陳林中日 ， 殷冬來(lái) ， 趙澤婷 ， 韋芊含 ， 陳 昕 ， 張雨梅 ，2

(1. 揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院， 揚(yáng)州 225009;2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心， 揚(yáng)州 225009)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是血管生成、血管新生中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[1]。VEGF與其受體(VEGFR)特異性結(jié)合， 能調(diào)節(jié)血管發(fā)生、形成， 參與造血以及淋巴管生成，也能通過(guò)改變腫瘤內(nèi)環(huán)境而增加毛細(xì)血管通透性[2]。新血管的形成是腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的一種基本活動(dòng)。腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移依賴于腫瘤血管的新生， 且腫瘤細(xì)胞分泌VEGF。由于VEGF及VEGFR途徑在腫瘤血管生成中的中心作用，已成為腫瘤學(xué)領(lǐng)域藥物研發(fā)和基礎(chǔ)研究的焦點(diǎn)[3]。近幾年，VEGF家族成員及其相關(guān)的通路被認(rèn)為是實(shí)體腫瘤重要的抗血管治療靶點(diǎn)[4]。

RNA干擾(RNAi )是一種能特異性使得序列在轉(zhuǎn)錄后沉默的技術(shù)，具有高度特異性、高效性、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)。其方法是將外源雙鏈小分子RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，通過(guò)與目的基因mRNA特異性結(jié)合并使其降解，從而使目的基因表達(dá)降低，該技術(shù)廣泛用于基因功能的研究[5]。本文根據(jù)大鼠Vegfa、Vegfr的基因序列，設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的小干擾RNA(siRNA)， 轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞， 通過(guò)RT-PCR和Western blot檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF及VEGFR的表達(dá)，篩選出有效沉默Vegf/Vegfr基因的siRNA序列，為進(jìn)一步應(yīng)用靶向Vegf/Vegfr基因RNA干擾抗血管生成的研究奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)6周齡雄性Wistar大鼠， 體質(zhì)量180 g左右。揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供[SCXK(蘇)2017-0004]，飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)中[SYXK(蘇)2017-0044]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及研究方案獲揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑

DMEM、Opti-MEM培養(yǎng)基， 美國(guó)Gibco公司;胎牛血清(FBS)， 美國(guó)Hyclone公司; 重組大鼠VEGF165， 美國(guó) Peprotech 公司; EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑，北京英格恩生物公司; 兔抗大鼠VEGF多克隆抗體、小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體、HRP標(biāo)記IgG， 武漢博士德生物有限公司; 青鏈霉素、明膠、胰蛋白酶、兔抗大鼠FLK1多克隆抗體、兔抗大鼠FLT1多克隆抗體， 上海生工生物工程有限公司; BCA蛋白溶度測(cè)定試劑盒、PMSF、RIPA強(qiáng)蛋白裂解液、BSA粉、Tris-base、SDS、Tween-20、30%丙烯酰胺、TEMED、過(guò)硫酸胺等， 碧云天生物有限公司; PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、DL1000 DNA Marker、RNA提取試劑盒，TaKaRa (大連寶生物)公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

Leica DM3000倒置顯微鏡，德國(guó)Leica公司;Synergy小型純水系統(tǒng)、0.22 mm Millex-GP過(guò)濾器，美國(guó)默克密理博公司; 多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)BioTek公司; PCR儀、Proteah電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司; THZ-82A搖床，金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠; 細(xì)胞培養(yǎng)板，丹麥Corstar Corning公司。

1.4 方法

1.4.1 靶向Vegf/Vegfr基因siRNA序列的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI中大鼠Vegf-a ID-83785、Flt1(Vegfr1) ID-54251、Flk1 (Vegfr2) ID-25589基因序列，由上海吉瑪生物有限公司分別設(shè)計(jì)合成三條候選siRNA序列，以及一條與目的基因序列無(wú)同源性的陰性對(duì)照序列(NC)，和帶有5-羧基熒光法(FAM)熒光標(biāo)記的陰性siRNA序列(表1)。

