楊大賀 鄧炎春 楊卅 侯春生 刁青云

（1 中國農業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093；2 中國農業(yè)科學院研究生院， 北京 100081）

1 引言

蜜蜂是自然界重要的授粉昆蟲，對生態(tài)系統(tǒng)的平衡及生物多樣性具有重要意義。近年來，蜜蜂健康及蜂群的大量損失越來越受到國際社會的關注[1]。其中，威脅蜜蜂健康的主要因素有新煙堿類農藥、蜂螨、細菌病、真菌病及病毒病[2]。蜜蜂常見的病毒病主要是單鏈正義RNA病毒，已報道的能感染蜜蜂的RNA病毒超過了30種，如常見的IAPV（Israeli acute paralysis virus）、BQCV（black queen cell virus）、DWV（deformed wing virus）、SBV（sacbrood virus）等[3]，而針對DNA病毒（如蜜蜂絲狀病毒）現(xiàn)有的研究較少。目前，只有少量文獻報道了蜜蜂絲狀病毒（AmFV）。AmFV具有囊膜，絲狀核衣殼長約3150×40nm，包裹在一個大小為450×170nm的桿狀粒子中[4]。Gauthier等人[5]在2015年報道了AmFV全序列，其全長具有約498500個核苷酸，編碼247個非重復閱讀框。對基因組信息分析后發(fā)現(xiàn)，其中的13個開放閱讀框與桿狀病毒口服感染因子（pifs）具有較高的相似性。AmFV在歐洲意大利蜜蜂上發(fā)現(xiàn)報道后，中國也在意蜂和其本土蜂種中華蜜蜂上發(fā)現(xiàn)[6]，并且廣泛分布于意蜂蜂群，大部分以隱性感染為主[7]。AmFV流行廣泛，幾乎在蜂群中無處不在，蜂王、雄蜂、工蜂及其不同發(fā)育歷期和食物中均能檢測到AmFV。雖然AmFV似乎對蜜蜂沒有明顯的致病癥狀，但是其在蜂群中流行及傳播的機制還不清楚。

因此，本研究擬對其他授粉蜂如野生中華蜜蜂、熊蜂及黑小蜜蜂感染蜜蜂絲狀病毒的情況進行調查，以期進一步了解絲狀病毒在不同授粉昆蟲的發(fā)生與分布。

2 材料與方法

2.1 實驗材料與設備

本實驗中的中華蜜蜂采自廣東省，歐洲地熊蜂采自北京市，中國意蜂樣本來自湖北和山東省，韓國意蜂來自韓國安東地區(qū)，黑大蜜蜂、黑小蜜蜂和無刺蜂樣品來自云南昆明。所有蜂樣本均為采集蜂，無明顯可見蜜蜂疾病癥狀。

實驗試劑：檢測所用的PCR酶為南京諾唯贊2×Taq Master Mix，瓊脂糖膠為Lowest Regular Agarose G-10（上海貝晶生物技術有限公司），DNA maker（DL5000與DL15000）來自Takara公司，平末端克隆試劑盒（CV16-Zero Background pTOPO-Blunt Cloning Kit）購自北京艾德萊生物科技公司，膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購自Omega Bio-tek生物公司（武漢）。引物合成及樣品測序送至上海生工生物科技有限公司（武漢分公司）進行測序。

表1 實驗中用到的主要儀器信息

2.2 實驗方法

基因組DNA提?。喝?～2只蜜蜂加入1ml細胞裂解液，加入小鋼珠在組織破碎儀上研磨，加入20μl（500μg/ml）蛋白酶K，65℃水浴30min。12000rpm，離心5min，取上清。加入等量（約600μl）酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）混合液（這個溶液是成品），混勻，12000rpm，5min。取上清加入等體積氯仿，混勻靜置3min，12000rpm，離心5min，取上層溶液。加入2倍體積乙醇，室溫2min，12000rpm，10min，棄去上清。加入1ml 70%乙醇，12000rpm，離心5min，棄去上清。室溫風干10min，乙醇一定要揮發(fā)干凈。加入100μl DDW，65℃溶解10min（要看最后沉淀量的多少，一般都會很多，就加DDW 100μl，如果最后沉淀量很少，就先加20μl，測濃度）。

圖1 鑒定不同蜂種感染AmFV

PCR擴增目的片段：實驗過程中所用的檢測引物[5]，正向引物F：CAGAGAATTCGGTTTTTGTGAGTG，反向引物R：CATGGTGGCCAAGTCTTGCT，片段大小約為550bp。檢測AmFV的PCR反應條件為：預變性，95℃，3min，變性95℃，15s，退火，55℃，15s，延伸72℃，15s，總延伸，72℃，5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察其目的片段。

表2 不同蜂種AmFV感染率

3 實驗結果

3.1 多種蜂AmFV感染的鑒定

AmFV目的片段PCR擴增產物經凝膠電泳分析，在550bp左右可見清晰特異性條帶，如圖1。發(fā)現(xiàn)中國的中華蜜蜂、意大利蜜蜂，韓國的意大利蜜蜂、熊蜂和黑小蜜蜂均感染了AmFV。

3.2 不同蜂種AmFV的感染率

為了進一步了解不同種蜂攜帶AmFV的潛在風險，本實驗對所采集的蜂樣進行單只檢驗，分別計算其總體感染率。發(fā)現(xiàn)意大利蜜蜂感染率最高，達90%，黑小蜜蜂感染率達80%，即使感染率最低的熊蜂也達到40%。表明AmFV不僅在規(guī)?；淙褐谐霈F(xiàn)，野生授粉蜂也已受到感染。

4 討論

本研究首次報道了我國野生蜂種，如黑小蜜蜂、熊蜂感染AmFV，表明AmFV的感染已經向野生種群擴散。雖然目前未檢測到黑大蜜蜂和無刺蜂感染AmFV，但是由于樣本量的有限，并不代表這兩個蜂種沒有感染AmFV。另外，由于大多情況下AmFV建立的是隱性感染，不產生明顯的疾病癥狀，不易發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)時已造成嚴重損害。因此，進一步監(jiān)測野生授粉昆蟲的感染情況是很有必要的。

本實驗通過檢測膜翅目蜜蜂科的昆蟲樣品，如熊蜂、黑小蜜蜂等昆蟲，不僅在中蜂和意蜂中發(fā)現(xiàn)了AmFV病毒的存在，而且在熊蜂、黑小蜜蜂中也發(fā)現(xiàn)AmFV存在，表明AmFV在膜翅目昆蟲中具備一定的感染傳播能力。蜜蜂的RNA病毒宿主較多，比如IAPV等其他病毒可在蜂螨、螞蟻、蠟螟、小甲蟲等中檢測到[8,9]，這說明其具備一定的跨宿主傳播能力，但是否能夠在這些載體中檢測到還需進一步研究。同時，本研究也未檢測其他蜜蜂病蟲害，例如蜜蜂微孢子蟲。研究表明，蜜蜂微孢子蟲對AmFV的流行與發(fā)生具有重要的推動作用，能夠使AmFV的隱性感染變成顯性感染，從而進一步危害蜂群的健康發(fā)展[10]。目前，對AmFV的流行性已經有了初步了解，但是有關其致病性、傳播性及其與宿主關系的研究還很少。這種DNA病毒究竟如何與宿主相互作用，并且對宿主免疫有何影響，值得進一步深入研究。

致謝

非常感謝韓國安東大學的Chuleui Jung教授提供韓國蜜蜂樣本，感謝他在取樣過程及部分研究內容方面的建議。