張伯陽，段秀慶

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院乳腺外科,哈爾濱 150001)

p53基因及由其編碼的p53蛋白一直被視為治療癌癥的關(guān)鍵，其不僅可通過細胞凋亡和永久不可逆的細胞衰老等方式促進癌細胞死亡，還可以參與DNA修復(fù)來抑制癌癥的形成和進展。p53基因在正常細胞的編碼、分裂和分化中起關(guān)鍵作用。但在包括乳腺癌在內(nèi)大部分的人類癌癥中，p53是突變率最高的基因[1-3]。該基因在30%～35%的浸潤性原發(fā)乳腺癌中發(fā)生突變[4]。對于乳腺癌，p53突變的概率取決于該疾病的分子亞型，其中三陰性乳腺癌患者的突變率為80%，而在管腔A型的乳腺癌患者中突變率為10%，管腔B型的乳腺癌患者為30%，人表皮生長因子受體-2過表達型乳腺癌患者為70%[4-7]?；谶@樣高的患病率，以及最近發(fā)現(xiàn)的一些化合物[PRIMA-1(p53 reactivation and induction of massive apoptosis-1)、APR-246(a methylated derivative and structural analogue of PRIMA-1)等]可以重新激活突變型p53，并使其具有野生型構(gòu)象。突變型p53很可能會成為乳腺癌，尤其是三陰性乳腺癌的生物標(biāo)志物和(或)新的治療靶點?，F(xiàn)就p53作為乳腺癌潛在生物標(biāo)志物和治療靶點的研究進展予以綜述。

1 p53突變與乳腺癌

p53是乳腺癌中最常見的突變基因。與其他癌癥一樣，絕大多數(shù)乳腺癌的p53突變屬于錯義突變，其中80%發(fā)生在p53基因的第5～8外顯子上，大約10%發(fā)生于p53基因第4外顯子上，6%發(fā)生于該基因第10外顯子上，其第2、3、9和11外顯子上則很少發(fā)生突變(<2%)[4-5]。在所有的p53基因突變中，絕大部分為單堿基取代，其余為小片段缺失和堿基插入[5-6]。突變發(fā)生的頻率與乳腺癌的組織學(xué)和生化特征相關(guān)，如導(dǎo)管型乳腺癌發(fā)生突變的頻率高于小葉型，淋巴結(jié)陽性者高于淋巴結(jié)陰性者，雌激素受體陰性者高于雌激素受體陽性者，人表皮生長因子受體-2陽性者高于人表皮生長因子受體-2陰性者[4-5]。同時，突變的發(fā)生率還取決于癌癥的分子亞型，其在三陰性乳腺癌中發(fā)生率最高，在管腔A型乳腺癌中發(fā)生率最低。而突變的類型似乎也取決于癌癥的分子亞型，相較于其他類型的乳腺癌，截短突變在BRCA1突變和三陰性乳腺癌中更為常見[7]。且p53的突變在一些乳腺癌中已被證明是克隆性的早期事件[4,8-9]。研究表明，10%～30%的導(dǎo)管原位癌存在p53突變[10-11]，且相匹配的原位癌和浸潤性癌之間的p53突變狀態(tài)具有一致性[9]。因此，乳腺癌中的p53突變可以發(fā)生在導(dǎo)管被浸潤之前。由于在同一腫瘤的原位及其鄰近的浸潤部分中發(fā)現(xiàn)了完全相同的突變，所以兩種類型的病變很可能具有共同的起源。雖然導(dǎo)管原位癌中存在p53突變，但迄今尚未在乳腺上皮增生中檢測到[11]。這一發(fā)現(xiàn)證明了p53在非侵襲性乳腺腫瘤進展中的生物學(xué)作用，同時也為其能夠作為乳腺癌生物標(biāo)志物提供了有力的證據(jù)支持。