1.4.2 大鼠內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離、純化及鑒定方法參照文獻(xiàn)[8]。Wistar大鼠的胸主動(dòng)脈分離、清洗后， 用手術(shù)刀切成1 mm×1 mm的血管塊， 移至鋪好明膠的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中， 使得血管內(nèi)膜貼壁，加入1 mL的完全培養(yǎng)基后， 置于37 ℃，體積分?jǐn)?shù)5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后于倒置顯微鏡下觀察，待有星形的內(nèi)皮細(xì)胞遷出并生長(zhǎng)良好時(shí)，棄去植塊。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí)，棄去原培養(yǎng)基并用PBS洗2遍后，加0.25%胰蛋白酶1 mL，用差速消化法[8]去除雜細(xì)胞，終止消化，制成單細(xì)胞懸液后分瓶培養(yǎng)。經(jīng)CD31免疫組化鑒定為血管內(nèi)皮細(xì)胞后收集第3代血管內(nèi)皮細(xì)胞用于以下的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 siRNA轉(zhuǎn)染條件的篩選 將細(xì)胞密度調(diào)整為5×104個(gè)/mL的內(nèi)皮細(xì)胞接種于24孔板中，每孔400 μL。次日分別取50 nmol/L， 80 nmol/L， 100 nmol/L的FAM標(biāo)記的陰性siRNA加入50 μL的opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基混勻， 制成RNA稀釋液; 分別取0.4 μL，0.5 μL， 1.0 μL的EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑，加入50 μL的opti-MEM無(wú)血清培養(yǎng)基充分混勻制成EntransterTM-R4000稀釋液。將EntransterTM-R4000稀釋液和RNA稀釋液進(jìn)行單因素交叉試驗(yàn)篩選轉(zhuǎn)染復(fù)合物的條件。將100 μL的轉(zhuǎn)染復(fù)合物滴加到400 μL的完全培養(yǎng)基中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后6 h，棄去孔內(nèi)培養(yǎng)基，PBS洗3遍后，于倒置熒光顯微鏡下觀察熒光情況，確定轉(zhuǎn)染效率。同時(shí)以未轉(zhuǎn)染組(只加siRNA)作為陰性對(duì)照組。根據(jù)綠色熒光數(shù)確定轉(zhuǎn)染效率較好的轉(zhuǎn)染條件。

表1 靶向大鼠Vegf/Vegfr 基因siRNA序列及陰性對(duì)照序列Table 1 The siRNA sequences target on rat Vegf/Vegfr genes and negative control

1.4.4 靶向大鼠Vegf/Vegfr siRNA的轉(zhuǎn)染 根據(jù)

1.4.3 中確定的轉(zhuǎn)染條件， 以及24孔板與6孔板表面積的換算， 確定在6孔板中向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染Vegf/Vegfr siRNA的條件為： 6孔板中細(xì)胞數(shù)為1.4×104個(gè)/孔，使用100 nmol/L的siRNA與2.5 μL的轉(zhuǎn)染試劑混合進(jìn)行轉(zhuǎn)染。試驗(yàn)分組如下： 正常組、只加轉(zhuǎn)染試劑組(mock 組)、Vegf siRNA 組(si1157、si1263，、si1323)、Flt1 siRNA 組(si326、si2703、si3365)和Flk1 siRNA組(si1046、si1292、si1406)。于轉(zhuǎn)染后24h檢測(cè)細(xì)胞中Vegf/Vegfr的mRNA水平; 轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行細(xì)胞中VEGF/VEGFR蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

1.4.5 靶基因沉默效應(yīng)檢測(cè)

1.4.5.1 Western blot檢測(cè)VEGF/VEGFR的表達(dá) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞后48 h，加入含有PMSF蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液于冰上裂解細(xì)胞2 min后，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞裂解產(chǎn)物，12 000 r/min 4 ℃離心10 min，小心吸取上清即為蛋白樣品。按BCA蛋白濃度試劑盒的說(shuō)明書(shū)，測(cè)定樣品中的蛋白濃度并調(diào)整至相同。加入6×上樣緩沖液(loading buffer)，沸水浴煮沸10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳中，VEGF的分離采用5%濃縮膠和10%分離膠；FLT1和FLK1的分離采用5%的濃縮膠和8%的分離膠。待測(cè)樣品加樣15 μL，80 V恒壓電泳約30 min，當(dāng)溴酚藍(lán)前緣進(jìn)入分離膠后電壓提到110 V至結(jié)束。300 mA恒流120 min進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后，5%BSA室溫封閉2 h，分別加入TBST稀釋的VEGF，F(xiàn)LK1，F(xiàn)LT1及β-actin一抗(β-actin，VEGF抗體1∶300稀釋;FLT1和FLK1抗體1∶800稀釋)，4℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗滌，100 r/min， 5 min×5次。加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h。TBST洗滌，100 r/min，5 min×5次。然后加入ECL發(fā)光液，置凝膠成像系統(tǒng)拍照。使用Image J軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析。

1.4.5.2 RT-PCR檢測(cè)Vegf/Vegfr的mRNA水平 根據(jù)NCBI中大鼠Vegf、Flk1、Flt1、β-actin基因序列，使用premier5.0軟件設(shè)計(jì)PCR引物，引物序列由上海生工生物有限公司合成。引物序列及產(chǎn)物片段大小如表2。

