楊曉玫，姚拓,2*，師尚禮，2

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

熒光蛋白標(biāo)記(fluorescent protein labeling)是指利用不同顏色熒光質(zhì)粒通過某種方式結(jié)合其他生物，最終攜帶有顏色熒光且不影響生物正常生理生長(zhǎng)的一種方法[1]，因其高靈敏度倍受各位學(xué)者的不斷研究，成為目前生物大分子檢測(cè)的主要方法，有著發(fā)光強(qiáng)和穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。熒光標(biāo)記不需要其他輔助生物發(fā)光標(biāo)記系統(tǒng)，能夠簡(jiǎn)化對(duì)定殖的研究，促進(jìn)植物機(jī)理的研究，增加物種研究的可視性。不同顏色的熒光標(biāo)記結(jié)合不同的生物是進(jìn)一步研究的重要條件，有著重要的影響，因此熒光蛋白標(biāo)記是分子標(biāo)記的重要手段與方法。熒光蛋白標(biāo)記包括熱激轉(zhuǎn)導(dǎo)和電擊轉(zhuǎn)化兩種不同的類型，并且熒光蛋白質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)菌的技術(shù)一直在不斷完善之中[2]，熒光蛋白無毒性，保持熒光時(shí)不影響生物體功能[3]，已在生物學(xué)中有重要地位，廣泛應(yīng)用在生物的研究[4]，然而，熒光蛋白標(biāo)記必然會(huì)有一定的難度和相對(duì)不穩(wěn)定性，比如轉(zhuǎn)導(dǎo)不成功或者熒光顏色較暗等問題，但同時(shí)會(huì)促進(jìn)動(dòng)植物之間的轉(zhuǎn)基因效率和檢測(cè)基因的表達(dá)水平等[5]，近年來，熒光蛋白標(biāo)記已經(jīng)是分子標(biāo)記研究中的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，并且逐漸形成了較為穩(wěn)定成熟的標(biāo)記方法。

熒光蛋白主要包括綠色、黃色和紅色3種顏色，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)最初從水母(Scyphozoa)中分離，Matz等[6]從不發(fā)光的海洋生物群克隆到了GFP基因，可在細(xì)菌、真菌、植物、動(dòng)物中廣譜表達(dá)產(chǎn)生綠色熒光[7]，黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)最初來自維多利亞多管水母(Aequoriavictoria)，發(fā)射波長(zhǎng)為527 nm，是GFP的一種突變體[8]，紅色熒光蛋白(red fluorescent protein,RFP)最初從珊瑚蟲中分離，發(fā)射波長(zhǎng)為583 nm，是GFP的同源熒光蛋白[6,9]。熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)可以充分利用不同顏色的熒光穩(wěn)定特性，能快速標(biāo)記且檢測(cè)簡(jiǎn)單，并能穩(wěn)定遺傳且有最佳的示蹤結(jié)果[10]，本研究對(duì)國(guó)內(nèi)外熒光蛋白標(biāo)記進(jìn)行了綜述，總結(jié)了現(xiàn)有的科研成果，分析研究熒光蛋白標(biāo)記面臨的挑戰(zhàn)，同時(shí)對(duì)其應(yīng)用研究進(jìn)行了展望。

1 熒光蛋白標(biāo)記的原理

不同顏色熒光蛋白的標(biāo)記條件略有差異，但歸納起來，標(biāo)記原理都大體一致，主要是利用熒光致發(fā)光的現(xiàn)象觀察，通過紫外線或X射線照射，使得波長(zhǎng)進(jìn)入激發(fā)態(tài)，發(fā)出比入射光波長(zhǎng)的出射光。熒光蛋白標(biāo)記是利用大腸桿菌(Escherichiacoli)作為輔助菌載體，進(jìn)行質(zhì)粒重組，以達(dá)到基因定位、基因表達(dá)的目的。隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，打破了單一的單色標(biāo)記，進(jìn)行不同顏色熒光蛋白雙色或者多色標(biāo)記，不同顏色的熒光蛋白標(biāo)記的發(fā)展不一，例如綠色熒光蛋白標(biāo)記，田濤等[11]在果蠅(Drosophilidae)、大腸桿菌等生物體內(nèi)成功表達(dá)GFP基因，GFP標(biāo)記系統(tǒng)作為分子標(biāo)記物的歷史不長(zhǎng)，但如今越來越多的研究人員將其作為一種高效快速的研究工具。