2 突變型p53在乳腺癌診療中的作用

2.1作為乳腺癌的生物標(biāo)志物 現(xiàn)已有一些對于突變型p53基因/蛋白過度表達乳腺癌患者潛在預(yù)后及其治療效果的相關(guān)研究[12-15]。大多數(shù)早期臨床研究均使用免疫組織化學(xué)方法檢測p53蛋白，因為正常p53蛋白的半衰期很短，難以檢測，而突變基因所編碼的蛋白非常穩(wěn)定，并在癌細胞中積累。突變型p53蛋白相對于野生型具有更高的穩(wěn)定性是由多種因素導(dǎo)致，包括與穩(wěn)定蛋白(熱激蛋白90)的相互作用，突變型p53不能對雙微體基因2(具有降解p53的作用)及其翻譯后的產(chǎn)物進行誘導(dǎo)，如絲氨酸20和蘇氨酸180的磷酸化[16]。由于突變型p53蛋白更易在腫瘤細胞內(nèi)積累，所以只要通過免疫組織化學(xué)檢測到p53蛋白就表明突變存在。然而，現(xiàn)已知某些類型的突變(p53的截短突變)并不會產(chǎn)生穩(wěn)定的蛋白質(zhì)。此外，在沒有突變的情況下，野生型p53也可以產(chǎn)生穩(wěn)定的蛋白，如通過各種應(yīng)激作用[14-17]。雖然基因突變與蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性之間缺乏嚴(yán)格的一致性，但從早年研究中可以發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)檢測到的p53蛋白與不良預(yù)后相關(guān)[12]。且直接檢測到的p53基因突變也與患者不良預(yù)后相關(guān)[13-15]。

然而，評估p53基因突變或蛋白過表達患者預(yù)后的早期研究存在很多缺陷，包括回顧性設(shè)計、調(diào)查患者數(shù)量少、非均質(zhì)樣本的使用和使用不同方式的輔助治療。此外，免疫組織化學(xué)檢測采用不同的抗體檢測突變型p53，用不同的臨界值將免疫組織化學(xué)評分高與低的患者分離開。一項大型隨機對照試驗回顧性研究了p53基因突變或蛋白過表達對乳腺癌患者預(yù)后的影響。其中一份報告，對參與兩項隨機試驗(國際乳腺癌研究小組試驗Ⅷ和Ⅸ)的1 113例淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者進行了p53檢測，并分別對行內(nèi)分泌治療和化療聯(lián)合內(nèi)分泌治療患者的預(yù)后進行對比[18]。結(jié)果顯示，雌激素受體陽性伴p53蛋白高表達患者的預(yù)后較差，而雌激素受體陰性伴p53蛋白高表達患者的預(yù)后良好。上述試驗證明，p53的表達與無病生存期和總生存期之間的關(guān)系似乎依賴于雌激素受體的狀態(tài)，雖然其具體機制尚不清楚，但卻為p53作為生物標(biāo)志物來預(yù)測患者的預(yù)后提供了有力證據(jù)。

另一項Ⅲ期臨床試驗[CALB(cancer and leukemia group B)9344]顯示，淋巴結(jié)陽性患者的高p53蛋白水平預(yù)示輔助使用環(huán)磷酰胺和阿霉素或單獨使用阿霉素預(yù)后更差[19]。在歐洲癌癥研究與治療組織10994試驗中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)存在p53突變的患者在使用蒽環(huán)類或紫杉烷類方案治療后預(yù)后較差[20]。且在這項試驗中，p53的突變狀態(tài)無法從基于紫杉烷的治療和基于蒽環(huán)類的治療方案中選擇出優(yōu)先受益的患者。此外，在 BIG(breast international group)02-98Ⅲ期臨床試驗中，突變型p53對淋巴結(jié)陽性接受阿霉素有或沒有多西紫杉醇的患者缺乏預(yù)測能力[21]。以上試驗說明，p53對化療患者的預(yù)后有一定的預(yù)測作用，但在治療方案的選擇上尚存在爭議。

Silwal-Pandit等[5]使用完整的外顯子組測序方法將是否存在p53突變與患者的預(yù)后聯(lián)系起來。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有患者中，突變型p53的存在與特定的乳腺不良事件和總生存率相關(guān)。而只有特定分子分型的預(yù)后受突變影響，如人表皮生長因子受體-2過表達型和管腔B型乳腺癌死亡率的增加與突變型p53有關(guān)，而管腔 A型乳腺癌不受影響[5]。Fountzilas 等[22]報道，p53突變可以預(yù)示管腔A/B型乳腺癌和三陰性乳腺癌患者的不良預(yù)后，而不能預(yù)示人表皮生長因子受體-2過表達型乳腺癌患者的不良預(yù)后。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，p53突變的存在預(yù)示了曲妥珠單抗治療的收益[22]。因此，p53能否預(yù)測不同分子分型乳腺癌患者的預(yù)后尚存在爭議。