內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染后24 h，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次后加入350 μL的裂解Buffer RL(加入50 ×DTT Solution)，按RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，將裂解液轉(zhuǎn)移到gDNA Eraser Spin Column中，12 000 r/min離心1 min; 向2 mL Tube中加入等體積的70%乙醇使溶液混合均勻。將混合液轉(zhuǎn)到RNA Spin Column 中， 12 000 r/min 離心 1 min， 棄濾液。將RNA Spin Column放回到2 mL Collection Tube中。將400 μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中， 12000 r/min 離心 30 s， 棄濾液。將 400 μL 的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中， 12000 r/min離心30 s， 棄濾液。在RNA Spin Column膜中央處加入50 μL的不含RNase的蒸餾水室溫靜置5 min，12 000 r/min離心2 min，收集RNA。取1.0 μL RNA溶液，于260 nm和280 nm處測(cè)定吸光度(A)值，并計(jì)算A260/A280，檢測(cè)RNA的純度。并調(diào)節(jié)各樣品中RNA濃度保持一致。

表2 RT-PCR擴(kuò)增Vegf/Vegfr的引物Table 2 Primers of RT-PCR for Vegf/Vegfr genes

利用TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA， 預(yù)變性反應(yīng)體系為及dNTP Mixture(10 mmol/L)1.0 μL，Oligo Primer(5 μmol/L) 1.0 μL，模板 RNA 600 ng，不含RNase蒸餾水加至10 μL。 cDNA合成條件為上述變性后反應(yīng)液10 μL， 5×Prume ScriptⅡBuffer 4.0 μL， Prime ScriptⅡRTase 0.5 μL (20U)，RNase Inhibitor (40μ/ μL) 1.0 μL，不含 RNase蒸餾水加至 20 μL。

RT- PCR反應(yīng)體系為25 mL，正反向引物各0.5 μL， dNTP 2.0 μL， 酶 0.15 μL， 10 × buffer 2.5 μL，DNA 模板 1.0 μL， 蒸餾水 18.35 μL。RT-PCR 反應(yīng)條件為95 ℃，5 min; (95 ℃，30 s; 56 ℃，40 s;72 ℃，45s)× 35; 72 ℃，5 min。RT-PCR 反應(yīng)產(chǎn)物4℃保存。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用 Graph Pad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果均以x- ± s表示。One-way ANOVA 用于顯著性分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 靶向vegf/vegfr基因siRNA對(duì)大鼠內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染條件的篩選

FAM標(biāo)記的陰性siRNA在轉(zhuǎn)染6 h后的部分圖片見(jiàn)圖1。正常未轉(zhuǎn)染組在熒光顯微鏡下無(wú)熒光，而100 nmol/L siRNA與0.5 μL或1.0 μL轉(zhuǎn)染試劑時(shí)， 相比較于其他組合其熒光亮度及具有熒光細(xì)胞數(shù)較多， 轉(zhuǎn)染效率較好(圖1D，E)。選擇100 nmol/L siRNA與0.5 μL轉(zhuǎn)染試劑的組合為正式試驗(yàn)的轉(zhuǎn)染條件，用于以下目的基因的轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。

2.2 蛋白水平篩選siRNA有效沉默序列

從圖2可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染Vegf siRNA的三條siRNA序列(si1157， si1263， si1323)都對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中 VEGF蛋白的表達(dá)起到了極顯著的沉默效果(P＜0.001)。對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的抑制率，si1157約48%，si1263約60%，si1323達(dá)69%，si1323序列對(duì)VEGF蛋白表達(dá)的沉默效果最好。轉(zhuǎn)染試劑組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

轉(zhuǎn)染Flt1 siRNA的三條序列中，si326與si3365序列對(duì)FLT1蛋白的表達(dá)起到了明顯的抑制作用，而si2703序列對(duì)FLT1蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。si326序列對(duì)FLT1表達(dá)的沉默效率約27%， si3365序列達(dá)70%，si3365序列對(duì)FLT1蛋白表達(dá)的沉默效率最好。轉(zhuǎn)染試劑組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

轉(zhuǎn)染Flk1 siRNA的三條序列中，si1292序列和si1406序列對(duì)FLK1蛋白的表達(dá)起到了顯著的抑制作用(P＜0.01)，沉默效率si1292約62%，si1406序列約33%，si1292序列對(duì)FLK1蛋白表達(dá)的沉默效率最好。si1046序列對(duì)FLK1的表達(dá)無(wú)明顯影響，轉(zhuǎn)染試劑組與對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 mRNA水平篩選siRNA有效沉默序列