2 熒光蛋白標(biāo)記的主要內(nèi)容

2.1 熒光蛋白標(biāo)記的對(duì)象和類型

目前的研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)質(zhì)粒標(biāo)記都能與大腸桿菌結(jié)合，通過大腸桿菌的輔助作用得以實(shí)現(xiàn)標(biāo)記，大腸桿菌遺傳背景較為清晰，是構(gòu)造簡(jiǎn)單的原核生物，比較容易培養(yǎng)，常將質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移到大腸桿菌，質(zhì)粒為游離在大腸桿菌中細(xì)胞染色體外能自主復(fù)制的分子量較小的環(huán)狀DNA分子，通過熒光蛋白的標(biāo)記，可以直接觀察菌株的遷移和定殖，為菌株的作用機(jī)制研究打下基礎(chǔ)。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，蛋白質(zhì)粒能穩(wěn)定的導(dǎo)入至細(xì)菌中[12]，熒光蛋白在植物、動(dòng)物、微生物中均有研究，都可被熒光蛋白通過輔助菌幫助標(biāo)記，胡迎青等[13]研究證明利用分子生物學(xué)鑒定的體外重組表達(dá)質(zhì)粒，在PCR反應(yīng)時(shí)對(duì)模板純度的要求不高，比較容易完成熒光蛋白的標(biāo)記。

2.2 標(biāo)記方式

國(guó)內(nèi)外熒光蛋白標(biāo)記的方式主要有轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)兩種，在研究中質(zhì)粒都能成功與大腸桿菌結(jié)合，近期研究表明轉(zhuǎn)導(dǎo)更高效更穩(wěn)定[14]。

2.2.1轉(zhuǎn)導(dǎo) 最先研究發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象是在細(xì)菌中吸收不同DNA基因型改變自身的基因型和表型[15]，革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌均能進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程一般包括感受態(tài)的出現(xiàn)、DNA的結(jié)合和進(jìn)入、DNA的整合3個(gè)階段，感受態(tài)提供吸取DNA的生理狀態(tài)，可用Ca2+或Mg2+誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生感受態(tài)，轉(zhuǎn)導(dǎo)在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)中研究時(shí)間較長(zhǎng)較深入。

2.2.2轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化是以噬菌體為介質(zhì)，使供體菌的目的DNA轉(zhuǎn)移到受體菌內(nèi)部的現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化分為普遍性轉(zhuǎn)化和局限性轉(zhuǎn)化，在普遍性轉(zhuǎn)化中，任何供體的染色體均可轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，而在局限性轉(zhuǎn)化中，被轉(zhuǎn)化的DNA 片段僅是一些靠近染色體溶源化位點(diǎn)的基因[16]。轉(zhuǎn)化的DNA位于噬菌體蛋白殼外，不易被水解較為穩(wěn)定，大部分細(xì)菌均具有噬菌體，可進(jìn)行轉(zhuǎn)化。目前，大腸桿菌在轉(zhuǎn)化中研究最多。

2.3 標(biāo)記條件

熒光標(biāo)記需輔助菌的參與，方能進(jìn)行DNA的轉(zhuǎn)移，由于熒光蛋白發(fā)光團(tuán)無物種專一性，且不依靠任何介質(zhì)發(fā)光，所以轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞的熒光蛋白基因很穩(wěn)定，并對(duì)大多數(shù)宿主細(xì)胞無影響，能顯示單個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)情況[17]。

