易 程，鄧 莉，唐青海，陽 坤，滕 威，謝 璇，楊 海，王芳宇，何麗芳

（衡陽師范學(xué)院生命科學(xué)與環(huán)境學(xué)院，衡陽師范學(xué)院畜禽養(yǎng)殖生物工程技術(shù)研究所，衡陽師范學(xué)院生物藥物研究所，湖南衡陽 421008）

犬腺病毒（Canine adenovirus，CAV）是已發(fā)現(xiàn)的哺乳動物腺病毒中致病性最強、感染范圍最廣的病毒[1]，1925年首次被發(fā)現(xiàn)，1984年在我國被首次分離到[2]。CAV分為CAV-I和CAV-Ⅱ 2個血清型[3]，其中CAV-Ⅱ可引起犬呼吸道癥狀，CAV-I可引發(fā)犬肝炎和角膜渾濁，主要表現(xiàn)為肝實質(zhì)細(xì)胞和皮質(zhì)細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)包涵體以及長時間出血、肝小葉壞死，還可使狐貍發(fā)生腦炎[4]。Walker等[5]和Pizzurro等[6]相繼報道在紅狐和狼體內(nèi)檢出了CAV-I。2018年7月，衡陽市某寵物醫(yī)院發(fā)現(xiàn)一例疑似犬傳染性肝炎病犬，采集排泄物進行了病毒分離及分子生物學(xué)和血清學(xué)鑒定。本試驗充實了CAV-I的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，分離得到的病毒為后續(xù)研究提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

犬腎細(xì)胞（Madin-darby canine kidney cells，MDCK）：衡陽師范學(xué)院畜禽養(yǎng)殖生物工程技術(shù)研究所培養(yǎng)保存；Premix Ex Taq酶、血液/細(xì)胞/組織DNA提取試劑盒：購自天根生化科技（北京）有限公司；DMEM培養(yǎng)基：購自美國Invitrogen有限公司；辣根過氧化物酶-葡萄球菌A蛋白標(biāo)記物（HRP-SPA）：購自美國Zymed公司；3-氨基- 9-乙基咪唑9（AEC）：購自美國Sigma-Aldrich有限公司；CAV-I型單克隆抗體：購自長春西諾生物科技有限公司；引物：由深圳華大基因科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料采集與處理 收集發(fā)病幼犬的新鮮糞便，研磨后與無菌PBS（1:5）充分混勻；取少量樣品加入離心管中，反復(fù)凍融3次，5 000 r/min離心8 min；取上清液，用0.22 μm濾膜過濾；在濾液中加入青霉素和鏈霉素至1 000 U/mL，于-40 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DNA提取與PCR檢測 取1.2.1中濾液 200 μL，用血液 /細(xì)胞 /組織 DNA 提取試劑盒提取DNA樣本。參考GenBank中的CAV-I全基因組序列（登錄號AC_000003）和C AV-II全基因組序列（登錄號AC_000020）的保守區(qū)設(shè)計1對特異性引物[CAV-E3-F：5′-CGCGCTGAACATTACTACCTTGTC-3′；CAVE3-R：5′-CCTAGA GCACTTCGTGTCCGC-3′，由華大基因（深圳）總部合成]進行PCR檢測。預(yù)期 CAV-I的PCR產(chǎn)物為509 bp，CAV-II為1 031 bp。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 3 μL，上、下 游 引 物（10 μmol/L） 各 1 μL，Taq 12 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃ 15 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 60 s，40個循環(huán)；72 ℃ 8 min，4 ℃保存。同時設(shè)立健康MDCK細(xì)胞提取的DNA為陰性對照，以本實驗室保存的CAV-I感染的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物DNA為陽性對照。取5 μL PCR反應(yīng)產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 MDCK細(xì)胞培養(yǎng) 在生物安全柜殺菌后進行無菌操作，倒掉培養(yǎng)瓶內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS洗滌5次，加入0.25%的胰蛋白酶液2 mL，置于37 ℃ 5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中進行消化和傳代培養(yǎng)。