從圖3可見(jiàn)，轉(zhuǎn)染Vegf siRNA的三條siRNA序列(si1157，si1263，si1323)中，si1263和si1323都對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞中Vegf mRNA表達(dá)起到了極顯著的沉默效果(P＜0.001)。對(duì)Vegf基因表達(dá)的沉黙效率，si1263約47%，si1323序列達(dá)51%，si1323序列對(duì)Vegf mRNA表達(dá)的沉默效果最好，與正常組相比差異極顯著(P＜0.001)。

轉(zhuǎn)染Flt1 siRNA的三條序列(si326，si2703，si3365)中，si2703序列與si3365對(duì)Flt1基因的表達(dá)起到了沉默效果。對(duì)Flt1 mRNA表達(dá)的沉默效率，si2703約16%，si3365序列達(dá)71%。si3365序列對(duì)Flt1基因表達(dá)的沉默效率最好，與正常組相比差異極顯著(P＜0.001)。

轉(zhuǎn)染Flk1 siRNA的三條序列(si1046，si1292，si1406)中，只有si1292序列對(duì)Flk1基因的表達(dá)起到了極顯著的沉默效果(P＜0.001)。

3 討論

靶向大鼠Vegf/Vegfr基因的siRNA序列，轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞的最佳轉(zhuǎn)染條件為100 nmol/L siRNA與0.5 μL的轉(zhuǎn)染試劑組合。篩選出可以有效沉默Vegf基因的兩條siRNA序列si1263和si1323，其中si1323序列的沉默效果更好; 靶向Flt1 基因的si3365可以有效沉默F(xiàn)lt1，而靶向Flk1 基因的si1292可以有效沉默F(xiàn)lk1基因。篩選出的靶向大鼠Vegf及Vegfr基因的siRNA有效序列，可作為血管生成及血管生成相關(guān)因子研究中的一種有效工具，為應(yīng)用RNAi技術(shù)進(jìn)行Vegf/Vegfr基因沉默研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖1 不同劑量siRNA與轉(zhuǎn)染試劑的轉(zhuǎn)染效率Figure 1 Transfection effect of different dose siRNA and transfection reagent

圖2 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VEGF/VEGFR的表達(dá)Figure 2 Western blot analysis for VEGF/VEGFR in endothelial cells transfected

圖3 RT-PCR檢測(cè)Vegf/Vegfr mRNA水平Figure 3 The mRNA levels of Vegf/Vegfr genes detected by RT-PCR

RNA干擾是一種在進(jìn)化過(guò)程中存在的高度保守、由雙鏈RNA分子誘發(fā)同源mRNA高效特異性降解的基因轉(zhuǎn)錄的沉默現(xiàn)象[7]。其中21-23nt的siRNA是RNAi中的關(guān)鍵因子[8]。由于RNAi具有高度特異性、可遺傳性、高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子機(jī)制研究。

RNAi提供了一種高效、方便、經(jīng)濟(jì)的干擾特異性基因表達(dá)的研究手段，并逐步發(fā)展成為腫瘤基因治療、遺傳性疾病治療的重要方法。但隨著研究的深入，許多研究表明并不是所有針對(duì)靶基因mRNA序列隨機(jī)設(shè)計(jì)的siRNA都能起到有效的基因沉默，因此干擾靶序列的選擇至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)由上海吉瑪針對(duì)大鼠Vegf/Vegfr基因設(shè)計(jì)3條siRNA序列，以確保至少有一條siRNA能夠高效抑制靶基因的表達(dá)。同時(shí)設(shè)計(jì)一條陰性對(duì)照siRNA序列，并使用FAM熒光標(biāo)記的陰性siRNA作為“陽(yáng)性對(duì)照”觀察轉(zhuǎn)染效率，篩選出轉(zhuǎn)染效率最高，細(xì)胞毒性最小的EntransterTM-R4000轉(zhuǎn)染試劑的量(0.5μL)和siRNA的溶度(100 nmol/L)。使用轉(zhuǎn)染試劑將靶向Vegf/Vegfr基因的siRNA按照篩選出的最佳終溶度100 nmol/L轉(zhuǎn)染大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)RT-PCR及Western blot方法檢測(cè)mRNA水平和蛋白水平的沉默效果。結(jié)果表明靶向Vegf基因的3條siRNA序列中si1263和si1323序列對(duì)靶Vegf基因的沉默效果最佳; 靶向Flt1基因的3條siRNA序列中si3365序列沉默效果最佳; 靶向Flk1基因的3條siRNA序列中si1292序列干擾效果最好。