2.4 檢測(cè)方法

目前，常用檢測(cè)熒光標(biāo)記的方法有以下6種：1)用手提藍(lán)光或長(zhǎng)波紫外燈直接在黑暗環(huán)境下照射菌落或者菌液，可肉眼直觀地觀察出標(biāo)記菌發(fā)出的熒光，進(jìn)行快速的平板計(jì)數(shù)并做記錄。2)具有適當(dāng)濾光片的熒光顯微鏡，被檢測(cè)菌落規(guī)范的放于載玻片，可觀察到單個(gè)標(biāo)記菌體并在相應(yīng)軟件保存照片計(jì)數(shù)記錄。由Omega公司開發(fā)的Openlab圖像處理軟件可對(duì)圖像進(jìn)行必要的處理[17]。3)以激發(fā)光為氬原子488 nm激光的共聚焦激光掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope),能快速準(zhǔn)確的分析熒光標(biāo)記菌在生物膜中的空間定位，具有高分辨率及三維成像的主要功能[18]，為比較實(shí)用理想的熒光檢測(cè)儀。4)使用流式細(xì)胞儀快速計(jì)算熒光標(biāo)記菌數(shù)量及熒光強(qiáng)度，能對(duì)熒光細(xì)胞進(jìn)行定性和定量分析，具有速度快、準(zhǔn)確性好和精度高等特點(diǎn)[19]。5)雙光子激光掃描顯微鏡克服了普通熒光顯微鏡及CLSM(激光共聚焦掃描顯微鏡methods confocal laser scanning microscope)的光漂泊現(xiàn)象，能長(zhǎng)時(shí)間對(duì)熒光標(biāo)記菌進(jìn)行分析與追蹤[20-22]。6)根據(jù)熒光標(biāo)記菌的序列大小使用分子雜交、PCR檢測(cè)和基因探針等分子生物學(xué)的方法進(jìn)行檢測(cè)。

在熒光檢測(cè)中，背景熒光會(huì)直接影響熒光信號(hào)的強(qiáng)弱。在植物中，影響熒光信號(hào)檢測(cè)的自發(fā)熒光源主要是葉綠體和細(xì)胞壁[23]，可通過減少進(jìn)光量或者轉(zhuǎn)換合適的濾光片來解決。Smith[24]認(rèn)為在檢測(cè)熒光基因材料時(shí)，熒光信號(hào)與背景信號(hào)的比值較大的容易得到比較清晰的圖像。

3 熒光蛋白標(biāo)記的研究方法

熒光蛋白標(biāo)記是檢測(cè)和示蹤侵染最直觀、精確且易于操作的方法[25]，不同的熒光蛋白標(biāo)記方法各有優(yōu)缺，使用的標(biāo)準(zhǔn)原因各異，但歸納起來，熒光蛋白標(biāo)記的研究方法主要有以下兩種。

3.1 熱激轉(zhuǎn)導(dǎo)

熱激轉(zhuǎn)導(dǎo)是利用溫度水熱變化導(dǎo)致質(zhì)粒之間的轉(zhuǎn)移接合，需要感受態(tài)細(xì)胞的參與才能順利進(jìn)行，具體方法操作較為復(fù)雜[26]。熱激轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法較為傳統(tǒng)，便于控制，試驗(yàn)耗費(fèi)較低，但國(guó)內(nèi)具有轉(zhuǎn)導(dǎo)所需的所有設(shè)備，是一種實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過高溫變化混合沉淀的過程，實(shí)驗(yàn)室的研究大多數(shù)皆采用傳統(tǒng)熱激轉(zhuǎn)化的方法。通過熱激轉(zhuǎn)導(dǎo)，眾多研究學(xué)者均能較直觀的跟蹤目的基因，不斷優(yōu)化轉(zhuǎn)導(dǎo)條件，李翠等[27]指出熱激蛋白和熱激轉(zhuǎn)錄因子在熱激轉(zhuǎn)化和耐熱性的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了極其重要的作用。培養(yǎng)大腸桿菌的最適溫度為37 ℃水浴5 min，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞最大轉(zhuǎn)化效率的溫度為4 ℃保存18 h[28]，韓穎等[29]利用熱激法，用大腸桿菌輔助成功構(gòu)建關(guān)鍵酶基因載體。孫彥等[30]成功利用熱激轉(zhuǎn)化構(gòu)建白穎苔草(Carexrigescens)轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)載體。

