王海芳，何 銳，成 雅，袁瑞華，董 靜，劉勤社△

(1.陜西省及咸陽市中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 西安 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)真實(shí)世界臨床研究院，陜西 西安 712046；3.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 712000)

應(yīng)用抗血小板藥物預(yù)防和抑制血栓形成是血栓栓塞性心腦血管病和血管支架置入圍手術(shù)期的重要治療措施[1]。然而目前所有的抗血小板治療多伴有出血風(fēng)險(xiǎn)增加，隨著用藥時(shí)間的延長及抗栓藥物聯(lián)用，出現(xiàn)藥物抵抗、消化道損傷等不良反應(yīng)的幾率也大大增加[2]。因此，深入研究血小板功能的調(diào)控機(jī)制，尋找新的安全有效的抗血小板藥物，成為當(dāng)今心腦血管疾病防治領(lǐng)域的國際性關(guān)注點(diǎn)[3]。國外學(xué)者從血小板結(jié)構(gòu)和功能調(diào)控的角度進(jìn)行了深入的研究，我國眾多學(xué)者則從中藥入手開展研究尋找抗血小板活性成分，均取得了一定的成果。本文將從血小板膜表面黏附受體及其表達(dá)的調(diào)控，以及中藥活性物質(zhì)對(duì)其影響的角度對(duì)近年來的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 血小板表面黏附受體GPIb-IX-V復(fù)合物和GPIbα

除止血外，血小板在免疫、炎癥、腫瘤轉(zhuǎn)移等方面也具有重要作用[4]。在損傷修復(fù)或粥樣硬化斑塊形成過程中，血小板對(duì)受損或活化血管內(nèi)皮的識(shí)別和黏附起著關(guān)鍵性作用。通過一系列高度整合的過程，血小板從快速移動(dòng)狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樵谑軅课痪徛凉L動(dòng)、黏附和激活，再募集更多血細(xì)胞形成血栓。血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮下基質(zhì)、白細(xì)胞等的黏附主要由血小板表面黏附-信號(hào)傳遞受體介導(dǎo)，這些受體多為糖蛋白（glycoprotein，GP），其中 GPIbα 尤為重要[5]。

GPIb-IX-V復(fù)合物是血小板表面最重要的黏附受體，GPIbα與GPIbβ以二硫鍵相連接，再與GPIX和GPV非共價(jià)連接組成GPIb-IX-V。GPIbα的細(xì)胞外N-末端是其配體結(jié)合區(qū)域。血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF） 是 GPIb-IX-V 復(fù)合物的主要配體之一。在血液流體剪切力作用下，一端固定的vWF結(jié)構(gòu)部分展開，功能結(jié)構(gòu)域暴露，與GPIbα的N-末端相互作用，GPIbα胞外區(qū)域還有感知流體剪切應(yīng)力并影響vWF與GPIbα結(jié)合的功能，故vWF與GPIb-IX-V復(fù)合物之間的結(jié)合對(duì)血流變化非常敏感[6]。vWF還可同時(shí)與膠原纖維和血小板結(jié)合。血管破裂時(shí)，大量血小板以vWF為中介黏附在膠原纖維上形成血栓。因此，GPIbα的胞外域N-末端是血栓形成所必需。此外，凝血因子XI和XII、凝血酶、白細(xì)胞整合素αMβ2、P-selectin等許多其它分子也能結(jié)合到此部位，在凝血和先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[7]。

GPIbα胞外域還可通過影響膠原纖維與其受體GPVI的結(jié)合來調(diào)節(jié)血小板活化的速度和程度[7]。GPIb-IX-V復(fù)合物和GPVI與其各自配體的結(jié)合可協(xié)調(diào)血小板對(duì)裸露內(nèi)皮下基質(zhì)的反應(yīng)性。研究表明，GPIbα也參與血小板存活的調(diào)節(jié)，抗體或寒冷誘導(dǎo)GPIbα在血小板表面上聚集成簇或形成二聚體可導(dǎo)致循環(huán)血小板被迅速清除[8]。因此，保證血小板膜上GPIbα的相對(duì)密度和功能對(duì)于維持血小板的黏附聚集功能和激活效率極為重要[9]。血小板膜受體已成為血小板相關(guān)疾病治療藥物研究與設(shè)計(jì)的重要靶點(diǎn)[10]。

