煙草野火病菌噬菌體的分離及盆栽防治試驗(yàn)

孫宏偉，李 慧，劉瑞清，張 民，荊瑞勇，劉俊杰，孫劍萍*

1.中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所，哈爾濱市道里區(qū)哈藥路17號(hào) 150076

2.牡丹江煙葉公司，黑龍江省牡丹江市西地明街63號(hào) 157011

3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江省大慶市高新區(qū)新風(fēng)路5號(hào) 163319

4.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱市南崗區(qū)哈平路138號(hào) 150081

煙草野火病是由煙草假單胞桿菌屬的丁香假單胞煙草致病變種（Pseudomonas syringae pv.tabaci）引起的葉部病害，在世界主要煙草產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。目前，該病已成為黑龍江省、吉林省煙草產(chǎn)區(qū)的主要病害［1］。煙草野火病的防治主要以化學(xué)防治為主，但由于農(nóng)藥的大量使用，不僅使病原菌的抗藥性增強(qiáng)，還使煙葉中的農(nóng)藥殘留量增加，嚴(yán)重影響煙葉和生態(tài)的可持續(xù)發(fā)展。因此，煙草野火病的生物防治尤為重要。目前，我國對(duì)煙草野火病生物防治的研究主要集中在拮抗生防菌的篩選、田間防效試驗(yàn)、防治機(jī)理等方面。孫宏偉等［2］從健康煙葉上分離到287個(gè)細(xì)菌，篩選出14個(gè)對(duì)野火病菌有抑制作用的菌株，其中抑菌效果最好的是枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis。劉宇帥等［3］通過室內(nèi)平板拮抗作用實(shí)驗(yàn)篩選到1株對(duì)煙草野火病菌具有拮抗作用的生防菌株CZS。萬秀清等［4］通過田間防效試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)熒光假單胞桿菌PF7-5活菌對(duì)野火病的抑菌效果達(dá)到91%。雖然拮抗菌類的生物防治試劑已經(jīng)商品化，但大量使用會(huì)導(dǎo)致微生物群落失衡等問題。噬菌體特異性強(qiáng)，只感染目標(biāo)菌群，不破壞土壤微生物的平衡，不對(duì)環(huán)境造成污染［5］。目前，用噬菌體防治煙草細(xì)菌性病害的研究較少，且多集中在青枯病的防治方面。為此，分離純化了對(duì)煙草野火病菌有裂解效果的噬菌體，并考察其對(duì)野火病的防治效果，旨在為用噬菌體防治煙草野火病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試煙草品種為感病品種龍江911。2016年6月，在黑龍江省穆棱縣和肇東縣煙田采集感染煙草野火病的煙葉和土壤樣品。采用5點(diǎn)取樣法收集土壤樣品，每點(diǎn)取表層土壤500 g，將每塊煙田5個(gè)取樣點(diǎn)的5份樣品充分混合后備用。

1.2 方法

1.2.1 野火病菌的分離純化與鑒定

無菌條件下，取病健交界處的煙葉組織（直徑0.5 cm）。用70%乙醇對(duì)煙葉組織表面進(jìn)行消毒（30～60 s），無菌水漂洗3～4次，置于NA固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)至煙葉組織周圍長出細(xì)菌。用接菌環(huán)蘸取細(xì)菌菌液在NA固體培養(yǎng)基上劃線，培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落后，用牙簽挑取典型野火病菌的單菌落置于1.0 mL的NA液體培養(yǎng)基中，搖床過夜振蕩培養(yǎng)（28℃，150 r/min）后，加 0.5 mL甘油，-80℃保存。將保存的菌液送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行病原菌的種類鑒定，并參照孫劍萍等［6］對(duì)黑龍江省煙草野火病菌生理小種的鑒定方法，對(duì)分離的煙草野火病菌進(jìn)行生理小種鑒定。

野火病菌的活化：將保存的野火病菌在NA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL NA液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，備用。

NA液體培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，氯化鈉1.5 g，去離子水1 L，于121℃高壓滅菌20 min。NA固體培養(yǎng)基：NA液體培養(yǎng)基中加入1.8%瓊脂粉后高壓滅菌。

1.2.2 噬菌體的分離

參照 Nakayama等［7］和蘇靖芳等［8］的方法分離噬菌體。將5 g土樣置于加有10 mL NA液體培養(yǎng)基的50 mL離心管中混勻，28℃振蕩過夜。取出靜置24 h后，10 000 r/min離心10 min，上清液過0.22 μm濾膜，4 ℃保存。

將過濾后的1 mL土壤懸浮液與0.2 mL活化的野火病菌菌液混合于5 mL NA液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，當(dāng)共培養(yǎng)液澄清后靜置1 h，10 000 r/min，離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，即得到噬菌體粗提液。