3.2 電擊轉(zhuǎn)化

電擊轉(zhuǎn)化是通過電擊儀設(shè)定1700 V電壓和藥劑誘導(dǎo)進(jìn)行質(zhì)粒之間的轉(zhuǎn)化，具體操作方法需要特定設(shè)置[31]。電擊轉(zhuǎn)化因其需要特定耗費(fèi)較高的實(shí)驗(yàn)器材，轉(zhuǎn)化時(shí)間較短不易掌握，該方法在植物中的研究甚少，而在昆蟲動(dòng)物等方面研究比較廣泛[32]，其原理為通過高溫脅迫改變酶活性及蛋白的穩(wěn)定，使質(zhì)粒能在輔助菌的作用下表達(dá)和利用。

4 應(yīng)用

近幾十年，熒光蛋白在植物和微生物中的應(yīng)用發(fā)展很快，熒光蛋白作為報(bào)告基因的特殊性，解決了許多研究中的難題。

4.1 熒光蛋白作為報(bào)告基因

熒光蛋白作為報(bào)告基因能直接有效的監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)移的效率，無須底物的參與。程在全等[33]用構(gòu)建的含有編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入到水稻(Oryzasativa)愈傷組織，60 d后取葉片成功分析了綠色熒光蛋白的表達(dá)。Chiu等[34]用突變型GFP(S65T)基因轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)葉肉組織和擬南芥(Arabidopsisthaliana)得到成功。Más等[35]、Jach等[36]用DsRED作為植物報(bào)告基因?qū)煵葸M(jìn)行試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)DsRED對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育無負(fù)面影響，孫金鈺等[8]的研究為YFP在生物學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用提供充足的原料來源。其中，綠色熒光蛋白因其研究較深容易檢測(cè)，在各轉(zhuǎn)化中為常用的報(bào)告基因。

4.2 熒光蛋白作為追蹤標(biāo)記基因

熒光蛋白通常分子量較小，能與多種不同的蛋白質(zhì)端融合且不破壞原始蛋白特性，故熒光蛋白是一種直觀性很強(qiáng)的遺傳標(biāo)記物，能特異地對(duì)植物細(xì)胞器進(jìn)行定位。Kohler等[37]的研究發(fā)現(xiàn)綠色熒光蛋白可以直接觀察到植物發(fā)育過程細(xì)胞的數(shù)目、分配和運(yùn)動(dòng)，GFP還能研究高等植物細(xì)胞器之間的分子交換。還有應(yīng)用較廣泛的綠色熒光蛋白亞細(xì)胞標(biāo)記物，構(gòu)建GFP和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位信號(hào)KDEL(key developed element length)的融合蛋白，結(jié)果觀察到轉(zhuǎn)化內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜質(zhì)皮層的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[38]。

4.3 熒光蛋白在生物防治中的應(yīng)用

目前生物農(nóng)藥的殺蟲效果并沒有準(zhǔn)確的評(píng)估，Chao等[39]通過觀察GFP標(biāo)記AcNPV的熒光表達(dá)，可以準(zhǔn)確地評(píng)估殺蟲劑作用下害蟲個(gè)體變化，為土地資源的最優(yōu)利用有很重要的意義和應(yīng)用價(jià)值。王延松等[40]運(yùn)用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得GFP標(biāo)記菌株，研究病原菌與新疆大棗(Ziziphuszizyphus)的互作，直觀觀察病原菌在寄主體內(nèi)的侵染過程。鄒曉威等[41]通過構(gòu)建玉米絲黑穗菌(Sphacelothecareiliana)熒光標(biāo)記菌株，分析及預(yù)防致病相關(guān)基因。

4.4 熒光蛋白在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用

利用熒光蛋白來標(biāo)記根際微生物及代謝物，可直觀的追蹤和觀察出根際微生物的定殖、分布及其變化規(guī)律，確定根際微生物與植物的相互作用，有利于促進(jìn)優(yōu)良固氮菌、溶磷菌和生防菌的開發(fā)利用和推廣應(yīng)用。利用熒光蛋白檢測(cè)方便，可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的追蹤，在微生物領(lǐng)域是一種比其他檢測(cè)方法更有優(yōu)勢(shì)的定殖方法。殷幼平等[42]利用GFP標(biāo)記枯草芽孢桿菌生防菌株CQBS03在柑橘(Citrusreticulata)葉片上的定殖規(guī)律，研究得出該工程菌株能在柑橘葉片定殖，且接種42 d后仍能檢測(cè)到工程菌，并對(duì)柑橘潰腸菌(Xanthomonascitrisubsp.)有生防作用，與原始菌株并無明顯差異。