1.2.4 病毒分離培養(yǎng)與血清學(xué)鑒定 將1.2.1已處理好的病料無菌環(huán)境下接種MDCK細(xì)胞，然后置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中吸附 1.5 h，每隔10 min輕搖1次；1.5 h過后棄去液體，補加細(xì)胞維持液[含2%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）]，于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，同時設(shè)立正常MDCK細(xì)胞對照。每隔6 h觀察細(xì)胞病變（Cytopathic effect，CPE），當(dāng)80%以上細(xì)胞出現(xiàn)CPE時，停止培養(yǎng)，反復(fù)凍融3次，收獲病毒；按照上述方法將病毒繼續(xù)連續(xù)傳代培養(yǎng)。根據(jù)文獻(xiàn)[5-6]改進后的免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法（IPMA）進行血清學(xué)鑒定。取匯合度為80%的MDCK細(xì)胞，接種第3代病毒，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基；每皿細(xì)胞用2 mL PBS清洗3次，真空干燥，然后加入2 mL 33%丙酮-PBS，室溫固定40 min，真空干燥，再加入CAV-I單克隆抗體2 mL（1:1 000倍稀釋），37 ℃孵育1.5 h；用PBS洗滌3次后，加入酶標(biāo)二抗（HRP-SPA，1:5 000倍稀釋）2 mL，37 ℃孵育1 h；用PBS洗滌3次，加入2 mL AEC底物顯色液，37 ℃孵育20 min；棄掉反應(yīng)液，用蒸餾水沖洗2次，顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.5 不同代次CAV的PCR檢測與序列測定取1.2.4中傳代培養(yǎng)的第1代、第3代、第5代、第7代和第9代病毒進行PCR檢測。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 3 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Taq 12 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應(yīng)程序為：98 ℃預(yù)變性 1 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，72 ℃60 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。同時設(shè)立健康MDCK細(xì)胞提取的DNA為陰性對照，以本實驗室保存的CAV-I型感染的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)物DNA為陽性對照。取5 μL PCR產(chǎn)物，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將第9代的PCR擴增產(chǎn)物純化，然后克隆至pMD18T載體中，轉(zhuǎn)化Top10感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送華大基因（深圳）總部進行序列測定，利用DNAStar軟件進行序列分析。

1.2.6 CAV在細(xì)胞中的增殖動態(tài)IPMA檢測將細(xì)胞以適當(dāng)密度接種到6個35 mm培養(yǎng)皿中，當(dāng)密度達(dá)到80%的匯合度時，將分離到的第5代病毒按每皿5 μL的劑量單層接種到培養(yǎng)皿中，留出其中1皿作為未接種病毒對照，充分搖勻，在37 ℃ 5% CO2條件下吸附1 h；補充培養(yǎng)基至2 mL/皿，于37 ℃ 5% CO2中培養(yǎng)，分別在病毒接種后的4、6、8、12、24 h取樣，進行IPMA檢測，方法與1.2.5相同。

2 結(jié)果

2.1 病料PCR檢測

對病料處理液進行PCR檢測。結(jié)果顯示，樣品ZY180711和陽性對照組在約500 bp處有特異性條帶，在1 000 bp 處無特異性條帶，表明擴增片段與預(yù)期的CAV-I PCR產(chǎn)物（509 bp）大小相符，陰性對照僅有一定的引物二聚體，無特異性條帶（圖1）。

2.2 病毒分離培養(yǎng)與血清學(xué)鑒定

圖1 樣品的CAV核酸PCR檢測

將已處理好的病料樣品按同步接毒的方式，接種MDCK細(xì)胞進行傳代。將第3代培養(yǎng)物接種80%匯合度的MDCK細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，設(shè)立未接種病毒的對照細(xì)胞。IPMA法鑒定結(jié)果顯示：未接毒細(xì)胞生長正常（圖2-A），接種病毒的細(xì)胞經(jīng)IPMA染色后細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)紫紅色，細(xì)胞腫脹變圓，細(xì)胞間隙變小、聚集，出現(xiàn)典型的“葡萄串樣”特征性病變，且無污染（圖2-B）。連續(xù)傳代培養(yǎng)均表現(xiàn)出良好的細(xì)胞病變（CPE）。

2.3 不同代次CAV的PCR檢測與基因序列分析

將分離的CAV連續(xù)多次傳代培養(yǎng)，分別選取第1代、第3代、第5代、第7代和第9代進行CAV核酸PCR檢測，結(jié)果均為CAV-I核酸強陽性（圖3），陰陽性對照成立，說明培養(yǎng)物中CAV繁殖特性良好。

將第9代病毒PCR擴增產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體，經(jīng)HindⅢ和EcoRI雙酶切，發(fā)現(xiàn)在大于2 000 bp處有載體條帶，在500 bp處有相應(yīng)的目的片段（圖4），將重組載體命名為pMD18-TCAV-I；序列測定后，經(jīng)DNAstar軟件分析，發(fā)現(xiàn)擴增片段大小為509 bp，與GenBank中的CAV-I核苷酸相似性為99.0%～99.2%，與CAV-Ⅱ核苷酸相似性僅為65.3%（圖5）。進化分析顯示，CAVZY180711與GenBank中的CAV-I處在同一個大的分支，而CAV-Ⅱ位于另外一個分支（圖6）。