目前，不推薦根據(jù)p53基因的突變狀態(tài)或免疫組織化學(xué)測量出的蛋白質(zhì)結(jié)果來確定乳腺癌患者的預(yù)后或預(yù)測藥物療效。雖然突變的存在與不良結(jié)果有關(guān)，但這一結(jié)論可能僅限于特定分子亞型的乳腺癌患者或接受特定治療方式的患者且存在爭議。此外，不同的p53突變在乳腺癌的形成和進展中有不同的作用，因此其可能在預(yù)測患者的預(yù)后和(或)治療效果方面產(chǎn)生不同的影響。然而，使突變型p53作為乳腺癌生物標(biāo)志物并通過其預(yù)測患者預(yù)后的難點為其存在不同的分子亞型和旁系同源物[23]。如存在p53γ的乳腺癌患者，與野生型p53的患者具有相似的總生存期[24]。另有研究發(fā)現(xiàn)，p53β的表達對突變型p53腫瘤患者具有保護作用[25]。

2.2作為乳腺癌的治療靶點 作為乳腺癌的治療靶點，突變型p53具有幾個重要特征。①p53是乳腺癌中最常發(fā)生突變的基因。與雌激素受體/孕激素受體陽性或人表皮生長因子受體-2陽性乳腺癌患者不同，三陰性乳腺癌患者缺乏有效的靶向治療[26]。由于缺乏靶向治療及三陰性乳腺癌本身的強侵襲性，三陰性乳腺癌患者的預(yù)后往往較差。②在將近90%的乳腺癌腦轉(zhuǎn)移患者中存在p53突變[27]。對于轉(zhuǎn)移至該器官的患者，目前沒有有效治療方法。③在某些乳腺癌中，p53的突變通過克隆存在于乳腺癌所有惡性細胞中。因此，克隆突變是比亞克隆或分支突變更好的癌癥治療靶點[8]。雖然從理論上講，p53是治療癌癥的一個有效靶點，但突變型p53一直沒有相關(guān)的有效靶向藥物。然而這種情況正在發(fā)生改變，因為最近已有一些化合物被證明可以重新激活突變型p53，恢復(fù)其野生型特性，并誘導(dǎo)臨床前腫瘤模型中表達的突變型p53，使其具有抗癌活性[28-30]。這些化合物，如3-奎寧環(huán)酮衍生物、PRIMA-1、APR-246、PK11007、PK7088、COTI-2(critical outcome techonologies inc)等可以使突變型p53再次活化，現(xiàn)已被應(yīng)用于乳腺癌臨床前模型進行潛在的抗癌活性研究。

3 突變型p53的潛在靶向藥物

3.1PRIMA-1和APR-246 PRIMA-1是在篩選低分子量化合物庫(美國國家癌癥研究所多樣性分集)后確定，因為它能恢復(fù)突變型p53的野生型特性[31]。在測試的大約2 000種化合物中，發(fā)現(xiàn)名為PRIMA-1的化合物可以恢復(fù)突變p53蛋白的野生型特性，如序列特異性的DNA結(jié)合和誘導(dǎo)細胞凋亡的能力[31]。PRIMA-1通過添加一個甲基來使其促細胞凋亡活性和細胞膜通透性增強，從而產(chǎn)生了化合物PRIMA-1 MET即APR-246[32]。Liang等[33]最早發(fā)現(xiàn)，PRIMA-1能抑制突變型p53乳腺癌細胞的生長。且他們認為，PRIMA-1能抑制突變型p53細胞系(BT-474、HCC-1428和T47-D)的活力，但對表達野生型p53的細胞系(MCF-7細胞、正常乳腺細胞或內(nèi)皮細胞)的活力沒有影響。通過特異性構(gòu)象的p53抗體熒光染色顯示，PRIMA-1可以將突變型p53轉(zhuǎn)化為其野生型構(gòu)象[33]?？梢姡瑢δ[瘤生長的抑制似乎是通過誘導(dǎo)細胞凋亡、抑制血管內(nèi)皮生長因子和誘導(dǎo)雌激素受體β實現(xiàn)。

與PRIMA-1相似，APR-246在臨床前模型中也被證明可以抑制乳腺癌細胞的增殖，同時癌細胞對APR-246的反應(yīng)與突變型p53或高內(nèi)源性p53蛋白水平顯著相關(guān)，而APR-246的反應(yīng)與雌激素受體狀態(tài)、人表皮生長因子受體-2狀態(tài)或所研究的細胞系的分子亞型無關(guān)[34]，表明突變型p53或高水平的p53蛋白可能是癌細胞對APR-246是否有反應(yīng)的預(yù)測生物標(biāo)志物，且很少受其他因素影響。除抑制細胞增殖外，APR-246還可誘導(dǎo)突變型p53乳腺癌細胞系的細胞凋亡和減少其遷移[34]。

