張力之，李 均

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū)中藥應(yīng)用與基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 珠海 519000)

腎纖維化是腎組織受損后人體自身修復(fù)的結(jié)果，也是各種慢性腎臟病發(fā)展到終末期腎病的共同通路[1]。近年來，腎纖維化進(jìn)程中腎小管上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition，EMT)逐漸受到關(guān)注，其進(jìn)展速度直接影響腎纖維化進(jìn)程。丹參的脂溶性成分丹參酮ⅡA被廣泛用于腎纖維化的臨床治療，對改善腎臟纖維化和保護(hù)腎臟功能的效果明顯。丹參酮ⅡA可通過干預(yù)EMT進(jìn)一步影響腎纖維化的產(chǎn)生與進(jìn)展，具體過程可能與多條導(dǎo)致腎纖維化的信號通路有關(guān)。Notch信號通路是近年來信號通路的研究熱點(diǎn)，與腎纖維化關(guān)系密切[2]。阻斷Notch信號通路可抑制EMT、減少肌成纖維細(xì)胞的生成，并可進(jìn)一步減緩腎臟組織纖維化的進(jìn)展[3]。但丹參酮ⅡA與Notch信號通路之間的關(guān)聯(lián)性及具體影響機(jī)制仍需進(jìn)一步深入探討?，F(xiàn)對丹參酮ⅡA和Notch信號通路與腎纖維化的研究進(jìn)展予以綜述。

1 Notch信號通路與腎纖維化

1.1Notch信號通路概述 Notch信號通路是由多種信號分子參與的高度保守的信號通路，廣泛存在于各種生物進(jìn)化過程。Notch信號通路由Notch受體、Notch配體、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL(C-啟動子結(jié)合因子1/重組信號結(jié)合蛋白-Jk、無毛抑制器、滯后蛋白1的合稱)、效應(yīng)物及相關(guān)調(diào)節(jié)分子等組成，參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并精確調(diào)節(jié)細(xì)胞之間的信息交流[4]。目前，存在于人體內(nèi)的Notch受體有Notch1～Notch4，其中Notch1～Notch3常表達(dá)于神經(jīng)和心臟、腎臟、肝臟等，Notch4則表達(dá)于上皮細(xì)胞[5]。Notch受體由細(xì)胞外區(qū)、跨細(xì)胞膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)區(qū)3部分組成，細(xì)胞外區(qū)由表皮生長因子重復(fù)序列以及含半胱氨酸的Lin/Notch重復(fù)序列組成，能夠識別并結(jié)合Notch配體，并激活信號途徑；細(xì)胞內(nèi)區(qū)由錨蛋白重復(fù)序列、含谷氨酰胺的結(jié)構(gòu)域以及PEST結(jié)構(gòu)域組成，通過將Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)部來調(diào)節(jié)細(xì)胞的生命活動。目前，明確的人體內(nèi)跨膜蛋白Notch配體是Jagged1、Jagged2、Delta-like 1、Delta-like 3、Delta-like 4，可在信號通路激活后結(jié)合Notch受體，經(jīng)過兩次蛋白裂解，形成Notch蛋白胞內(nèi)活化域，隨后進(jìn)入細(xì)胞核結(jié)合細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL，激活通路下游的Hes-1、Hey等靶基因，使蛋白產(chǎn)物大量表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[6-10]。

1.2腎小管EMT 腎小管EMT與腎纖維化關(guān)系密切。EMT導(dǎo)致組織中成纖維細(xì)胞增多，成纖維細(xì)胞發(fā)生功能和表型改變，轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_(dá)α平滑肌肌動蛋白的肌成纖維細(xì)胞，從而產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)，促使腎纖維化的產(chǎn)生[11]。與腎小管EMT相關(guān)的常見因子有轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β，TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、結(jié)締組織生長因子等。上皮鈣黏素被認(rèn)為是EMT的特征性蛋白，細(xì)胞內(nèi)上皮鈣黏素含量降低是EMT發(fā)生的特異性標(biāo)志[12]。在EMT過程中，細(xì)胞上皮鈣黏素減少，大量間充質(zhì)蛋白出現(xiàn)(如α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白等)，使細(xì)胞黏附能力下降，導(dǎo)致大量上皮細(xì)胞遷移，加速肌成纖維細(xì)胞生成。鋅指轉(zhuǎn)錄因子是EMT過程的關(guān)鍵分子，細(xì)胞中鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白含量增加可導(dǎo)致上皮鈣黏素的表達(dá)下降，從而加重纖維化[13-14]。

