鄭曉東，李 珊，劉映峰，繆 緋

(南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510280)

近年來(lái)，全球心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)的發(fā)病率及死亡率逐年上升，盡管各種預(yù)防措施、診斷方法和治療手段均取得了實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，但CVD在北美仍是發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一[1]。近年來(lái)我國(guó)CVD的發(fā)病率也逐年升高[2]。因此學(xué)者們期待有更多的方法和技術(shù)對(duì)當(dāng)前CVD的診治進(jìn)行補(bǔ)充，其中包括超聲微泡技術(shù)。

超聲微泡技術(shù)是一種無(wú)創(chuàng)、具有組織特異性的新技術(shù)，其以超聲微泡作為媒介，在超聲下實(shí)時(shí)顯影靶器官。超聲微泡的微泡是由外殼包裹惰性氣體構(gòu)成，常見的外殼包括蛋白質(zhì)、脂類以及高分子聚合物，大小為1～8 μm[3]。微泡經(jīng)外周靜脈到達(dá)特定器官后，在超聲輻照下呈非線性的反射信號(hào)，具有比普通超聲更佳的分辨率和對(duì)比度，尤其是對(duì)于肺氣腫、肋間隙狹窄、肥胖等聲學(xué)顯影不佳的疾病，超聲微泡的顯影優(yōu)勢(shì)更為明顯。第3代超聲微泡具有不易透過(guò)組織間隙、無(wú)肝腎毒性、在血液中穩(wěn)定存在等優(yōu)勢(shì)，具有良好的生物安全性和臨床應(yīng)用價(jià)值[4]。對(duì)微泡表面進(jìn)行特定抗原或配體修飾后制備成靶向微泡，在靶向超聲成像技術(shù)支持下，可以在細(xì)胞水平和分子水平分析活體組織的生物過(guò)程，能夠?qū)膊“l(fā)生發(fā)展中的重要分子和轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑間接成像，為早期診斷和治療疾病提供新的方法[5-6]。現(xiàn)就超聲微泡在CVD診斷和治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述。

1 超聲微泡在高血壓腎損傷診治中的應(yīng)用

長(zhǎng)期高血壓是導(dǎo)致腎動(dòng)脈粥樣硬化的主要原因，腎動(dòng)脈粥樣硬化可發(fā)展為高血壓性腎損傷。血清尿素氮、血肌酐只有在腎小球?yàn)V過(guò)率下降1/3～2/3時(shí)才明顯升高，而尿蛋白陽(yáng)性能反映早期高血壓腎功能損傷，但上述方法均無(wú)法評(píng)估單個(gè)腎臟的功能，而且對(duì)診斷高血壓腎損傷存在一定的滯后性，而超聲微泡檢查可以克服這些局限性[7]。楊榮和李明星[8]發(fā)現(xiàn)，在評(píng)估窒息新生兒早期腎功能損傷中，超聲微泡測(cè)得的腎血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的敏感性及有效性均優(yōu)于尿素氮和血肌酐，并能評(píng)估單個(gè)腎臟的灌注情況。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，朱向明等[9]的研究表明，超聲微泡可對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠的早期腎功能損傷進(jìn)行定量評(píng)估。Le Dorze等[7]發(fā)現(xiàn)，超聲微泡可較實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)更早發(fā)現(xiàn)早期高血壓腎功能損傷的腎實(shí)質(zhì)灌注異常和腎動(dòng)脈硬化程度。在治療方面，對(duì)已經(jīng)發(fā)生高血壓腎損傷的患者，超聲微泡可以評(píng)估腎功能損傷的程度，定期隨訪可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展，為臨床治療提供參考[10-11]。目前已有報(bào)道將攜帶基因的靶向微泡，通過(guò)微泡破壞技術(shù)將基因定向釋放于靶組織，從而在基因水平治療及預(yù)防腎功能不全[12]。超聲微泡技術(shù)可實(shí)現(xiàn)在分子和基因水平治療高血壓腎功能不全。

