趙慧瑩,李言郡,陳 蘇,歐 凱,王 健,何國慶,*

(1.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,浙江杭州 310058; 2.杭州娃哈哈科技有限公司,浙江杭州 310009)

近年來,我國發(fā)酵乳制品市場快速發(fā)展,市場需求增大促使發(fā)酵乳制品產(chǎn)量大幅提升。發(fā)酵劑易受噬菌體感染,從而影響乳品酸化率及其風味,甚至導致發(fā)酵失敗,因此噬菌體被認為是乳品生產(chǎn)加工環(huán)境的主要威脅因子[1]。許多乳品發(fā)酵工廠采取菌種輪換、凈化生產(chǎn)環(huán)境、使用噬菌體抑制劑、高溫處理等措施[2]來控制噬菌體污染,但由于乳品發(fā)酵工廠并非無菌環(huán)境,而且有時殺菌的條件不足以使一些耐熱噬菌體完全失活[3],這個問題難以得到徹底解決。

乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌被廣泛應用于發(fā)酵乳制品中,因此國內外研究大多集中在探索乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌等模型噬菌體與對應乳酸菌宿主間的相互作用關系上[4-7],尤其是在乳酸乳球菌噬菌體的研究中,發(fā)現(xiàn)噬菌體吸附感染宿主的相關機制,為研究新的乳酸菌噬菌體及其宿主的相互作用奠定了基礎。噬菌體感染乳酸乳球菌的第一步就是受體結合蛋白(Receptor Binding Protein,RBP)與受體相互作用,本文從乳酸乳球菌噬菌體吸附受體和受體結合蛋白兩方面對乳酸乳球菌噬菌體-宿主相互作用進行綜述,以期為研究其他乳酸菌噬菌體種群及防治措施提供一定的理論基礎。

1 乳酸乳球菌噬菌體的分類

噬菌體是感染細菌、真菌等微生物的病毒總稱,部分能引起宿主菌的裂解。根據(jù)噬菌體對宿主細胞的影響可將噬菌體分為烈性噬菌體和溫和噬菌體[8],根據(jù)被侵染乳酸菌菌株的不同將乳酸菌噬菌體分為乳酸乳球菌噬菌體、嗜熱鏈球菌噬菌體、植物乳桿菌噬菌體等。此外,也可根據(jù)形態(tài)特征進行分類,乳酸菌噬菌體幾乎都歸屬于尾病毒目,分成肌尾病毒科、長尾病毒科以及短尾病毒科[9]。

乳制品發(fā)酵常用的乳酸菌有乳球菌、乳桿菌、鏈球菌和明串珠菌等[10],乳酸乳球菌是乳品發(fā)酵領域中使用最廣的發(fā)酵劑,其噬菌體的結構、基因組多樣性和噬菌體-宿主相互作用的研究也最為深入[11]。根據(jù)遺傳和形態(tài)特征將乳酸乳球菌噬菌體分為十個不同的群體,在乳制品生產(chǎn)中最常見的有三類,即烈性的936型、c2型噬菌體、含有烈性和溫和噬菌體的P335型噬菌體[12]。烈性噬菌體侵染宿主細胞后能引起宿主細胞裂解,在短時間內就可完成吸附、侵入、增殖、裝配、裂解這五個過程;P335型噬菌體中溫和噬菌體吸附侵染宿主細胞后會將其核酸整合到宿主菌的染色體上,與其一同復制,并不進行增殖,也不會引起宿主細菌裂解,使宿主以溶源性細菌的形式存活,但在溫度、絲裂霉素、紫外線等誘導下可轉變成烈性噬菌體并釋放噬菌體顆粒[13]。

2 乳酸乳球菌噬菌體-宿主相互作用

2.1 乳酸乳球菌噬菌體侵染過程

在噬菌體侵染乳酸乳球菌宿主的過程中,噬菌體首先接觸并吸附在細菌的細胞壁上。乳酸乳球菌噬菌體對宿主的識別取決于噬菌體表面的特異性受體結合蛋白,其可以識別在宿主菌細胞表面的蛋白質或碳水化合物受體并與之結合[14]。在侵染的第一步,RBP識別受體結合部位是可逆的,因此無法確保噬菌體可以成功侵染宿主菌。在第二個階段,噬菌體在位于細菌細胞表面的蛋白質之間與細胞發(fā)生不可逆的結合[15]。該特定結合位點主要是位于細胞壁上的糖類,常見的有半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖胺化合物等[16]。隨后,噬菌體將頭部的遺傳物質注入到宿主細胞質中,其蛋白質外殼留在外面。進入裂解模式的噬菌體立即開始利用宿主細胞內的物質復制遺傳物質、合成噬菌體編碼蛋白,最后產(chǎn)生釋放大量的噬菌體后代粒子;而溶源性噬菌體則進入其溶源性周期[13]。