1.2.3 噬菌體的純化

用SM緩沖液作為稀釋液，對(duì)0.1 mL噬菌體粗提液進(jìn)行1至10倍的稀釋。取1 mL不同稀釋倍數(shù)的噬菌體稀釋液與0.2 mL活化的野火病菌菌液混合，靜置孵育15 min后，加入6 mL冷卻至47℃左右的NA半固體培養(yǎng)基中，混勻后立即倒入已凝固的NA固體培養(yǎng)基平板上制成雙層平板，待上層培養(yǎng)基凝固后倒置放入28℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24～48 h，觀察噬菌斑的生成［9-11］。當(dāng)出現(xiàn)噬菌斑后，選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)的雙層平板挑取肉眼可辨、邊緣光滑的單個(gè)噬菌斑接入5 mL生長至對(duì)數(shù)期的野火病菌菌液中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，10 000 r/min離心10 min。上清液過0.22 μm的微孔濾膜，取0.1 mL濾液進(jìn)行1至10倍稀釋，將各稀釋倍數(shù)的濾液與0.2 mL生長至對(duì)數(shù)期的野火病菌菌液混勻后制作雙層平板。28℃培養(yǎng)24～48 h，當(dāng)出現(xiàn)噬菌斑后，選擇適當(dāng)稀釋倍數(shù)的雙層平板挑取肉眼可辨、邊緣光滑的單個(gè)噬菌斑，重復(fù)3～5次即得到純化的野火病菌噬菌體［10］，4℃保存。

SM緩沖液（噬菌體保護(hù)液）：取NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，1 mol/L Tris鹽酸（pH 7.5）50 mL，2%明膠5 mL，加去離子水溶解，定容至1 L，于121℃滅菌30 min，4℃保存。

1.2.4 野火病菌懸液的制備

將保存的野火病菌在NA固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，挑取單菌落接種于5 mL NA液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)后的野火病菌菌液按照1∶40的比例加入裝有NA液體培養(yǎng)基的三角瓶中，28℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)至野火病菌對(duì)數(shù)生長期，即為野火病菌菌懸液，稀釋10倍后用于接種。

1.2.5 噬菌體懸液的制備

挑取保存的噬菌體放入裝有1 mL SM懸浮液的離心管中，4℃靜置12 h后，12 000 r/min、4℃離心 10 min，取 500 μL 離心后的上清液與 500 μL對(duì)數(shù)生長期的野火病菌菌液混合于5 mL NA液體培養(yǎng)基中，28℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)2～3 d，直至混合液澄清。將澄清的混合液12 000 r/min、4℃離心10 min。上清液經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾后，按1∶40的比例轉(zhuǎn)接至對(duì)數(shù)生長期的野火病菌菌懸液中，待菌液澄清后即獲得含有大量噬菌體的裂解液，按照每500 mL加入1～2滴氯仿的比例加入氯仿殺死未被裂解的細(xì)菌細(xì)胞，4℃保存。

1.2.6 接種方法及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將6～8片真葉大小的煙苗移栽到花盆（直徑25 cm）中，置于具有遮陰網(wǎng)的大棚中培養(yǎng)至團(tuán)棵期，進(jìn)行防效試驗(yàn)。試驗(yàn)處理及編號(hào)見表1。針刺接種：用滅菌大頭針刺破煙葉，每株針刺2片煙葉，每片煙葉刺10個(gè)針孔。用常規(guī)農(nóng)用噴霧器對(duì)針刺后的煙株進(jìn)行噴施，保濕24 h，每個(gè)處理5株煙草，4次重復(fù)。噴霧接種：用常規(guī)農(nóng)用噴霧器噴施團(tuán)棵期的煙株，保濕24 h，每個(gè)處理10株煙草，4次重復(fù)。

1.2.7 病情調(diào)查及統(tǒng)計(jì)分析

針刺接種、噴霧接種分別處理15、20 d后，出現(xiàn)典型的野火病癥狀（病斑中心褐色或白色壞死，病斑周圍有明顯的黃綠色暈圈）開始進(jìn)行調(diào)查。針刺接種調(diào)查病斑直徑，噴霧接種調(diào)查病情指數(shù)。以黃綠色暈圈的大小來確定病斑直徑或病斑面積，計(jì)算防效。參照標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008［12］對(duì)病葉進(jìn)行分級(jí)。

表1 盆栽試驗(yàn)的處理及編號(hào)Tab.1 Treatments and number of pot experiments

病情指數(shù)=［Σ（各級(jí)發(fā)病葉片數(shù)×該病級(jí)值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×9）］×100

防效=［（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)］×100%

圖1 野火病菌噬菌體T-109和T-ZD的噬菌斑Fig.1 Plaques of bacteriophages T-109 and T-ZD from P.syringae pv.tabaci