2 超聲微泡在心力衰竭診治中的應(yīng)用

普通超聲對(duì)于評(píng)估存在肺氣腫、肥胖、肋間隙狹窄、胸腔或心包內(nèi)置管的患者的心功能有一定的局限性[13]，超聲微泡檢查一定程度上可以優(yōu)化此類患者的心功能評(píng)估。Tomaszuk-Kazberuk等[14]對(duì)30例冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后進(jìn)行普通超聲和超聲微泡檢查的患者進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在心臟510個(gè)節(jié)段中，普通超聲有217個(gè)節(jié)段顯影不清，而超聲微泡檢查僅有4個(gè)節(jié)段顯影不佳，因此超聲微泡檢查能清晰顯示更多心臟節(jié)段。Larsson等[15]采用普通超聲和超聲微泡檢查患者左心室射血分?jǐn)?shù)和左心室容積發(fā)現(xiàn)，在普通超聲檢查中，不同超聲醫(yī)師之間得出的結(jié)果存在顯著差異，而采用超聲微泡檢查這種差異性明顯降低，提示超聲微泡檢查可以減少超聲醫(yī)師主觀偏倚造成的結(jié)果差異。皮淑芳等[16]報(bào)道了1例因肥胖導(dǎo)致透聲條件差的心力衰竭患者，超聲微泡檢查顯示心肌致密化不全，左心室側(cè)壁及心尖部肌小梁粗大，深陷隱窩內(nèi)可見微泡填充，致密層和非致密層分界清楚。相對(duì)于普通超聲，超聲微泡檢查在心功能診斷中具有更高的敏感性和準(zhǔn)確性[17]。

在心力衰竭治療方面，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定強(qiáng)度的超聲輻照或可對(duì)心肌產(chǎn)生正性肌力作用[17-19]。Forester等[20]研究不同強(qiáng)度的超聲對(duì)離體大鼠乳頭肌收縮功能的影響發(fā)現(xiàn)，0.25～2.0 W/cm2的超聲強(qiáng)度可明顯增強(qiáng)大鼠乳頭肌的收縮。Hanawa等[19]對(duì)豬左心室射血分?jǐn)?shù)減低的慢性心肌缺血模型進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，低強(qiáng)度超聲(193 mW/cm2)輻照治療8周后，治療組左心室射血分?jǐn)?shù)較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，但過(guò)強(qiáng)的超聲強(qiáng)度可導(dǎo)致不良的生物學(xué)效應(yīng)，甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡。如果能確定有效且安全的超聲強(qiáng)度以誘導(dǎo)心肌正性肌力效應(yīng)，將是心力衰竭無(wú)創(chuàng)治療的重要突破[17]。

3 超聲微泡在急性冠狀動(dòng)脈綜合征診治中的應(yīng)用

3.1超聲微泡對(duì)急性心肌缺血的評(píng)估 目前臨床上評(píng)估急性心肌缺血的方法包括心電圖、心肌損傷標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)演變、心臟放射性核素檢查、心臟磁共振、冠狀動(dòng)脈造影檢查、超聲微泡等，其中超聲微泡具有床旁檢查及時(shí)性和實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)。在缺血炎癥反應(yīng)中，P選擇素可在幾分鐘內(nèi)迅速表達(dá)并可持續(xù)數(shù)小時(shí)，隨后細(xì)胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)也大量表達(dá)，因此P選擇素和ICAM-1是評(píng)價(jià)早期心肌缺血的理想指標(biāo)[21-22]。有學(xué)者成功構(gòu)建了攜帶P選擇素的靶向超聲微泡，并成功用于評(píng)估小鼠心肌缺血再灌注后的炎癥反應(yīng)，可間接判斷心肌缺血的范圍[23]。紀(jì)麗景等[22]利用P選擇素單抗靶向微泡評(píng)估小鼠心肌缺血再灌注損傷，結(jié)果顯示，靶向微泡在缺血心肌中的黏附率較小靜脈提高了10倍，缺血心肌中靶向微泡的顯影效果較普通微泡提高了4倍。有研究表明，裝載ICAM-1的靶向微泡對(duì)缺血的炎癥組織有較高的檢出率，可用于缺血再灌注心肌的診斷[24-26]。對(duì)超聲微泡進(jìn)行特異性抗體或配體的修飾，可以提高缺血心肌的檢出率，如果能在微泡中包裹治療的藥物或基因，使其在微泡靶向結(jié)合的基礎(chǔ)上定向釋放藥物，或可實(shí)現(xiàn)缺血心肌的精準(zhǔn)治療[25]。

