+對cGMP介導(dǎo)MLC20去磷酸化敏感性更強(qiáng)，使動脈松弛[9,42]。MYPT1亞型可能改變NO/cGMP介導(dǎo)血管舒張的敏感性。本課題組研究雄性成年自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)和成年對照Wistar-Kyoto(WKY)大鼠，高血壓老年大鼠(SHR-old)和WKY老年大鼠(WKY-old)三級腸系膜動脈對NO供體硝普鈉(Sodium nitroprusside，SNP)的敏感性，在SNP濃度為10nM時，成年對照WKY大鼠三級腸系膜動脈對SNP的敏感性比其他三組動物高，但這是否與MYPT1亞型轉(zhuǎn)換有關(guān)，將進(jìn)行進(jìn)一步探索。

NO/cGMP/PKG1α途徑激活MLCP在平滑肌舒張中起重要作用。PKG引起平滑肌松弛，部分原因是MLCP增加LC20去磷酸化的速率[43]。PKG催化MYPT1-S695磷酸化，S695磷酸化不是直接激活MLCP[44]，而是通過阻止相鄰抑制性T696[24]磷酸化或通過激活使pMYPT1-T696去磷酸化的未知磷酸酶來激活MLCP。MYPT1-S695/T696磷酸化之間的拮抗作用促進(jìn)MLCP抑制狀態(tài)的降低[24]。PKG對MYPT1磷酸化是由PKG與MYPT1-LZ+作用介導(dǎo)的[42]。MYPT1-LZ+是PKG1α高親和力底物。MYPT1亞型和磷酸化位點對于確定血管床對硝基異質(zhì)反應(yīng)是重要的，在健康和疾病下調(diào)節(jié)血管張力中起重要作用[45]。本課題組發(fā)現(xiàn)成年SHR、SHR-old、WKY-old與WKY大鼠相比，WKY大鼠MA3對SNP敏感性更強(qiáng)，機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)成年SHR、SHR-old和WKY-old的MA3的可溶性環(huán)化酶1α、可溶性環(huán)化酶1β和PKG1α蛋白表達(dá)發(fā)生改變，MYPT1磷酸化位點情況將進(jìn)一步研究。

5 展望

MYPT1是一種潛在的重要血管疾病治療靶點，已有研究表明MYPT1與疾病的相關(guān)性。MYPT1亞型轉(zhuǎn)換和MYPT1磷酸化條件多種多樣。由于難以確定作用特異性，靶向MYPT1以用于調(diào)節(jié)MLCP活性和平滑肌收縮尚未取得較大研究進(jìn)展。MYPT1可變剪接結(jié)構(gòu)可能具有較大潛力。MYPT1亞型轉(zhuǎn)換和磷酸化位點與血管張力作用需要繼續(xù)探索，靶向位點特異性MYPT1磷酸化的特異性分子值得進(jìn)一步研究，這些工作將為治療心血管疾病探求到新靶點。