丁 琦，林偉新,蔡教英，林國(guó)生，王小玉，游淑珠，陳俊言，許喜林

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640;2.珠海出入境檢驗(yàn)檢疫局,珠海 519000)

大腸埃希氏菌(DiarrheagenicEscherichiacoli)是一類能引起人體以腹瀉癥狀為主的細(xì)菌，可經(jīng)過(guò)污染食物引起人類發(fā)病。常見的致瀉大腸埃希氏菌主要包括腸道致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸道侵襲性大腸埃希氏菌(EIEC)、產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、產(chǎn)志賀毒素大腸埃希氏菌(包括腸道出血性大腸埃希氏菌，STEC/EHEC)和腸道集聚性大腸埃希氏菌(EAEC)，雖然類別多樣，但都是能夠通過(guò)傳播導(dǎo)致人畜共患病的病原菌[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)近年來(lái)除腸道出血性大腸埃希氏菌O157外引起的食源性疾病致病病例中，有71%是由O26、O45、O103、O111、O121和O145血清型所致[3]，其中O26的報(bào)道較多。腸道出血性大腸埃希氏菌 O26現(xiàn)已經(jīng)逐漸成為美國(guó)、加拿大、澳大利亞及部分歐盟發(fā)達(dá)國(guó)家引起人類食源性疾病的主要病原菌[4-8]。因此，快速檢測(cè)和鑒別食品中腸道出血性大腸埃希氏菌O26是保障食品質(zhì)量安全和防止食源性疾病暴發(fā)的有效手段。本文主要應(yīng)用PCR方法，通過(guò)設(shè)計(jì)引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立食品中大腸埃希氏菌O26血清型的PCR檢測(cè)方法，以便對(duì)其進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)，并有利于克服傳統(tǒng)分離鑒定方法耗時(shí)費(fèi)力、步驟繁瑣等不足之處。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

目標(biāo)菌株：大腸埃希氏菌ATCC 12795。非目標(biāo)菌株：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2469、大腸埃希氏菌ATCC 23982、大腸埃希氏菌ATCC 35150、大腸埃希氏菌CCTCC AB 200051、大腸埃希氏菌EHEC Stx1、大腸埃希氏菌EHEC Stx2、大腸埃希氏菌NCTC 12900、大腸埃希氏菌EC O104、大腸埃希氏菌ATCC 43887、大腸埃希氏菌ATCC 29552、大腸埃希氏菌ATCC 33780、大腸埃希氏菌ATCC BAA-2190。

1.1.2 主要試劑

營(yíng)養(yǎng)肉湯(廣州環(huán)凱)；腸道菌增菌肉湯(北京路橋)；DNA 提取試劑盒(Tiangen公司)；PCR反應(yīng)預(yù)混液、DNA Marker DL2000(TAKARA公司)；引物(Invitrogen 公司)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒DP302-02 (天根生化科技有限公司)；瓊脂糖H(生工生物工程(上海)股份有限公司)；Premix ExTaq2× (大連寶生物公司)。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

培養(yǎng)箱(BINDER)；高壓滅菌鍋(HIRAYAMA)；超低溫冰箱(Thermo)；超微量分光光度計(jì)(Thermo)；高速離心機(jī)(艾本德)；梯度PCR儀(艾本德)；電泳儀(Bio-Rad)；凝膠成像系統(tǒng)(Alpha Innotech)。