在評(píng)估冠狀動(dòng)脈血流方面，超聲微泡可以精確測(cè)量微循環(huán)血流，具有無(wú)放射性、無(wú)創(chuàng)、相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)。Gaibazz等[27]評(píng)估了400例超聲負(fù)荷試驗(yàn)患者的冠狀動(dòng)脈情況發(fā)現(xiàn)，狹窄程度>50%的患者中，超聲微泡造影具有較高的靈敏度(96%)和準(zhǔn)確度(86%)。Senior等[28]比較了516例冠心病患者的超聲微泡檢查和單光子發(fā)射斷層掃描顯示，超聲微泡檢查具有更高的敏感性。超聲微泡檢查用于急診胸痛的鑒別診斷時(shí)，或可減少不必要的住院和侵入性心臟檢查[29]。20世紀(jì)90年代已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，低頻高強(qiáng)度超聲有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用[30]。在此基礎(chǔ)上，Miyamoto等[31]使用低頻高強(qiáng)度超聲(27 kHz，1.4 W/cm2)經(jīng)胸輻照犬的冠狀動(dòng)脈，5 min后行冠狀動(dòng)脈造影及血管內(nèi)超檢查發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈管徑較前擴(kuò)大，并與冠狀動(dòng)脈內(nèi)灌注硝酸甘油的效果相當(dāng)。超聲輻照結(jié)束1 h后檢查發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈管徑恢復(fù)，這表明超聲的擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈的作用是可逆的[31]。這或可成為一種潛在的治療急性冠狀動(dòng)脈綜合征的方法，在血運(yùn)重建前擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈并改善心肌缺血。

3.2超聲微泡在冠狀動(dòng)脈血栓診治中的應(yīng)用 血栓形成是急性冠狀動(dòng)脈綜合征的常見原因，靶向超聲微泡可以實(shí)現(xiàn)無(wú)創(chuàng)血栓顯影。在超聲微泡表面組裝血栓形成過(guò)程中關(guān)鍵分子的抗體或配體，使微泡與血栓靶向結(jié)合可實(shí)現(xiàn)超聲下血栓顯影。國(guó)外有學(xué)者構(gòu)建了攜帶有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列的超聲微泡，其能與血栓中的ⅡbⅢa受體特異性結(jié)合，在體內(nèi)外均能增強(qiáng)血栓顯影，在診斷急性冠狀動(dòng)脈綜合征血栓病變中具有重要價(jià)值[32-33]。在靶向微泡特異性結(jié)合血栓的基礎(chǔ)上，一定強(qiáng)度的超聲輻照產(chǎn)生的空化效應(yīng)可使血栓軟化甚至溶解[34]。也有學(xué)者在靶向微泡中包裹溶栓藥物，定向爆破微泡釋放藥物可增加溶栓效果，提升心肌灌注、改善心功能[30,35]。Xie等[36]用豬冠狀動(dòng)脈血栓栓塞模型進(jìn)行超聲溶栓實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，在心外膜血管未恢復(fù)時(shí)，超聲微泡溶栓仍可有效增加心肌供血，明顯減少心肌梗死面積。提示超聲微泡溶栓可促進(jìn)微循環(huán)開放，為解決急性冠狀動(dòng)脈綜合征治療過(guò)程中的無(wú)復(fù)流及慢血流提供新思路。

4 超聲微泡在心肌干細(xì)胞移植中的應(yīng)用

梗死心肌不能再生是目前心肌梗死后治療的一大難題。干細(xì)胞移植治療心肌梗死的前景日益廣闊，目前認(rèn)為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是心肌梗死再生治療的理想細(xì)胞，但由于心肌梗死后的缺血損傷、再灌注損傷、炎性因子過(guò)度表達(dá)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)內(nèi)分泌激活等導(dǎo)致心肌梗死后干細(xì)胞移植存活及分化率較低，不能滿足臨床需求。超聲微泡技術(shù)的出現(xiàn)有望提高心肌干細(xì)胞移植的成功率[37]。國(guó)內(nèi)研究證實(shí)，超聲微泡處理能促進(jìn)干細(xì)胞向心肌缺血區(qū)域歸巢，促進(jìn)毛細(xì)血管生成，改善心肌梗死后的心功能[38]。Song等[39]報(bào)道，經(jīng)超聲微泡破壞技術(shù)處理大鼠梗死心肌后，電鏡下可見血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙增寬、微血管破裂，提示微泡破壞技術(shù)可優(yōu)化移植微環(huán)境，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，超聲微泡技術(shù)處理后分化細(xì)胞明顯增多，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞形成的新生毛細(xì)血管的密度明顯增加，提示微泡破壞技術(shù)可提高移植后細(xì)胞的成活率和分化率[39]。Ling等[37]以犬為研究對(duì)象，利用不同參數(shù)靶向微泡破壞預(yù)處理梗死心肌，經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞，結(jié)果顯示，該方法增強(qiáng)了干細(xì)胞治療心肌梗死的效果，有效改善了心功能，同時(shí)得出了一組相對(duì)較佳的超聲輻照參數(shù)：頻率為1 Hz，脈沖超聲強(qiáng)度為1 W/cm2。但超過(guò)一定強(qiáng)度的超聲輻照可促使心肌細(xì)胞凋亡，因此尋找合適強(qiáng)度的超聲微泡改善移植微環(huán)境，或可提高心肌梗死干細(xì)胞移植治療的成功率。