2 ADAMs家族成員對(duì)血小板黏附受體的調(diào)控

循環(huán)血小板膜受體水平和功能如何精細(xì)調(diào)節(jié)，目前仍未完全闡明。有核細(xì)胞可通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的方式進(jìn)行受體更新，但血小板中不存在此機(jī)制。在金屬蛋白酶的作用下，胞外結(jié)構(gòu)域發(fā)生水解脫落（ectodomain shedding）是一種快速、不可逆的膜蛋白調(diào)控機(jī)制。胞外域脫落現(xiàn)象存在于許多細(xì)胞類型，對(duì)多種細(xì)胞生物學(xué)過程進(jìn)行調(diào)節(jié)，是一種高效率蛋白質(zhì)翻譯后調(diào)控機(jī)制。去整合素金屬蛋白酶家族（A Disintegrin And Metalloproteinases，ADAMs）是胞外域剪切脫落的主要承擔(dān)者，ADAM17是其最為重要的成員，被稱為細(xì)胞中的“分子剪刀”[11]。

ADAM17是一種I型金屬蛋白酶，其最著名的底物分子為pro-TNF-α，作用后釋放出游離TNF-α，故又稱為TNF-α轉(zhuǎn)化酶（tumor necrosis factor-α converting enzyme，TACE）。目前已知ADAM17底物超過80種，包括多種細(xì)胞因子、生長因子、受體或黏附分子等，因此在機(jī)體發(fā)育、炎癥和疾病過程中發(fā)揮重要作用[12]。ADAM17因釋放TNF-α而誘發(fā)炎癥反應(yīng)，并可誘導(dǎo)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的配體脫落而激活EGFR信號(hào)、維持表皮屏障功能，是機(jī)體抵御損傷和感染的第一道防線。ADAM10是ADAMs家族中另一個(gè)重要成員，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有重要作用[13]。ADAM17和ADAM10的底物存在一定的交叉，可發(fā)生功能代償現(xiàn)象[14]。研究表明，血小板膜受體GPIbα的水平主要受ADAM17的調(diào)控，ADAM10主要作用于GPVI[15]。

GPIb-IX-V復(fù)合物和GPVI與其各自相應(yīng)配體結(jié)合，激活血小板內(nèi)信號(hào)通路后，隨即迅速引起GPIbα和GPVI的胞外配體結(jié)合片段發(fā)生不可逆的剪切脫落，避免了血小板的過度激活。Bergmeier等報(bào)告，ADAM17對(duì)人血小板受體GPIbα在細(xì)胞外近膜區(qū)進(jìn)行剪切后產(chǎn)生大小約110-130kDa的可溶性GPIbα 片段（glycocalicin，GC）[16]，但其功能不明。研究顯示，在ADAM17基因表達(dá)抑制的LDLR-/-小鼠中，喂食高脂肪飲食形成的動(dòng)脈粥樣硬化病變的面積明顯增大[17]，不過并未出現(xiàn)明顯的凝血障礙，可能與存在其他代償機(jī)制有關(guān)。

3 ADAM17的激活

ADAM17蛋白的分子結(jié)構(gòu)組成包含一個(gè)N末端信號(hào)序列、一個(gè)前結(jié)構(gòu)域、一個(gè)金屬蛋白酶或催化結(jié)構(gòu)域、一個(gè)解整合素結(jié)構(gòu)域、一個(gè)富含半胱氨酸的膜近端結(jié)構(gòu)域、一個(gè)單次跨膜結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞內(nèi)部分，各部分結(jié)構(gòu)在ADAM17的成熟、轉(zhuǎn)位、活性調(diào)控和底物選擇性方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。ADAM17的激活是一個(gè)受到嚴(yán)密調(diào)控的過程。ADAM17前蛋白的修飾、其磷酸化和向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，都是影響酶活性的重要因素。在不同細(xì)胞類型進(jìn)行的研究中，PKC、ROS、鈣離子、p38 MAPK，以及 ERK、AKT等均報(bào)告有參與ADAM17的激活和對(duì)底物的剪切作用。

在非血小板細(xì)胞上進(jìn)行的研究表明，PMA激活PKC可促使成熟ADAM17向細(xì)胞膜表面移動(dòng)；在血小板中則可增強(qiáng)血小板表面ADAM17的活性。PKC可誘導(dǎo)ADAM17的磷酸化；PKC的許多不同亞型參與ADAM17激活，可能與細(xì)胞類型有關(guān)[18]。