1.1.4 PCR引物序列

表1 引物序列與相關(guān)參數(shù)Table 1 Sequences and parameters of the primers

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取、濃度及純度的測(cè)定

采用DNA提取試劑盒(離心柱型)提取DNA，按照試劑盒提供的說(shuō)明書進(jìn)行操作。使用超微量分光光度計(jì)測(cè)DNA的濃度。

1.2.2 PCR反應(yīng)的建立

反應(yīng)體系：Premix ExTaq(2×) 12.5 μL，引物對(duì)工作液1 μL，加DNA模板2 μL，加ddH2O 9.5 μL至25 μL。反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s，72℃延伸1 min。我們分別對(duì)影響PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)、引物濃度、退火溫度等因素進(jìn)行探究和優(yōu)化，以先確定退火時(shí)間、退火溫度，最后確定循環(huán)數(shù)的順序探究。退火時(shí)間梯度為30、60、90 s；退火溫度梯度為55.2℃、55.8℃、56.7℃、57.8℃、59.1℃、60.4℃、61.7℃、62.9℃、63.9℃及64.6℃；循環(huán)數(shù)為30、35和40個(gè)，分別在不同的退火溫度下同時(shí)擴(kuò)增各目標(biāo)片段。5 V/cm恒壓電泳30 min，用凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.3 特異性試驗(yàn)

將目標(biāo)菌株和非目標(biāo)菌株的DNA作為模板，采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測(cè)，以評(píng)價(jià)引物的特異性。

1.2.4 靈敏度試驗(yàn)

將經(jīng)提取的模板DNA，用核酸蛋白分析儀測(cè)定其核酸濃度，按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8稀釋成濃度梯度，每個(gè)稀釋度分別吸取2 μL用于PCR實(shí)驗(yàn)，以ddH2O代替DNA模板作為陰性對(duì)照，采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測(cè)，以確定其靈敏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系的建立

2.1.1 退火時(shí)間的優(yōu)化

從圖1可以看出，在30、60和90 s 3個(gè)退火時(shí)間都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶；退火時(shí)間為90 s的擴(kuò)增條帶有點(diǎn)拖尾，30 s條帶稍亮于60 s條帶。在沒有明顯差異時(shí)，考慮到退火時(shí)間短可以降低非特異性擴(kuò)增概率，同時(shí)考慮檢測(cè)的快捷原則，所以選擇30 s作為PCR反應(yīng)的退火時(shí)間。

M：DL2000 Marker ；1～2：退火時(shí)間30 s；3～4：退火時(shí)間60 s；5～6：退火時(shí)間90 s

圖1退火溫度對(duì)單重PCR的影響
Figure 1 The effect of annealing temperature on PCR

2.1.2 退火溫度的優(yōu)化

從圖2可以得知，在10個(gè)退火溫度梯度都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶?？紤]到退火溫度在亮度無(wú)明顯差異時(shí)選擇較高溫度可以避免非特異性結(jié)合，選擇60.4℃作為PCR反應(yīng)條件的退火溫度。

M：2000 bp Marker；O26退火溫度，1～10分別為55.2℃、55.8℃、56.7℃、57.8℃、59.1℃、60.4℃、61.7℃、62.9℃、63.9℃和64.6℃

圖2退火溫度對(duì)單重PCR的影響
Figure 2 The effect of annealing temperature on PCR

2.1.3 循環(huán)數(shù)的摸索

從圖3可以得知，O26菌株在30、35、40這3種循環(huán)數(shù)下擴(kuò)增都有較清晰條帶并且特異性較好，沒有雜帶；所以我們選擇35個(gè)循環(huán)作為單重PCR的反應(yīng)條件。

M：2000 bp Marker；O26循環(huán)數(shù)，1～2為30個(gè)循環(huán)；3～4為35個(gè)循環(huán)；5～6為40個(gè)循環(huán)

圖3循環(huán)數(shù)對(duì)PCR的影響
Figure 3 The effect of recurring number on PCR

綜上所述，確定PCR體系：Premix ExTaq2×12.5 μL ，引物對(duì)工作液1 μL，加DNA模板2 μL，加ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性20 s ，60.4℃退火30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸1 min。

2.2 特異性試驗(yàn)

將所有菌株的DNA分別吸取2 μL用于PCR實(shí)驗(yàn)，在同一反應(yīng)體系中加入大腸埃希氏菌ATCC 12795核酸模板1 μL作為陽(yáng)性對(duì)照，采用優(yōu)化好的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行PCR檢測(cè)O26血清型特異基因，以確定其特異性，所有菌株擴(kuò)增結(jié)果與預(yù)期結(jié)果完全一致，擴(kuò)增電泳圖如圖4。