1.3Notch信號通路與腎間質(zhì)纖維化 Notch信號通路可通過調(diào)控腎臟組織細(xì)胞的增殖、發(fā)育、凋亡等影響腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。Notch信號通路參與腎小管EMT過程可能與許多信號通路(TGF-β信號通路、Wnt信號通路、表皮生長因子受體信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路等)相關(guān)，通過影響EMT過程中上皮鈣黏素、鋅指轉(zhuǎn)錄因子及相關(guān)調(diào)控因子等影響腎纖維化過程。在腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中,Hey1基因受TGF-β和Jagged1共同調(diào)控，TGF-β可以參與誘導(dǎo)早期Hey1基因的表達(dá),Jagged1則調(diào)控后續(xù)Hey1基因的表達(dá)。Hey1基因激活可引起信號通路下游目的蛋白大量表達(dá)，減少細(xì)胞間黏附力，加快EMT的進(jìn)展，可見，Notch信號通路可與TGF-β信號通路協(xié)同串聯(lián)，共同調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞的EMT過程[15]。Aoyagi-Ikeda等[16]通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞纖維化時(shí)，Notch信號通路的激活是TGF-β誘導(dǎo)纖維化細(xì)胞產(chǎn)生α平滑肌肌動蛋白以及生成細(xì)胞外基質(zhì)的必備過程。當(dāng)Notch信號通路激活后，配體Jagged1表達(dá)產(chǎn)物大量增加，導(dǎo)致大鼠上皮細(xì)胞中α平滑肌肌動蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞纖維化加重。腎間質(zhì)纖維化病理改變中，TGF-β1可增加Notch1、Notch4、Jagged1、Jagged2等基因的表達(dá)，從而調(diào)控EMT產(chǎn)生[17-18]。TGF-β信號通路下游分子Smad3可通過與Notch信號通路下游細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL的結(jié)合影響信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)[19]。具體過程可能是TGF-β活化后，促進(jìn)Notch信號通路中HES-1蛋白表達(dá)，此過程可被CSL阻滯，Notch蛋白胞內(nèi)活化域及Smda3發(fā)生效應(yīng)后形成多聚物，調(diào)節(jié)HES-1蛋白表達(dá)。當(dāng)CSL與Notch蛋白胞內(nèi)活化域共存時(shí)，Smad3可與CSL結(jié)合，進(jìn)而取代DNA上CSL/Notch蛋白胞內(nèi)活化域靶點(diǎn)[20]。Bielesz等[21]研究認(rèn)為，Notch信號通路可以加快TGF-β信號通路中Smad3的活化過程，Smad3能夠增加結(jié)締組織生長因子的表達(dá)，抑制上皮鈣黏素表達(dá)，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)α平滑肌肌動蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)EMT的發(fā)生，加重腎間質(zhì)纖維化程度[22]。3，5-二氟苯乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸t(yī)-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]-S-phenylglycine t-Butyl Ester，DAPT}是Notch信號通路細(xì)胞內(nèi)因子γ分泌酶抑制物，通過降低Notch信號通路活性，抑制Notch蛋白胞內(nèi)活化域和HES-1的表達(dá)，阻斷Notch信號通路的活化，進(jìn)而抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化[23]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路與TGF-β1信號可在腎間質(zhì)纖維化過程中互相影響，γ分泌酶抑制劑能阻斷TGF-β1調(diào)控的近端腎小管上皮轉(zhuǎn)分化過程，TGF-β1及轉(zhuǎn)分化有關(guān)基因均被γ分泌酶抑制劑所抑制，腎間質(zhì)纖維化過程受到影響，表明阻斷Notch信號通路后，TGF-β1信號通路也會被阻斷，腎小管上皮細(xì)胞EMT過程將會受到抑制[24]。此外，當(dāng)Notch信號通路被激活后，鋅指轉(zhuǎn)錄因子蛋白大量表達(dá)，從而促進(jìn)TGF-β1介導(dǎo)的EMT發(fā)生，并加重纖維化，表明Notch信號通路和TGF-β1信號通路存在協(xié)同作用，可以共同調(diào)控組織纖維化[25-26]。同樣，Notch信號通路與Wnt信號通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路也存在類似的聯(lián)系。朱天琦等[27]研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號通路抑制劑作用于人腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞后，Notch信號通路中Notch1和Jagged1以及Wnt信號通路中Wnt1和β聯(lián)蛋白表達(dá)都明顯降低，還發(fā)現(xiàn)DAPT可抑制細(xì)胞中血管內(nèi)皮生長因子的表達(dá)。Lin等[28]研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎損傷細(xì)胞模型中足細(xì)胞、人胚腎細(xì)胞(HEK293)以及動物模型腎組織中均可檢測到Notch信號通路的過表達(dá)，這可能與血管內(nèi)皮生長因子等因素有關(guān)。