5 研究不足及思路

熒光蛋白基礎(chǔ)理論研究不足。熒光蛋白獨(dú)特的發(fā)光特性給研究帶來了新進(jìn)展，同時(shí)也是一種挑戰(zhàn)。采用熒光蛋白標(biāo)記技術(shù)研究受體菌或者定殖時(shí)，首先面臨的一個(gè)挑戰(zhàn)就是對(duì)熒光蛋白基礎(chǔ)理論的深度研究，這樣才能有效合理的利用熒光蛋白的特性。目前，國(guó)外已對(duì)綠色熒光蛋白的研究技術(shù)相對(duì)成熟，在細(xì)胞中能夠精確定位，作為標(biāo)記蛋白保持熒光的同時(shí)不影響目標(biāo)蛋白的活性，在生物體內(nèi)也能高效表達(dá)不影響生物體的功能[3]。但是，不同顏色的熒光蛋白轉(zhuǎn)化條件和熒光特性各異，不同顏色熒光蛋白之間的通用性較差。國(guó)內(nèi)在研究熒光蛋白時(shí)，熒光蛋白基礎(chǔ)理論研究未能趕上應(yīng)用的速度，目前還存在若干問題，除綠色熒光蛋白[43]外的其他顏色還未能熟悉應(yīng)用，進(jìn)而阻礙了雙色標(biāo)記或多色標(biāo)記的后期研究。

熒光蛋白的熒光時(shí)效性短。研究者建議檢測(cè)熒光強(qiáng)度時(shí)不得用過長(zhǎng)的時(shí)間，這就需要增加檢測(cè)的靈敏度。因?yàn)殪`敏度越高，熒光強(qiáng)度越強(qiáng)，檢測(cè)的時(shí)間也就越快速，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的越充分。但是靈敏度則與熒光蛋白的基礎(chǔ)有頗大的關(guān)系，綠色熒光蛋白的光譜較短，靈敏度較好，而其他顏色熒光蛋白靈敏度較差，時(shí)效性較短，熒光強(qiáng)度弱，這些都為熒光蛋白標(biāo)記和轉(zhuǎn)化研究帶來了挑戰(zhàn)。雖然目前尚無直接證據(jù)證明紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白相比綠色熒光蛋白各功能較差，但對(duì)植物標(biāo)記的轉(zhuǎn)化率的影響還是客觀存在的[44]。還有，熒光的個(gè)體數(shù)量龐大不一，只能判斷熒光的有無，而難以對(duì)熒光數(shù)量用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。這些都是影響到熒光蛋白在標(biāo)記研究中的應(yīng)用。

分子生物學(xué)研究的挑戰(zhàn)。盡管分子生物學(xué)技術(shù)近年來在遺傳多樣性研究和功能基因多樣性中發(fā)揮了重要的作用，但國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在熒光蛋白的應(yīng)用[45-46]，而對(duì)熒光蛋白本身的功能多樣性和遺傳動(dòng)態(tài)的研究報(bào)道不是很多[47]。制約因素主要是試驗(yàn)成本高、技術(shù)應(yīng)用存在局限性、操作過程對(duì)試驗(yàn)技術(shù)的要求較高[48]等，使得對(duì)于熒光蛋白的功能多樣性研究的方法很少。其次，分子標(biāo)記技術(shù)的興起，熟練有目的的利用計(jì)算機(jī)軟件和網(wǎng)絡(luò)信息對(duì)數(shù)據(jù)的合理分析處理也將成為一項(xiàng)挑戰(zhàn)。最后，僅依靠分子生物學(xué)技術(shù)還不能全面透徹地解決熒光蛋白的發(fā)光標(biāo)記機(jī)理等[49]問題，應(yīng)與其他方法結(jié)合從而促進(jìn)熒光蛋白研究的發(fā)展。