APR-246與突變型p53結(jié)合并重新激活突變型p53的能力得到證實，同時它也被發(fā)現(xiàn)能激活其旁系同源基因(p63和p73)[35-36]。此外，APR-246與幾種臨床使用的抗癌化合物類似[37]，其被證明可以減少谷胱甘肽的形成并增加活性氧的產(chǎn)生[38-39]。然而，APR-246在減少細胞谷胱甘肽方面較多種細胞毒性藥物(紫杉醇、表柔比星、順鉑、伊立替康和5-氟尿嘧啶等)更有效[39]。因此，APR-246可通過多種機制誘導(dǎo)其自身抗癌作用。

雖然尚未在乳腺癌患者中進行調(diào)查，但APR-246已在血液系統(tǒng)惡性腫瘤和前列腺癌患者中進行了Ⅰ期臨床試驗[40]。據(jù)報道在這項早期臨床試驗中，APR-246耐受性良好，最常見的不良反應(yīng)為疲勞、頭暈、頭痛和意識模糊。

可見，PRIMA-1和APR-246不僅能特異性地抑制突變型p53細胞系來源的乳腺癌細胞的生長，還具有多種抗癌機制及不良反應(yīng)較少等特點。這些特點充分地顯示了其作為突變型p53靶向藥物的潛力。

3.2PK7088 與PRIMA-1和APR-246重新激活不同形式的突變型p53蛋白不同，吡唑類化合物PK7088能與Y220C突變的p53蛋白結(jié)合。Y220C突變會使p53蛋白的表面產(chǎn)生一個裂縫，破壞其穩(wěn)定性，而PK7088可以附著在這個裂縫上[41]。PK7088與Y220C突變的蛋白結(jié)合可以提高其熔點。熔點的提高導(dǎo)致突變型p53蛋白折疊的增加，從而使其具有野生型構(gòu)象，并恢復(fù)其一些野生型的轉(zhuǎn)錄活性。同時，PK7088結(jié)合Y220C突變的細胞后，p53靶基因、p21和NOXA的表達增加，從而使細胞周期阻滯并誘導(dǎo)細胞凋亡。然而，其潛在抗癌活性還需進一步研究。

3.3PK11007 另一種用于研究抗乳腺癌細胞活性的抗p53化合物是2-磺胺嘧啶分子PK11007。與APR-246一樣，PK11007能穩(wěn)定并重新激活突變型p53[42]。它們的另一個相似之處為能提高活性氧形成的能力[42]。與APR-246重新激活突變型p53的能力一樣，相較于野生型p53乳腺癌細胞系，PK11007被證明能優(yōu)先誘導(dǎo)突變型p53乳腺癌細胞的凋亡并抑制其生長和遷移[43]。另有研究發(fā)現(xiàn)，PK11007對TN細胞系生長抑制的敏感性高于非TN細胞系[42]。但迄今為止，PK11007還沒有在動物模型中進行抗癌活性測試。

3.4COTI-2 COTI-2是通過CHEMSAS?的專有計算平臺發(fā)現(xiàn)的一種縮氨基硫脲化合物。CHEMSAS?采用藥理學(xué)方法統(tǒng)計建模，藥物化學(xué)和機器學(xué)習(xí)相結(jié)合的方法來鑒定抗癌化合物[44]。臨床前研究表明，COTI-2對廣泛的癌癥細胞系和異種移植模型均具有抗癌活性，包括MDA-MB-231乳腺癌細胞系的異種移植模型[44]。據(jù)Salim等[44]報道，在所研究的動物模型中，COTI-2具有良好的耐受性，沒有明顯的患病率或體重下降表現(xiàn)。雖然COTI-2似乎通過重新激活突變型p53和抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白信號通路發(fā)揮作用。但有關(guān)于COTI-2的具體作用機制仍需進一步研究。

4 小 結(jié)

雖然突變型p53作為乳腺癌生物標(biāo)志物的潛力已被廣泛研究，但突變蛋白的測定尚未應(yīng)用于臨床。且針對不同突變類型p53特異性抗體的應(yīng)用[45]將讓人們對突變型p53生物標(biāo)志物潛力的研究愈發(fā)重視。與其作為生物標(biāo)志物的作用相反，最近人們才開始將突變蛋白作為治療乳腺癌的靶點。最近鑒定出的幾種能夠重新折疊并重新激活突變蛋白的化合物，將會增加人們對作為靶點的突變型p53的研究。因此，重新激活突變型p53對三陰性乳腺癌患者可能尤為重要。未來，需進一步確定PRIMA-1、APR-246、PK11007、PK7088和COTI-2等藥物對不同p53突變及與非p53蛋白結(jié)合的有效性。