2.2 乳酸乳球菌噬菌體受體結合蛋白

1993年,c2噬菌體RBP被首次鑒定[17],在九十年代末和二十一世紀初期,人們獲得了第一批有代表性的936型和P335型噬菌體的基因組序列,其中最重要的是936型噬菌體sk1和bIL170和P335型噬菌體TP901-1和Tuc2009的基因組序列的發(fā)現(xiàn),使得基于基因組學來研究這些噬菌體群體的噬菌體-宿主相互作用成為可能。2004年,936型噬菌體sk1和bIL170的RBP被確定,通過假想噬菌體的構建確定了編碼宿主細胞表面假定糖受體的遺傳元件,成為相互作用研究中最重要的轉折點之一[12,18]。隨后P335型噬菌體TP901-1和Tuc2009的RBP也很快被確定,且這些噬菌體也能識別細胞表面的碳水化合物[19],該類噬菌體RBP的氨基末端是保守的,而羧基末端存在差異,表明后者與噬菌體和宿主受體之間相互作用的特異性有關[20]。

盡管乳酸乳球菌噬菌體群內的基因序列不相似,甚至不在同一個屬,但它們的基因結構模塊都是保守的[21]。因此在已經(jīng)過深入研究的噬菌體如TP901-1,Tuc2009和p2的基礎上,可以推測許多基因產(chǎn)物的功能。噬菌體p2和TP901-1具有各自獨特的RBP基因,然而它們的RBP結構中都具有相似的結構排列。乳酸乳球菌噬菌體的RBP包含三個功能區(qū)域,即與宿主受體相互作用的頭部區(qū)域、與基板激活器相連的肩膀區(qū)域以及作為頭部和肩膀區(qū)域之間橋梁的頸部區(qū)域[22-26]。雖然RBP的模塊性質是保守的,但也存在細微的差異,這很好地解釋了噬菌體與其宿主相互作用的特異性。乳酸乳球菌噬菌體之間RBP的肩部區(qū)域非常相似,這是因為它們與噬菌體元件相互作用,而與宿主細胞表面的特定受體相互作用的頭部區(qū)域是不同的[24]。

2.3 乳酸乳球菌噬菌體吸附受體

1994年,Schouler等[27]獲得了第一個乳球菌噬菌體的完整基因組序列,該c2型噬菌體可識別乳酸乳球菌細胞壁上的一種保守蛋白,被命名為噬菌體感染蛋白(Phage Infection Protein,PIP)。隨后研究人員篩選到抗c2型噬菌體菌株,該菌株編碼PIP的基因自發(fā)缺失,此后人們分離到c2型噬菌體的頻率逐漸降低。然而PIP的編碼基因有所缺失的抗c2型噬菌體菌株再次自發(fā)突變,c2型噬菌體在乳品發(fā)酵設備中再次被分離得到[28-29],該發(fā)現(xiàn)表明菌株自發(fā)突變產(chǎn)生的噬菌體抗性不穩(wěn)定,容易再次突變失去抗性,往后的研究或可通過基因工程的手段除去c2噬菌體敏感菌株中的PIP編碼基因,從而獲得對c2型噬菌體擁有穩(wěn)定抗性的乳酸乳球菌菌株。

在噬菌體基因組序列未知的情況下,噬菌體的尾尖形態(tài)可提供關于受體的信息。TP901-1和Tuc2009噬菌體的寬基板結構,或是936型噬菌體離散的基板結構,均可識別細胞表面的糖受體——細胞壁多糖(cell wall polysaccharides,CWPSs)。CWPSs是按特定格式排列的雜多糖,噬菌體與宿主結合需要蛋白質-蛋白質和蛋白質-碳水化合物的相互作用同時進行,以確保噬菌體和宿主之間的成功吸附,這就需要尾尖提供多個RBP,如TP901-1/Tuc2009和p2的基板中分別含有54和18個受體結合單元[23,25-26];而末端或尾部纖維粗短的噬菌體,如乳酸乳球菌c2型噬菌體和德氏乳桿菌噬菌體LL-H,可識別細胞表面的蛋白質或脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)受體[30]。在噬菌體識別蛋白質的情況下,因為蛋白質之間的相互作用比蛋白質碳水化合物的相互作用強,小尾巴或尾纖維足以進行蛋白質-蛋白質相互作用。同樣,由于LTA主要由核糖醇或磷酸甘油重復單位組成,結構保守而缺乏多樣性,噬菌體識別LTA不要求基板有特定的空間排列[31],粗短的尾部足以識別并結合受體。

Vinogradov等[32]將P335型和936型噬菌體的受體明確地定義為由高度可變的CWPSs組成的特定多糖,迄今發(fā)現(xiàn)的乳酸乳球菌的CWPSs均包含一種富含鼠李糖的多糖,Mahony等[20]利用多重PCR技術根據(jù)基因型將乳酸乳球菌的CWPSs分為A、B和C三個類型。三種類型的CWPSs都含有帶負電荷的寡糖/多糖,其在A型和B型菌株中以共價鍵與鼠李糖相連,而C型菌株的多糖和鼠李糖之間的確切聯(lián)系有待確定[33]。Ainsworth等[34]對C型CWPSs操縱子進行了深入的分析,根據(jù)主要編碼糖基轉移酶操縱子內的可變區(qū)發(fā)現(xiàn)該組中至少有五個亞組。