6 展望

熒光蛋白是研究生物細(xì)胞遺傳等生物現(xiàn)象的標(biāo)記基因。我國(guó)學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識(shí)到熒光蛋白研究的重要性，主要集中在綠色熒光蛋白的報(bào)告基因、生物傳感器、檢測(cè)pH及離子等[50]。這些研究主要集中在已報(bào)道出的熒光蛋白等方面，并沒有研究其新型突變體熒光蛋白的標(biāo)記效果。熒光蛋白檢測(cè)的熒光強(qiáng)度非線性性質(zhì)是否有直接影響；新生熒光蛋白要通過折疊和加工才具有活性形式，過程的可獲得性較低；紫外激發(fā)對(duì)一些熒光蛋白有光漂白和光破壞的不良影響；多數(shù)生物有自發(fā)熒光的現(xiàn)象，是否干擾熒光蛋白的正常檢測(cè)等，都是影響熒光蛋白標(biāo)記成功的關(guān)鍵。當(dāng)前人們對(duì)熒光蛋白結(jié)構(gòu)功能的理解比在過去有了很大的提高，但仍有很多謎團(tuán)和爭(zhēng)議急需解決。在現(xiàn)有知識(shí)的基礎(chǔ)上，可設(shè)計(jì)和改進(jìn)已得到新型突變體熒光蛋白[51]。目前已有一些對(duì)熒光蛋白激發(fā)態(tài)的理論研究，但仍要努力闡明發(fā)射熒光的調(diào)節(jié)機(jī)制。

熒光蛋白研究由于其分子探針和標(biāo)記基因的特性，難于直接肉眼觀察而面臨很多的挑戰(zhàn)。但是隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將分子生物學(xué)和熒光蛋白有效的結(jié)合，已經(jīng)應(yīng)用到眾多植物之中[52]。熒光蛋白標(biāo)記早在20世紀(jì)90年代就被應(yīng)用到低等植物研究中，隨著熒光蛋白的顏色和突變型熒光的增多，國(guó)外已用紅色熒光蛋白和黃色熒光蛋白成功研究其根系的定殖等內(nèi)容。分子生物學(xué)技術(shù)[53-56]的發(fā)展為熒光蛋白的報(bào)告作用提供了新的研究手段，對(duì)于熒光蛋白的研究不僅是理性工程，也要將隨機(jī)誘變和高通量篩選技術(shù)相結(jié)合以達(dá)到熒光蛋白分子有效進(jìn)化的目的?？赏ㄟ^一些新的克隆或者突變來不斷拓寬研究?jī)?nèi)容，對(duì)優(yōu)良突變體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析可以確定引起熒光蛋白性質(zhì)變化的準(zhǔn)確位點(diǎn)。因此，將分子生物學(xué)技術(shù)和熒光蛋白基礎(chǔ)研究相結(jié)合，可以為熒光蛋白標(biāo)記作用研究提供很好的研究思路。

熒光蛋白作為當(dāng)代生物科技研究中最重要的工具之一[57]，可時(shí)空監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)的基因表達(dá)、蛋白質(zhì)定位、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等生物現(xiàn)象，用于檢測(cè)熒光的熒光顯微鏡也在不斷進(jìn)化硬件和軟件的功能[58]，研究學(xué)者利用熒光顯微鏡清晰觀察釀酒酵母(saccharomyce) GFP和RFP標(biāo)記定位的目標(biāo)蛋白[9]。近年來，熒光蛋白工程和熒光基因工程的迅速發(fā)展，使其隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù)的日益成熟，產(chǎn)生更大的應(yīng)用價(jià)值。但是，熒光蛋白是受轉(zhuǎn)化條件的制約，還是受自身?xiàng)l件資源限制，并無系統(tǒng)研究。若能深入了解熒光蛋白發(fā)光機(jī)理，標(biāo)記條件與自身資源的關(guān)系、熒光蛋白的廣用性、不同熒光蛋白的適用結(jié)構(gòu)，就能相應(yīng)的采取適用顏色的熒光有針對(duì)性地進(jìn)行定位研究，對(duì)指導(dǎo)熒光蛋白的精準(zhǔn)定位具有重要意義。