M：DNA Marker DL2000；1：大腸埃希氏菌ATCC 12795；2：大腸埃希氏菌ATCC 12795；3：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2469；4：大腸埃希氏菌ATCC 23982；5：大腸埃希氏菌ATCC 35150；6：大腸埃希氏菌CCTCC AB 200051；7：大腸埃希氏菌EHEC Stx1；8：大腸埃希氏菌EHEC Stx2；9：大腸埃希氏菌NCTC 12900；10：大腸埃希氏菌EC O104；11：大腸埃希氏菌ATCC 43887；12：大腸埃希氏菌ATCC 29552；13：大腸埃希氏菌ATCC 33780；14：大腸埃希氏菌ATCC BAA-2190

圖4 PCR特異性試驗(yàn)
Figure 4 Specificity test of PCR reaction

2.3 靈敏度試驗(yàn)

將濃度為100 ng/μL的核酸逐步進(jìn)行10倍稀釋后分別進(jìn)行PCR反應(yīng)通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，核酸經(jīng)過(guò)10-8倍稀釋后，普通PCR 產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳染色后能觀測(cè)到1 pg/μL濃度的條帶，結(jié)果見圖5。這說(shuō)明該反應(yīng)的靈敏度能達(dá)到1 pg/μL。

M：DNA Marker DL2000；1～9：大腸埃希氏菌ATCC 12795核酸100～10-8稀釋物各2 μL

圖5擴(kuò)增靈敏度試驗(yàn)
Figure 5 sensitivity test of PCR reaction

2.4 樣品加標(biāo)試驗(yàn)

將新鮮培養(yǎng)的目標(biāo)菌制成約0.35 McF濃度的菌懸液，10倍遞增稀釋至10-7稀釋度，此時(shí)樣品菌懸液濃度為10 CFU/mL的菌懸液用于樣品加標(biāo)試驗(yàn)。無(wú)菌取25 g食品樣品至225 mL EC肉湯，分別添加對(duì)應(yīng)目標(biāo)菌株10 CFU/mL的菌懸液1 mL加至食品樣品肉湯制備成10 CFU/25 g的加標(biāo)樣品，拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)2 min。將上述EC肉湯置36℃增菌24 h，分別采用普通PCR進(jìn)行檢測(cè)。各濃度添加樣品試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)10 CFU/25 g。

3 討論

目前對(duì)于食品中大腸埃希氏菌的檢測(cè)，基本上采用的是傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方法，檢驗(yàn)步驟繁雜，周期長(zhǎng)[9]。而PCR比傳統(tǒng)微生物檢驗(yàn)更快速，比核酸探針檢測(cè)法更廉價(jià)。本研究建立的方法比特異性高，靈敏度高，適用于臨床診斷、食品衛(wèi)生監(jiān)控及進(jìn)出口食品安全檢測(cè)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，可推廣使用。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用該引物可以對(duì)大腸埃希氏菌O26進(jìn)行特異性擴(kuò)增以達(dá)到檢測(cè)目的。大腸桿菌作為較常見的污染致病菌，雖然國(guó)內(nèi)外都有使用PCR檢測(cè)大腸桿菌的相關(guān)研究，但大多是檢測(cè)大腸桿菌O157：H7，并且多與沙門氏菌、金黃色葡萄球菌聯(lián)同檢測(cè)[10]。近兩年國(guó)外有少量以大腸埃希氏菌O26為對(duì)象的研究[11-13]，國(guó)內(nèi)針對(duì)大腸埃希氏菌O26的研究較少，這也就是本論文研究的必要性。通過(guò)本文的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，一方面可以豐富大腸埃希氏菌主干研究?jī)?nèi)容，為其檢測(cè)和應(yīng)用提供可能性；另一方面可以為食源性污染提供快速檢測(cè)方法，降低生活中食源性疾病暴發(fā)的可能性。