Brill等報(bào)告，在體外以過氧化氫誘導(dǎo)血小板氧化應(yīng)激，可激活A(yù)DAM17并誘導(dǎo)GPIbα胞外剪切脫落，機(jī)制研究顯示這種ADAM17激活作用依賴于p38 MAPK信號(hào)，而與血小板活化、PKC、PI3K和凋亡信號(hào)通路無關(guān)，提示氧化應(yīng)激是激活A(yù)DAM17、影響血小板受體，對(duì)其聚集功能進(jìn)行調(diào)控的一種機(jī)制[19]。血小板儲(chǔ)存病變指的是血小板儲(chǔ)存過程中受體脫落和耗竭、使得輸血后血小板的存活率和功能都顯著下降，也與線粒體損傷引起p38 MAPK的磷酸化激活有關(guān)[20]。

線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mitochondrial permeability transition pore，mPTP）在血小板活化或凋亡中起關(guān)鍵作用，mPTP抑制劑對(duì)鈣離子載體A23187誘導(dǎo)的GPIbα胞外脫落發(fā)揮抑制作用，而mPTP增效劑則可具促進(jìn)作用。此外，A23187誘導(dǎo)的線粒體Ca2+升高可引發(fā)mPTP開放，促進(jìn)線粒體ROS產(chǎn)生，后者誘發(fā)ADAM17介導(dǎo)GPIbα胞外域脫落[21]。Zhang等[22]也報(bào)告，膠原蛋白、凝血酶和A23187都能誘導(dǎo)血小板ROS產(chǎn)生，同時(shí)引起GPIbα胞外域脫落，ROS清除劑抑制GPIbα脫落。在小鼠成纖維細(xì)胞和CHO細(xì)胞中，ATP激活 P2Y受體、誘導(dǎo) ADAM17-依賴性TGF-α釋放、激活EGFR信號(hào)，線粒體ROS和Ca2+也發(fā)揮重要作用[23]。

最近研究發(fā)現(xiàn)，iRhom（protease-inactive rhomboids）家族成員iRhom1和 iRhom2是ADAM17的重要調(diào)節(jié)分子，在分泌途徑中ADAM17的運(yùn)輸需要與iRhom2相結(jié)合。iRhom2磷酸化與ADAM17對(duì)底物的酶解活性也有關(guān)系，可能還參與對(duì)底物的選擇作用。血小板中僅發(fā)現(xiàn)有iRhom2表達(dá)，故通過作用于iRhom2而激活A(yù)DAM17可能是開發(fā)選擇性地作用于血小板的藥物的一個(gè)切入點(diǎn)[24]。Chapnick等[25]研究認(rèn)為ADAM17的激活機(jī)制具有明顯的細(xì)胞類型特異性。

4 內(nèi)外源性物質(zhì)通過影響ADAM17而調(diào)節(jié)血小板及其他細(xì)胞的功能

最早報(bào)告可直接影響血小板受體表達(dá)的藥物正是抗血小板藥物阿司匹林，其在高劑量下可體外誘導(dǎo)血小板GPIb和GPV脫落；同時(shí)阿司匹林也可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞表面L-selectin脫落，這些作用都依賴于其對(duì)ADAM17的激活[26]。

Duerschmied等報(bào)告，5-羥色胺 （5-hydroxytryptamine，5-HT）與血小板膜5-HT2AR結(jié)合后可誘導(dǎo)血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中脫落的GPIbα胞外片段含量升高，而在 ADAM17 基因敲除（ADAM17ΔZn/ΔZn）血小板中，5-HT的作用抑制，表明此作用由ADAM17介導(dǎo)；5-HT激活A(yù)DAM17的作用與p38有關(guān)，似與G蛋白無關(guān)[27]。Hirata等采用iPSC（induced pluripotent stem cells，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞）生產(chǎn)血小板過程中發(fā)現(xiàn)，利用KP-457抑制iPSC中ADAM17后產(chǎn)生的血小板GPIbα胞外脫落的程度較輕，血小板聚集功能更好[28]。

