陳善真，曹仁祺，楊 潔，劉博奇，王貴平

（1.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院，廣東省現(xiàn)代化養(yǎng)豬技術(shù)研究與應(yīng)用企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 511400；2.陽(yáng)西縣豐沃生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司，廣東 陽(yáng)江 529800）

偽狂犬?。≒seudorabies,PR）是由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus,PRV）引起豬、牛等多種動(dòng)物感染的傳染病，豬是該病毒唯一的自然貯存宿主。偽狂犬病病毒在成年豬多為隱性感染[1]，感染種豬和所生仔豬長(zhǎng)期帶毒，成為本病長(zhǎng)期流行且很難根除的重要原因[2]。臨床常用gE-ELISA抗體檢測(cè)試劑盒配合gE缺失苗的應(yīng)用來(lái)評(píng)估豬群的偽狂犬病流行情況，本文旨在通過(guò)連續(xù)幾年的PRV野毒抗體的監(jiān)測(cè)來(lái)反映豬場(chǎng)PRV感染的情況，從而體現(xiàn)抗體監(jiān)測(cè)是豬群免疫防控的重要手段之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 血清樣本 2014—2017年4年期間在廣東某規(guī)?；i場(chǎng)共采集送檢血清樣品1 262份，其中PRV gE野毒抗體檢測(cè)數(shù)量2014年152份（PRV檢測(cè)152份）、2015年475份（PRV檢測(cè)183份）、2016年419份（PRV檢測(cè)119份）、2017年216份（PRV檢測(cè)140份）。樣本采集按照隨機(jī)抽樣的方式進(jìn)行，采樣比例為5%～8%。

1.1.2 檢測(cè)用試劑盒及儀器 豬偽狂犬病病毒gE抗體檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京愛(ài)德士元亨生物科技有限公司，ELx405洗板機(jī)、ELx808酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血清的采集與制備 用5 mL一次性無(wú)菌注射器于前腔靜脈采血2～3 mL，室溫靜置2 h后，4℃過(guò)夜，分離血清，然后使用疫苗保溫箱加冰運(yùn)輸，送至廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 血清抗體ELISA檢測(cè)與結(jié)果判定 采用IDEXX公司的偽狂犬病gE抗體檢測(cè)試劑盒，所用試劑盒均在有效期內(nèi)使用，操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)均按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。PRV gE抗體陰陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)：S/N＞0.70為陰性，0.60＜S/N≤0.70為可疑，S/N≤0.60判定為陽(yáng)性。每次檢測(cè)陰陽(yáng)性對(duì)照均設(shè)兩個(gè)平行孔。

2 結(jié)果

2.1 ELISA抗體水平檢測(cè)結(jié)果

采用IDEXX ELISA試劑盒對(duì)該豬場(chǎng)2014—2017年間共計(jì)1 262份血清樣品進(jìn)行檢測(cè)，合計(jì)檢測(cè)項(xiàng)目1 929項(xiàng)，每年豬瘟病毒（CSFV）、藍(lán)耳病病毒（PRRSV）及偽狂犬病野毒抗體的檢測(cè)數(shù)量統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)抗體檢測(cè)的數(shù)量基本呈逐年增加的趨勢(shì)（2017年含有其它檢測(cè)項(xiàng)目未統(tǒng)計(jì)在列），說(shuō)明豬場(chǎng)通過(guò)抗體檢測(cè)來(lái)評(píng)估豬場(chǎng)免疫狀況或感染風(fēng)險(xiǎn)的防控意識(shí)逐漸增強(qiáng)。

根據(jù)2014—2017年間偽狂犬病野毒抗體的檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)情況分析偽狂犬病野毒的流行情況，抗體陽(yáng)性率統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。豬偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性率分別為6.58%、7.25%、51.26%和68.34%。

表1 2014—2017年血清樣品中偽狂犬病野毒抗體檢測(cè)數(shù)量統(tǒng)計(jì) 份

表2 偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性率檢測(cè)結(jié)果

偽狂犬病野毒的抗體陽(yáng)性率呈逐年增加的趨勢(shì)（圖1），且從2016年偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性率激增到51.26%，到2017年增加至68.34%，與2014年相比抗體陽(yáng)性率增加了近10倍。