其他器官組織的EMT過程也有Notch信號通路參與調(diào)控細(xì)胞組織的纖維化。肝臟纖維化的研究證實(shí)，DAPT能夠延緩大鼠肝臟EMT的發(fā)生，改善肝臟細(xì)胞纖維化[29-30]。一方面，DAPT干預(yù)治療大鼠肝星狀細(xì)胞內(nèi)Notch信號通路活性降低，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制；另一方面，TGF-β、鋅指轉(zhuǎn)錄因子和間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)產(chǎn)物生成減少。DAPT可上調(diào)上皮鈣黏素的表達(dá)，上皮鈣黏素表達(dá)增加可減慢細(xì)胞發(fā)生EMT的速度。肝臟損傷模型中Notch和Hedgehog信號通路可通過介導(dǎo)EMT共同調(diào)控肝星狀細(xì)胞。肝星狀細(xì)胞中Notch信號通路與Hedgehog信號通路同時(shí)被激活，Hedgehog信號通路激活后，可進(jìn)一步促進(jìn)Notch信號通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)特定阻斷Notch信號通路后，細(xì)胞內(nèi)Hedgehog靶基因Gli1和Ptc表達(dá)產(chǎn)物減少,Hedgehog信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)被抑制。阻斷Hedgehog信號通路中Smoothened發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)Notch2、Jagged1以及Notch信號通路的靶基因表達(dá)下降，說明肝纖維化過程中Notch信號通路和Hedgehog信號通路共同參與肝星狀細(xì)胞的EMT，且兩者之間可相互影響，共同決定EMT的發(fā)展進(jìn)程[31]。肺纖維化過程中使用DAPT可以抑制Notch信號通路活化，降低解整合素金屬蛋白酶17的表達(dá)，減少局部活性氧類的產(chǎn)生，降低肺組織氧化損傷，從而改善肺纖維化程度[32]。于秀文和曾林祥[33]阻斷Notch信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)現(xiàn)，肺組織中肌成纖維細(xì)胞生成受到抑制，肺纖維化進(jìn)程得到緩解。可見，Notch信號通路與組織纖維化關(guān)系密切，激活Notch信號通路可導(dǎo)致組織細(xì)胞EMT的產(chǎn)生，促使纖維化的發(fā)生。