腸道內(nèi)皮細(xì)胞中毒蕈堿型乙酰膽堿M3型受體激活后，通過活化ADAM17而促使細(xì)胞膜TNFR1剪切脫落，抑制TNF-α對(duì)粘膜屏障的破壞，M3受體介導(dǎo)作用決于Gαq/11蛋白和p38，同時(shí)p38也參與了ADAM17介導(dǎo)的EGFR激活和ERK1/2激活，對(duì)于粘膜屏障發(fā)揮保護(hù)作用[29]。此外，angiotensin II、IL-1、ATP等也可激活特異性GPCR、ADAM17活性增強(qiáng)而調(diào)控EGFR等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。可以說，ADAM17是GPCR介導(dǎo)信號(hào)的傳導(dǎo)者，也是細(xì)胞受體信號(hào)相互交流的關(guān)鍵分子。

組織金屬蛋白酶抑制劑（Tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs）包括 TIMP 1-4，是體內(nèi)天然的金屬蛋白酶抑制劑，也是細(xì)胞膜蛋白脫落事件的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。TIMP-3是ADAM17的有效抑制劑，但TIMP3抑制ADAM17而產(chǎn)生的確切后果尚不明確[30]。

5 活血化瘀中藥對(duì)ADAM17的調(diào)控

血瘀證是心血管病常見的中醫(yī)證型，同時(shí)可見于幾乎所有西醫(yī)疾病的部分病程階段、甚至全過程。從西醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的角度看，血瘀證的主要病理表現(xiàn)是血液循環(huán)障礙，包括血液流變學(xué)異常、血流動(dòng)力學(xué)改變、凝血亢進(jìn)、血小板活化聚集、血栓形成和血管腔狹窄等，而形成血瘀證后又可引發(fā)多種更為嚴(yán)重的病變。中醫(yī)認(rèn)為其病機(jī)主要是瘀血內(nèi)阻，治以活血化瘀。臨床上，活血化瘀法治療心血管系統(tǒng)疾病，特別是作為冠心病[31]和病理性血栓形成[32]的輔助用藥，療效頗佳。

常用活血化瘀中藥有赤芍、川芎、丹參、紅花、桃仁、乳香、沒藥等，常同補(bǔ)氣、養(yǎng)血、溫經(jīng)散寒、清熱、行氣、攻下等治法配合使用。例如，陳可冀院士治療冠心病支架置入術(shù)后血瘀證常用赤芍、川芎、紅花和丹參[31]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，活血化瘀藥物治療心血管疾病的機(jī)制主要包括：（1）抗血小板聚集；（2）改善血管內(nèi)皮功能；（3）調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)；（4）抑制氧化應(yīng)激；（5）調(diào)脂、穩(wěn)定斑塊；（6）增加冠狀動(dòng)脈血流量[33]?？梢娍寡“寰奂腔钛鏊幬锇l(fā)揮作用的一個(gè)重要方面，三七、紅花、川芎、益母草等中藥對(duì)血小板聚集的抑制作用已得到實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證；活血化瘀中藥調(diào)控血小板功能的機(jī)制主要是抑制其與功能障礙的血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的黏附，或可直接抑制血小板激活和聚集，然而其作用機(jī)制和作用靶點(diǎn)目前尚有待進(jìn)一步闡明[34]?；钛鲋兴幨欠窨赏ㄟ^如前所述的ADAM17/GPIbα途徑調(diào)控血小板功能，目前尚未見報(bào)告。