目前已知三種乳酸乳球菌C型CWPSs的生化結構,第一個具有代表性的是乳酸乳球菌菌株MG1363的CWPSs,MG1363是936型噬菌體p2的宿主[35];第二個是P335型噬菌體TP901-1的宿主3107的CWPSs[34];第三個是近年來新發(fā)現(xiàn)的乳酸乳球菌1358型噬菌體的宿主L.lactisSMQ-388的CWPSs[36]。Mccabe等[37]通過比較這些菌株CWPSs生化結構,發(fā)現(xiàn)在重復多糖單元的還原末端有一個半保守三糖;由于1358型噬菌體不能感染MG1363,卻能夠感染L.lactisSMQ-388和3107,因此推測這兩種菌的核心三糖(這兩種菌的三糖相同,與MG1363稍有不同)是該類噬菌體可識別的一種特異性三糖;為證實該推論,研究人員合成該半保守三糖并利用X射線晶體學研究評估其與受體結合位點結合的能力,發(fā)現(xiàn)該三糖占據(jù)了1358型噬菌體RBP頭部區(qū)域內的縫隙,從而起到受體結合和宿主識別作用?；诖?可推測噬菌體TP901-1和p2也可識別這種三糖,且相互作用的特異性是由該多糖的還原末端的組成和性質造成的。此外,另兩類乳酸乳球菌949型和P087型噬菌體已被證明能夠識別各自宿主細胞表面的CWPSs,通過對其宿主菌株的CWPSs進一步的生物化學分析,未來的研究可能會揭示這些噬菌體可識別的特定碳水化合物的結構[38]。

目前在已知的十類乳酸乳球菌噬菌體中只發(fā)現(xiàn)一類識別蛋白質受體(c2),以及五類可識別乳球菌細胞壁上的CWPSs(P335、936、1358、949和P087),而其余乳酸乳球菌噬菌體的宿主范圍狹窄,因此,研究人員推測這些噬菌體極有可能也識別細胞表面上的CWPSs,這個推論與Oliveira等[39]的發(fā)現(xiàn)相符。雖然Legrand等[40]已經(jīng)對P335型噬菌體吸附受體及其RBP結構進行了詳細研究,但碳水化合物受體的確切性質和組成仍然未知;936型噬菌體的RBP序列和CWPSs基因型間存在相關性,可在后續(xù)研究中用來預測乳酸乳球菌菌株對936型噬菌體的敏感性。闡明乳酸乳球菌菌株的CWPSs結構是認識噬菌體識別過程的關鍵,目前已知的三種C型菌株的CWPSs對分析A型和B型CWPSs的生化組成和結構、加深對受體多樣性和乳酸乳球菌噬菌體與宿主間相互作用的理解起著至關重要的作用。

3 展望

近年來,隨著對乳酸菌噬菌體及其宿主的基因組、生化結構的深入研究,研究者對它們之間相互作用的理解也不斷加強。乳酸乳球菌噬菌體作為研究乳酸菌和革蘭氏陽性菌噬菌體的良好模型,最常見的三類乳酸乳球菌936型、c2型、p335型噬菌體的受體結合蛋白已被確定,細胞表面多糖成分是主要的受體物質,且這些糖的組成和排列決定了噬菌體-宿主相互作用的特異性。乳酸菌如嗜熱鏈球菌、乳酸桿菌及明串珠菌的受體結合蛋白編碼基因和受體也相繼被揭曉。新型乳酸菌噬菌體基因組的釋放意味著還有很多相互作用有待探索,了解這些相互作用對乳品工業(yè)解決無處不在的噬菌體問題至關重要。

從最近乳酸菌噬菌體的研究中可以看出,為了完全理解噬菌體-宿主相互作用,需要對噬菌體和宿主展開遺傳學和生物學研究,才能確定噬菌體感染以及噬菌體和宿主共同進化的機制,從而制定相應的防治措施?？梢岳棉D錄組學揭示噬菌體感染對宿主細胞基因表達模式的影響。隨著這項技術的發(fā)展和此類研究的出現(xiàn),噬菌體-宿主相互作用的模式和噬菌體感染的機制也會被逐漸揭曉,未來可能會采取更多樣的措施來控制噬菌體污染。此外,通過對噬菌體和宿主菌組合的基因組進行測序分析,更加深入的了解噬菌體與宿主之間的關系,確定噬菌體識別宿主所需的蛋白質和碳水化合物受體的主次性,從而制定遺傳標記以篩選出對噬菌體不敏感的工業(yè)菌株。未來的乳酸菌噬菌體生物學研究主要依靠組學和結構分析技術來闡明噬菌體-宿主相互作用,開發(fā)出新的噬菌體控制措施與宿主編碼的噬菌體抗性系統(tǒng)共同作用,從而降低噬菌體污染的可能性。