2 丹參酮ⅡA和Notch信號通路與腎纖維化

2.1丹參酮ⅡA與腎纖維化 丹參酮ⅡA又稱丹參醌Ⅱ或丹參醌ⅡA，分子式為C19H18O3，是一種橘紅色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)209～210 ℃，主要存在于丹參的干燥根和根莖，易溶于有機(jī)溶劑，微溶于水。近年來，隨著對丹參脂溶性成分丹參酮ⅡA的深入研究，發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA能夠抗炎抗氧化，同時(shí)能明顯抑制成纖維細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生，延緩腎間質(zhì)纖維化過程，改善腎組織纖維化。丹參酮ⅡA可以抑制纖維連接蛋白、膠原蛋白Ⅲ、膠原蛋白Ⅳ和腫瘤壞死因子α、單核細(xì)胞趨化蛋白1和CXC趨化因子配體1的蛋白質(zhì)以及信使RNA的表達(dá)，同時(shí)可以抑制5/6腎切除大鼠腎組織中TGF-β/Smad和核因子κB信號的激活，從而進(jìn)一步抑制腎臟組織EMT的產(chǎn)生[34]。趙斐等[35]研究證明，丹參酮ⅡA能夠維持腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)的穩(wěn)定，防止細(xì)胞向成纖維細(xì)胞發(fā)展，并在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和分泌Ⅰ型膠原的作用，從而達(dá)到防治腎纖維化的目的。唐錦輝和占成業(yè)[36]的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠起到延緩腎間質(zhì)纖維化和保護(hù)腎臟功能的作用，與下調(diào)細(xì)胞內(nèi)TGF-β1的表達(dá)、抑制成纖維細(xì)胞生成和轉(zhuǎn)化以及減少相關(guān)膠原蛋白的產(chǎn)生等密不可分；通過丹參酮ⅡA的干預(yù)發(fā)現(xiàn)，干預(yù)組腎間質(zhì)纖維化程度比模型組減輕，腎組織中TGF-β1、α平滑肌肌動蛋白和Ⅰ型膠原蛋白的表達(dá)均下降。王俏等[37]建立丹參酮ⅡA干預(yù)治療糖尿病腎病大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA具有保護(hù)腎臟和延緩糖尿病腎病進(jìn)展的作用，具體功效可能與丹參酮ⅡA強(qiáng)大的抗氧化活性有關(guān)；細(xì)胞組織中總抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶表達(dá)、超氧化物歧化酶活性可隨丹參酮ⅡA的使用提高；與此同時(shí)，丙二醛總量有所下降，腎小球基膜增厚和硬化得到改善，腎纖維化程度得以減輕。丹參酮ⅡA磺酸鈉作為丹參酮ⅡA磺酸化后產(chǎn)物，具有良好的溶解性以及抗纖維化和改善循環(huán)等功效，常用于臨床治療。丹參酮ⅡA磺酸鈉能夠下調(diào)血小板源性生長因子D，并上調(diào)血紅素加氧酶1的表達(dá)，抑制間質(zhì)細(xì)胞增生和表型轉(zhuǎn)化，從而抑制大鼠腎間質(zhì)纖維化的產(chǎn)生和進(jìn)展[38]。周儒兵等[39]通過丹參酮ⅡA磺酸鈉干預(yù)糖尿病大鼠的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液治療組α平滑肌肌動蛋白、波形蛋白和TGF-β1的表達(dá)均較糖尿病模型組下調(diào)，且腎間質(zhì)纖維化程度得到改善。唐云海和朱春玲[40]認(rèn)為，波形蛋白可能參與促炎反應(yīng)和促腎間質(zhì)纖維化過程。丹參酮ⅡA磺酸鈉可通過降低波形蛋白在腎小管間質(zhì)的表達(dá)減少細(xì)胞外間質(zhì)的生成，從而緩解腎間質(zhì)纖維化。

除腎纖維化外，丹參酮ⅡA對其他器官和組織也有抗纖維化作用。對肺纖維化的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA不僅可通過減少肺間質(zhì)纖維化期間炎性細(xì)胞的產(chǎn)生和炎性因子的釋放來減少肺組織局部氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和環(huán)加氧酶2的表達(dá)；還可通過抑制大鼠TGF-β1、Smad2和Smad3信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制肺間質(zhì)纖維的產(chǎn)生[41]。對肝臟組織纖維化大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可通過抑制肝纖維化組織血管新生的方式起到抗肝纖維化作用，其關(guān)鍵環(huán)節(jié)是抑制肝組織血管內(nèi)皮生長因子與缺氧誘導(dǎo)因子1α的信使RNA與蛋白的表達(dá)[42]。對心肌纖維化大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA能夠抑制心肌間質(zhì)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞分化，通過下調(diào)結(jié)締組織生長因子的合成，減少心臟肌成纖維細(xì)胞中Ⅰ型和Ⅲ型膠原合成，從而明顯降低心肌間質(zhì)膠原沉積，改善心肌纖維化程度[43]。