血管內(nèi)皮功能失調(diào)是動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）形成的始動(dòng)因素和必備條件，同時(shí)也與血小板黏附和血栓形成密切相關(guān)[35]。許多藥物可通過抑制氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)、抑制細(xì)胞內(nèi)炎性信號(hào)通路等途徑而改善血管內(nèi)皮功能，抑制AS的發(fā)展。本課題組在前期開展國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“基于TACE剪切作用研究活血膠囊對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的抗炎機(jī)制（81573823）”的過程中，研究了活血膠囊及某些中藥活性單體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的抗炎機(jī)制，發(fā)現(xiàn)紅花主要活性成分羥基紅花黃色素（hydroxyl-safflower yellow A，HSYA）、赤芍主要活性成分芍藥苷（paeoniflorin，PF）、黃芪中所含黃芪皂苷 III（astragalaside III，AS-III），以及活血膠囊均可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ADAM17酶活性升高。HSYA激活A(yù)DAM17后引起細(xì)胞膜TNFR1剪切脫落，抑制細(xì)胞中TNFR1/NF-κB信號(hào)激活和黏附分子-1（ICAM-1）的表達(dá)，進(jìn)而抑制巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞黏附[36]。PF激活內(nèi)皮細(xì)胞ADAM17后，不僅引起TNFR1剪切脫落和NF-κB信號(hào)抑制，還介導(dǎo)EGFR反式激活及下游保護(hù)性信號(hào)激活，發(fā)揮抗氧化和抗炎作用；PF通過誘導(dǎo)ADAM17磷酸化而使之激活[37]。在動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，我們發(fā)現(xiàn)AS-III可抑制TNFR1/NF-κB信號(hào)激活[38]；隨后研究顯示，AS-III的作用也與激活A(yù)DAM17、誘導(dǎo)TNFR1脫落有關(guān)，且同時(shí)可誘導(dǎo)EGFR反式激活；進(jìn)一步研究表明AS-III通過激活p38而誘導(dǎo)ADAM17磷酸化。與此同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)活血膠囊也可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADAM17磷酸化，激活EGFR信號(hào)和抑制TNFR1/NF-κB信號(hào)（數(shù)據(jù)待發(fā)表）。以上研究提示，ADAM17是活血化瘀藥物抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥，進(jìn)而抑制內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞、血小板黏附，發(fā)揮對(duì)心血管“活血化瘀”作用的一個(gè)重要靶點(diǎn)。

黃芪是一味重要的益氣活血中藥。除本課題組對(duì)AS-III的研究外，Gu等[39]報(bào)告，黃芪甲苷（AS-IV）可激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2而誘導(dǎo)抗氧化酶血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）等抗氧化酶的表達(dá)，其作用機(jī)制與誘導(dǎo)HB-EGF釋放、反式激活EGFR信號(hào)有關(guān)。Chen等[40]也報(bào)告，AS-VI具有促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和自我更新的功能，其作用與激活EGFR/MAPK信號(hào)通路有關(guān)。盡管上述研究并未對(duì)AS-VI誘導(dǎo)HB-EGF釋放或EGFR激活的機(jī)制進(jìn)行深入研究，筆者推測可能與激活A(yù)DAM17或其類似物有關(guān)。本課題組研究顯示，活血膠囊亦可誘導(dǎo)PI3K/AKT/Nrf2/HO-1信號(hào)通路激活，從而對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮抗氧化作用[41]；同時(shí)發(fā)現(xiàn)活血膠囊可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞中ADAM17活化，而且PI3K/AKT/Nrf2的激活可為ADAM17抑制劑所抑制（數(shù)據(jù)待發(fā)表），提示ADAM17是活血膠囊激活抗氧化信號(hào)通路的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

以上研究顯示，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的ADAM17可為活血化瘀中藥單體或復(fù)方活血膠囊激活，通過切割細(xì)胞表面的炎癥相關(guān)分子TNFR1、EGFR受體來發(fā)揮抗炎作用，那么這些藥物是否可以同時(shí)激活血小板中ADAM17，通過對(duì)GPIbα途徑發(fā)揮切割作用、減少其配體結(jié)合位點(diǎn)而抑制血小板黏附聚集功能，發(fā)揮“活血化瘀”作用，是一個(gè)非常令人感興趣的問題。課題組的前期研究顯示，在離體血小板中，HSYA、PF和活血膠囊的確可迅速誘導(dǎo)GPIbα的胞外片段脫落至培養(yǎng)液中（數(shù)據(jù)待發(fā)表），其進(jìn)一步的作用機(jī)制和生理學(xué)意義正在研究中。

由于ADAM17在體內(nèi)幾乎所有細(xì)胞廣泛表達(dá)，底物又十分多樣[42]，因此在不同細(xì)胞類型中ADAM17激活后產(chǎn)生的效應(yīng)與細(xì)胞的功能密切相關(guān)[43-44]。筆者推測，激活內(nèi)皮細(xì)胞中的ADAM17，誘導(dǎo)TNFR1和其他炎性分子如（Toll-Like Receptor 4，TLR4）脫落而抑制炎癥反應(yīng)[44]；同時(shí)激活血小板 ADAM17，誘導(dǎo)GPIbα脫落，抑制血小板黏附功能，進(jìn)一步影響血小板與血管、白細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等的相互作用，可能是活血化瘀藥物發(fā)揮作用的兩個(gè)方面。血小板ADAM17很可能是中藥活血化瘀作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一。