圖1 廣東某豬場(chǎng)偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性率變化趨勢(shì)

2.2 抗體水平檢測(cè)結(jié)果分析

該豬場(chǎng)從2014年開(kāi)始即檢出偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性，陽(yáng)性率僅為6.58%，說(shuō)明該豬場(chǎng)存在偽狂犬病野毒感染的情況，2015年偽狂犬病野毒抗體的陽(yáng)性率7.25%較2014年變化不大，但2016年開(kāi)始偽狂犬病野毒抗體的陽(yáng)性率急劇增加，2017年高達(dá)68.34%。這一趨勢(shì)從檢測(cè)S/N值平均值的變化趨勢(shì)中也可明顯看出（圖2）。

圖2 各年度偽狂犬病野毒抗體陽(yáng)性率和S/N平均值

3 討論

從2011年偽狂犬病的集中暴發(fā)以來(lái)，近幾年全國(guó)各地陸續(xù)分離到偽狂犬病野毒株，且測(cè)序結(jié)果表明毒株及抗原性均存在變異，毒株變異及毒力返強(qiáng)等情況的出現(xiàn)是偽狂犬病野毒陽(yáng)性率持續(xù)上升的重要原因[3-4]。該豬場(chǎng)檢測(cè)的偽狂犬病野毒陽(yáng)性率的變化趨勢(shì)與近幾年文獻(xiàn)報(bào)道中的各地偽狂犬病流行趨勢(shì)一致[5]。

據(jù)了解，該豬場(chǎng)于2014年、2015年和2016年均有引種記錄，且自2010年開(kāi)始一直免疫豬偽狂犬病疫苗（HB98株），2015年3月至2016年7月母豬和仔豬全部開(kāi)始使用偽狂犬病滅活苗（鄂A株），2016年8月使用海博萊偽狂犬病滅活苗（Barthak61株）免疫基礎(chǔ)群4次，兩次免疫間隔3個(gè)月。2017年5月至2018年2月母豬和仔豬全部使用偽狂犬病新毒株（HB2000）。頻繁更換免疫毒株仍未能有效降低偽狂犬病野毒抗體的陽(yáng)性率，說(shuō)明該豬場(chǎng)的偽狂犬病野毒感染情況較為嚴(yán)重，且不受當(dāng)前免疫疫苗的保護(hù)，從而說(shuō)明gE缺失疫苗不能針對(duì)新的流行毒株提供完全的臨床保護(hù)。

吳勝生2016年的研究報(bào)道[6]顯示，不同廠家、不同疫苗毒株、不同免疫劑量的偽狂犬病疫苗免疫后產(chǎn)生的免疫效果差異不顯著，結(jié)合本豬場(chǎng)持續(xù)升高的PRV野毒抗體這也說(shuō)明豬場(chǎng)存在偽狂犬病野毒株流行的情況。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)室在廣東某豬場(chǎng)送檢的臨床病料中分離出了PRV野毒GD-1406株，分離的PRV對(duì)試驗(yàn)組仔豬的多種組織器官造成肉眼可見(jiàn)的損傷，死亡率達(dá)80%，證明該毒株為強(qiáng)毒株[7]，這也充分解釋了豬場(chǎng)偽狂犬病野毒抗體持續(xù)升高的原因。

2016年豬場(chǎng)偽狂犬病野毒抗體的平均陽(yáng)性率為51.26%，2016年1月份檢測(cè)有70%的基礎(chǔ)母豬偽狂犬病野毒陽(yáng)性，而8月份檢測(cè)后備母豬群的偽狂犬病陽(yáng)性檢出率為12.5%（數(shù)據(jù)未列出），意味著可以在偽狂犬病母豬陽(yáng)性場(chǎng)獲得偽狂犬病陰性的后備母豬，這對(duì)豬群偽狂犬病的凈化具有啟示意義，所以對(duì)種豬群尤其是后備豬群進(jìn)行血清學(xué)監(jiān)測(cè)時(shí)清除帶毒種豬，或引入野毒陰性的后備公母豬，是凈化豬群至關(guān)重要的措施。隨著新毒株的分離相應(yīng)疫苗的研發(fā)也將是控制偽狂犬病的重要手段。