2.2丹參酮ⅡA與Notch信號通路 Notch信號通路與腎纖維化有直接關(guān)聯(lián)，丹參酮ⅡA通過調(diào)節(jié)各信號通路以及各環(huán)節(jié)細(xì)胞因子和蛋白產(chǎn)物對腎纖維化起保護(hù)作用。目前，丹參酮ⅡA調(diào)節(jié)Notch信號通路影響腎纖維化發(fā)生的具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。將大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、丹參酮ⅡA組、DAPT組及丹參酮ⅡA聯(lián)合DAPT組(聯(lián)合給藥組)的丹參酮ⅡA配伍DAPT抗大鼠腎纖維化的研究顯示，各單一給藥組和聯(lián)合給藥組大鼠腎組織纖維化程度較模型組輕；免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，各給藥組Notch蛋白胞內(nèi)活化域、Hey1平均光密度值明顯低于模型組，以聯(lián)合給藥組效果最佳；蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，各給藥組重組信號結(jié)合蛋白-Jk、ColⅠ蛋白相對表達(dá)較模型組明顯降低，聯(lián)合給藥組效果最為明顯，由此可見，丹參酮ⅡA可緩解腎間質(zhì)纖維化過程中膠原纖維的合成,其作用機(jī)制可能與抑制Notch蛋白胞內(nèi)活化域、重組信號結(jié)合蛋白-Jk、Hey1在腎組織表達(dá)以及影響Notch/Jagged信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)[44-45]。但丹參酮ⅡA是否能夠促進(jìn)DAPT抑制Notch信號通路激活，從而協(xié)同延緩RIF產(chǎn)生的具體機(jī)制尚不明確。何瓊笑和趙峻峰[46]隨機(jī)將大鼠心肌缺血再灌注模型分為模型組、丹參酮ⅡA組和DAPT組，結(jié)果顯示模型組心肌內(nèi)活性氧類水平和乳酸脫氫酶含量顯著升高，Notch1、Hes1、缺氧誘導(dǎo)因子1α的信使RNA和蛋白的表達(dá)明顯增高，與模型組相比，丹參酮ⅡA組和DAPT組中Notch1信使RNA的表達(dá)以及Notch1、Hes1和缺氧誘導(dǎo)因子1α蛋白的表達(dá)明顯下降，認(rèn)為丹參酮ⅡA通過抑制Notch信號通路進(jìn)一步調(diào)控抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對大鼠心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用。

3 小 結(jié)

目前，對丹參酮ⅡA與腎纖維化的研究主要集中在Wnt/β聯(lián)蛋白、TGF-β/Smad、缺氧誘導(dǎo)因子1α/血管內(nèi)皮生長因子等信號通路。丹參酮ⅡA能夠參與以上信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并減輕腎纖維化程度，延緩腎纖維化產(chǎn)生，保護(hù)腎臟功能。在腎纖維化過程中，Notch信號通路與以上信號通路相互串聯(lián)，但目前國內(nèi)外對丹參酮ⅡA是否能夠參與Notch信號通路調(diào)節(jié)腎纖維化以及其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。其他器官組織中，丹參酮ⅡA能通過調(diào)節(jié)Notch信號通路影響細(xì)胞生長、凋亡等。目前，有關(guān)丹參酮ⅡA與Notch信號通路及其通路信號因子在腎纖維化過程中具體關(guān)聯(lián)的研究正在進(jìn)行。丹參酮ⅡA對腎纖維化過程中Notch信號通路具體調(diào)控機(jī)制的深入研究，有助于進(jìn)一步闡述丹參酮ⅡA抗腎纖維化的作用機(jī)制，為丹參酮ⅡA臨床治療慢性腎臟病提供更多的理論依據(jù)。