5 超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的應(yīng)用

基因治療是將外源性基因?qū)氚屑?xì)胞，糾正或補(bǔ)償基因缺陷引起的疾病，從而達(dá)到治療目的。基因治療能從分子水平調(diào)整細(xì)胞功能，使其成為預(yù)防和治療CVD的一個(gè)具有前景的有力措施。超聲靶向微泡破壞是指利用超聲和攜帶靶基因的微泡實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)染，是目前基因轉(zhuǎn)染研究的熱點(diǎn)。靶向微泡的聲孔效應(yīng)和空化效應(yīng)能夠提高細(xì)胞膜的通透性，從而提高基因轉(zhuǎn)染的有效率。與傳統(tǒng)病毒載體相比，靶向超聲微泡能夠增加基因轉(zhuǎn)染的特異性和成功率，且具有低免疫原性、低費(fèi)用以及低系統(tǒng)毒性等特點(diǎn)。Fujii等[40]研究了超聲微泡介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染在大鼠心肌梗死模型中的治療效果，結(jié)果提示，重復(fù)使用超聲微泡介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染能有效增加新生血管數(shù)量，減少心肌梗死面積，改善左心室功能。證實(shí)質(zhì)粒DNA能通過(guò)反復(fù)超聲微泡介導(dǎo)延長(zhǎng)基因壽命。蘇強(qiáng)[41]的研究表明，超聲微泡靶向轉(zhuǎn)染技術(shù)能夠成功轉(zhuǎn)染微RNA-21至心肌細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)染基因的有效表達(dá)，并通過(guò)抑制程序性細(xì)胞死亡因子4/核因子κB/腫瘤壞死因子α信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，減少心肌炎癥反應(yīng)以改善心臟功能。Liu等[42]已成功構(gòu)建了靶向超聲微泡破壞的微RNA-21質(zhì)粒，并在豬冠狀動(dòng)脈微栓塞模型中證實(shí)，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染基因后能顯著降低凋亡相關(guān)蛋白4抗體的表達(dá)與核因子κB的活性，提高了心臟功能。超聲微泡破壞技術(shù)介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染是治療CVD的一種無(wú)創(chuàng)、安全、高效的方法[40]。

6 展望和不足

隨著對(duì)超聲微泡技術(shù)研究的深入，其在CVD診治中的優(yōu)勢(shì)也顯示出來(lái)，靶向微泡技術(shù)診斷疾病的敏感性和特異性均更高，體現(xiàn)了精準(zhǔn)醫(yī)療的理念[12]。超聲微泡技術(shù)除在高血壓腎損傷、心力衰竭、急性冠狀動(dòng)脈綜合征等疾病的診治中有實(shí)質(zhì)性進(jìn)展外，在其他CVD中也有可觀的發(fā)展前景。Hanawa等[19]的研究表明，超聲微泡輻照可有效抑制血管內(nèi)皮增生，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞凋亡，并可無(wú)創(chuàng)、有效地改善介入術(shù)后支架內(nèi)的再狹窄。Hersch和Adam[43]發(fā)現(xiàn)，結(jié)合正壓和負(fù)壓脈沖超聲輻照大鼠心臟，記錄到室性早搏的發(fā)生率為70%，提示超聲輻照有潛能成為體外起搏和除顫的新方法。

目前超聲微泡技術(shù)診治CVD大多處于基礎(chǔ)研究階段，仍存在許多亟待解決的問(wèn)題：①目前大部分疾病的靶向分子尚未明確，需要研究制備更加特異性的靶向超聲微泡，以降低對(duì)非目標(biāo)器官的影響；②盡管在動(dòng)物研究中靶向超聲微泡獲得了一些積極成果，但微泡與細(xì)胞的作用機(jī)制、具體治療方案等仍需解決；③目前微泡制備技術(shù)仍需改善，超聲微泡在體內(nèi)的穩(wěn)定性，特別是修飾后裝載藥物或基因的穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步提高；④過(guò)強(qiáng)的超聲輻照會(huì)引起心肌微血管滲漏、破裂，甚至炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，心肌細(xì)胞損傷等不良反應(yīng)；不合適的超聲輻照又無(wú)法誘發(fā)微泡破壞釋放藥物，降低基因轉(zhuǎn)染率等。因此尋找安全有效的超聲閾值迫在眉睫?？傊?，隨著超聲微泡技術(shù)的日益發(fā)展，相信能研制出穩(wěn)定性更好、靶向性更強(qiáng)、治療效果更佳的超聲微泡以滿足臨床需要，為CVD的診療帶來(lái)更多希望。