2 結(jié)果與分析

2.1 野火病菌及其噬菌體的分離與鑒定

經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司鑒定后，得到兩株煙草野火病菌菌株。將從穆棱縣、肇東縣煙葉上分離的野火病菌分別命名為109和ZD。經(jīng)生理小種鑒定，109和ZD分別屬于Ⅱ型和Ⅲ型生理小種。將從宿主野火病菌109和ZD中分離的噬菌體分別命名為T-109和T-ZD。經(jīng)4次純化后，噬菌體T-109和T-ZD在雙層平板上均形成圓形、清晰透明、邊緣光滑的噬菌斑（圖1）。

2.2 盆栽針刺接種的防治效果

由表2和圖2可知，A1處理的防效最好，為98.64%；防效最差的是B2處理，為29.41%。只噴施噬菌體原液（C1處理）不會(huì)引起野火病的發(fā)生。先噴施噬菌體后接種的處理（A1和B1）對(duì)野火病菌109的防效好于先接種后噴施噬菌體的處理（A2和B2），且差異顯著。A1處理對(duì)野火病菌109的防效好于B1處理，但兩者之間無顯著差異。A2和B2處理之間具有差異顯著性，說明在野火病菌侵染煙葉之前，需要足夠多的噬菌體來充分裂解野火病菌。

表2 噬菌體對(duì)野火病菌109的針刺接種防治效果①Tab.2 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci 109 by needle puncturing inoculation

圖2 噬菌體對(duì)野火病菌109針刺接種試驗(yàn)中的煙葉表型Fig.2 Phenotypes of tobacco leaves in control experiments of bacteriophages against P.syringae pv.tabaci 109 by needle puncturing inoculation

由表3和圖3可知，D1處理的防效最好，為96.68%；防效最差的是E2處理，為5.42%。只施用噬菌體原液（F1處理）不會(huì)引起野火病的發(fā)生。先噴施噬菌體后接種處理（D1和E1）對(duì)野火病菌ZD的防效好于先接種后噴施噬菌體處理（D2和E2），且差異顯著。D1處理對(duì)野火病菌ZD的防效好于E1處理，但二者之間無顯著差異。

針刺接種防效試驗(yàn)中，先噴施噬菌體后接種處理的防效高于先接種后噴施噬菌體處理，且達(dá)到顯著差異?？赡苡捎诮臃N2 h后，野火病菌已經(jīng)形成侵染，即使再噴施噬菌體也很難裂解侵染后的野火病菌。由表2和表3可知，A2和D2處理、B2和E2處理的防效差異較大，可能與野火病菌109和ZD侵染煙草品種龍江911的潛伏期不同有關(guān)。

表3 噬菌體對(duì)野火病菌ZD的針刺接種防治效果Tab.3 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci ZD by needle puncturing inoculation

圖3 噬菌體對(duì)野火病菌ZD針刺接種試驗(yàn)中的煙葉表型Fig.3 Phenotypes of tobacco leaves in control experiments of bacteriophages against P.syringae pv.tabaci ZD by needle puncturing inoculation

2.3 盆栽噴霧接種的防治效果

由表4可知，b2處理的防效最好，為28.23%；防效最差的是b1處理，為-2.69%。只噴施噬菌體原液（c1處理）可引起野火病的發(fā)生，但病情較輕微。先噴施噬菌體后接種的處理（a1和b1）和先接種后噴施噬菌體的處理（a2和b2）對(duì)野火病菌109的防效沒有顯著性差異。

由表5可知，e1處理的防效最好，為56.05%；防效最差的是e2處理，為23.79%。只施用噬菌體原液（f1處理）可引起野火病的發(fā)生，但病情較輕微。先噴施噬菌體后接種的處理（d1和e1）和先接種后噴施噬菌體的處理（d2和e2）對(duì)野火病菌ZD的防效無顯著差異。噬菌體對(duì)野火病菌109和ZD的盆栽噴霧接種防效與針刺接種防效有較大差別，可能與環(huán)境因素對(duì)噬菌體的存活影響較大有關(guān)。

表4 噬菌體對(duì)野火病菌109的噴霧接種防治效果Tab.4 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci 109 by spraying inoculation

表5 噬菌體對(duì)野火病菌ZD的噴霧接種防治效果Tab.5 Control effects of bacteriophages on P.syringae pv.tabaci ZD by spraying inoculation

3 結(jié)論

①以煙草野火病菌109和ZD為宿主，分離到噬菌體T-109和T-ZD。②針刺接種試驗(yàn)中，先噴施噬菌體后接種處理的防效優(yōu)于先接種后噴施噬菌體處理，且差異顯著。噬菌體裂解原液的防效優(yōu)于10-1倍噬菌體裂解原液的防效。③噴霧接種試驗(yàn)中，無論是先噴施噬菌體后接種處理還是先接種后噴施噬菌體處理，其防效均無顯著性差異。噬菌體裂解原液的防效和10-1倍噬菌體裂解原液的防效無顯著差異。