圖2 CAV-ZY180711毒株的分離培養(yǎng)

圖3 樣品ZY180711中CAV繁殖不同代次的PCR檢測

2.4 CAV在細(xì)胞中的增殖動態(tài)IPMA檢測

圖4 重組載體pMD18-T-CAV-I的雙酶切鑒定結(jié)果

圖5 CAV-ZY180711與其他毒株相似分析結(jié)果

圖6 CAV-ZY180711的基因進化樹

經(jīng)IPMA鑒定發(fā)現(xiàn)，感染4～8 h后細(xì)胞中未見明顯的陽性細(xì)胞，12 h后看到大量的紫紅色染色范圍集中在細(xì)胞核，隨著時間延長，感染范圍越來越大，染色區(qū)域越來越廣，細(xì)胞染色數(shù)量達(dá)到80%以上，24 h后可觀察到發(fā)生病變的細(xì)胞經(jīng)著色聚集形成典型的“葡萄串樣”，而未接毒的MDCK細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后生長狀態(tài)良好，無任何著色（圖7）。

3 分析與討論

圖7 IPMA檢測CAV-ZY180711在MDCK細(xì)胞中的增殖（×100）

CAV兩種血清型之間發(fā)生重組可使疫苗免疫效果變差[7]。本試驗應(yīng)用病毒分離培養(yǎng)、PCR檢測和IPMA等方法，分離到1株CAV-I，將其命名為CAV-ZY180711。

通過PCR檢測，在病料樣品中檢出CAV-I核酸。病料接種MDCK細(xì)胞后出現(xiàn)典型的CAV病變——細(xì)胞腫脹變圓、聚集，呈“葡萄串樣”。這與其他研究者報道的特征一致[8-10]，但出現(xiàn)CPE的時間各有差異。本試驗分離的毒株在接種24 h后即出現(xiàn)顯著的CPE，這可能與接種病毒的初始含量及病毒對MDCK細(xì)胞的嗜性有關(guān)[11]。不同繁殖代次的CAV PCR檢測結(jié)果顯示，第9代病毒為強陽性，說明病毒傳代培養(yǎng)后繁殖特性穩(wěn)定。對第9代病毒的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序，發(fā)現(xiàn)擴增片段與預(yù)期擴增片段大小一致。本試驗設(shè)計的引物能夠通過擴增片段的大小，直觀區(qū)分CAV-I（509 bp）和CAV-II（1 031 bp），因而增強了診斷的針對性。核酸序列遺傳分析顯示，所分離毒株核苷酸與CAV-I核苷酸相似性在99%以上，而與CAV-Ⅱ僅在65%左右；遺傳進化樹圖顯示，本次分離毒株與CAV-I毒株處在同一個大的分支。這些數(shù)據(jù)均表明該病毒為CAV-I。

為研究CAV-ZY180711毒株的體外感染增殖特性，采用免疫過氧化物酶單層細(xì)胞染色法（IPMA）檢測了病毒在MDCK細(xì)胞中生長的早期增殖動態(tài)。試驗選取第5代培養(yǎng)物作為樣本，發(fā)現(xiàn)病毒接種4～8 h后的細(xì)胞中未見明顯著色，表明此段時間內(nèi)病毒處于潛伏期；感染12 h后，觀察到大量細(xì)胞的細(xì)胞核被特異性染色，表明感染后8～12 h病毒復(fù)制進入高度活躍期，細(xì)胞質(zhì)中翻譯表達(dá)的病毒抗原大量進入細(xì)胞核，進行病毒粒子組裝、繁殖；感染后24 h可明顯看到細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)均呈現(xiàn)紫紅色，并且聚集成典型的“葡萄串樣”病變，說明此時病毒粒子已經(jīng)從細(xì)胞核釋放到細(xì)胞質(zhì)中，這與遇秀嶺等[12]運用電鏡觀察的結(jié)果基本一致。本研究采用IPMA法進行細(xì)胞內(nèi)病毒增殖動態(tài)檢測，可以看出病毒感染后12 h，細(xì)胞核被染成紫紅色，染色部位特征明顯，最容易辨認(rèn)。這一感染時間點的確定為該病毒的血清學(xué)鑒定提供了最佳接毒方法和繁殖時間。

綜上所述，本試驗成功分離鑒定了1株I型CAV，既充實了CAV的流行病學(xué)數(shù)據(jù)，也為后續(xù)的病原學(xué)研究提供了基礎(chǔ)材料。