毛建才，王豪杰，李俊華，翟文強

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】喀什地區(qū)光熱資源豐富，平原地區(qū)平均無霜期215 d，小麥?zhǔn)崭詈筮m合復(fù)播甜瓜生產(chǎn)。傳統(tǒng)上復(fù)播甜瓜在6月底到7月上旬播種，9月底到10月上旬采收，果實不僅品質(zhì)好且非常耐貯。由于復(fù)播甜瓜的銷售價格高于正播甜瓜(7月下旬到8月上旬上市)2～4倍。但近年由于病毒病危害，常規(guī)方法已無法種植復(fù)播甜瓜，研究通過改進栽培模式，研究喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病的防疫，對甜瓜抗病育種有實際意義?！厩叭搜芯窟M展】關(guān)于新疆甜瓜病毒病的報道僅限于正播甜瓜，對于復(fù)播甜瓜病毒病的種類及優(yōu)勢病毒尚沒有報道。到目前為止，引起正播甜瓜病毒病的主要是黃瓜花葉病毒(CMV)、西瓜花葉病毒(WMV)和小西葫蘆花葉病毒(ZYMV)[1-3]，引起復(fù)播甜瓜病毒病的種類還有待確定。【本研究切入點】病毒病是影響復(fù)播甜瓜最重要的病害，通過覆蓋防蟲網(wǎng)防治復(fù)播甜瓜病毒病的方法未見報道，研究該種栽培方式下的甜瓜產(chǎn)量、品質(zhì)、商品率等，評價其生產(chǎn)應(yīng)用的可行性及應(yīng)用前景。通過小拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)能夠隔絕傳毒媒介昆蟲的傳毒，降低復(fù)播甜瓜病毒病的發(fā)生率。但此種方法對復(fù)播甜瓜病毒病的防治效果以及對甜瓜坐果、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響需要明確。研究揭去防蟲網(wǎng)后，既能達到防治病毒病的最大化，又影響甜瓜正常授粉，并達到坐果率及果品質(zhì)量最優(yōu)化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】研究不同時期揭去防蟲網(wǎng)甜瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)和商品率，分析最佳揭網(wǎng)時間，確定該種栽培模式的可行性及應(yīng)用前景和引起喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病種類，對選擇的材料進行抗病性篩選，為生產(chǎn)和抗病育種研究打基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

毒源按各病毒病發(fā)病時期采自新疆喀什各個地區(qū)，之后迅速置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。RNA提取試劑盒，DNA純化、回收試劑盒購自天根生物公司，HIFIScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自康為世紀(jì)公司，其他常規(guī)試劑均購自北京全式金公司，大腸桿菌DH5α由本試驗室保存，氨芐霉素(Amp)的使用濃度為100 μg/mL。表1

防蟲網(wǎng)罩(60目)購自喀什，復(fù)播甜瓜試驗品種(系)“金秀”、溫室抗病性鑒定材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供，田間試驗在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心疏勒研究示范基地進行。

表 1 供試材料及來源Table 1 Information of the test materials

1.2 方 法

1.2.1 拱棚覆網(wǎng)栽培模式

甜瓜簡約化栽模式參照王豪杰等[4]的進行，播種后立即搭建拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)。

1.2.2 撤防蟲網(wǎng)最佳時間確定1.2.2.1 病情指數(shù)調(diào)查

采用隨機區(qū)組試驗，將試驗地分為4個小區(qū)，命名為1、2、3、4號小區(qū)，每個小區(qū)設(shè)置三個重復(fù)，6月25號播種，之后覆蓋防蟲網(wǎng)，以不覆蓋防蟲網(wǎng)的小區(qū)作為對照。分別于7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去第1、2、3、4號小區(qū)的防蟲網(wǎng)。撤去防蟲網(wǎng)一周后逐日觀察癥狀，30 d后記錄癥狀等級，分級標(biāo)準(zhǔn)參照陳潔云等[6]等的方法進行，統(tǒng)計每個重復(fù)的病情指數(shù)。

1.2.2.2 果品質(zhì)量參數(shù)統(tǒng)計

中心折光糖度測定用電子測糖儀測量，每個小區(qū)隨機選取5個單瓜測量；產(chǎn)量的統(tǒng)計方式是從每個小區(qū)隨機選取20個單瓜稱重，取平均值折合成單位面積產(chǎn)量。平均單株結(jié)果數(shù)、商品率的計算方式參照王豪杰等[4]的方法進行。

1.2.3 甜瓜病毒總RNA的提取

將樣品置于液氮中迅速研磨成粉狀，裝100 mg左右的組織加入1 mL TRizol，200 μL氯仿，在室溫中放置5 min，使核酸和蛋白質(zhì)完全分離，之后置于4℃離心機中，12 000 r/min離心10 min。吸取上清，加入600 μL氯仿、200 μL無水乙醇，12 000 r/min離心10 min。吸取上清，加入等量的異丙醇，顛倒混勻，在冰上放置10 min，繼續(xù)離心10 min，棄去上清液，沉淀用1mL的乙醇(Φ=75%)洗滌2次，置于室溫中干燥，用適量的DEPC水溶解，檢測純度和濃度后，分裝保存于-80℃冰箱中備用。

1.2.4 病毒 cDNA第一鏈合成

病毒cDNA第一鏈的合成采用康為實際公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行。向DEPC水處理過的PCR管中1 μg總RNA，1 μL gDNA Eraser Buffer，0.5 μL gDNA Eraser，用無核酸酶的純水補充至10 μL，混合均勻，短暫離心后在42℃水浴鍋中反應(yīng)2 min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心置于冰上冷卻。之后再加入1 μL HiFiScript，1 μL Primer Mix，4 μL反應(yīng)Buffer，4 μL無核酸酶的高純水，混合均勻，短暫離心后置于42℃水浴鍋中反應(yīng)15 min，85℃反應(yīng)5 min終止反應(yīng)。將cDNA分裝后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 引物設(shè)計

PCR引物參照李繼洋[1]等的設(shè)計，由北京六合華大基因公司合成。表2

表2 甜瓜3種病毒PCR反應(yīng)引物Table 2 Primer information for PCR reaction of three virus in melon

1.2.6 病毒RT-PCR檢測

隨機選取15個供試樣品，提取總RNA并合成cDNA第一鏈，用于RT-PCR檢測。反應(yīng)體系(25 μL)包括：2.5 μL 10×Buffer(含MgCl2)，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，上下游引物(10 μmol/L)各1、0.5 μLTaqDNA聚合酶，1 μL模板cDNA，ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為：30 × (94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 1.5 min)，最后，72℃ 10 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。

1.2.7 病毒PCR產(chǎn)物的純化與連接

將凝膠中與GenBank中比對的WMV、CMV、ZYMV CP蛋白基因片段預(yù)測大小相近的擴增產(chǎn)物條帶進行切膠回收。利用瓊脂糖DNA回收試劑盒(DP209-03)進行純化。具體方法參照試劑盒使用說明。將切下的膠塊稱重，加入等倍體積溶膠液，50℃水浴放置，待膠塊完全溶解之后，將所得溶液加入吸附柱中，室溫放置2 min，之后12 000 r/min離心1 min，倒掉收集管中的廢液；用600 μL漂洗液漂洗2次，棄廢液，12 000 r/min離心2 min，室溫干燥。將吸附柱放到一個干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液，室溫放置2 min，之后置于離心機12 000 r/min離心2 min，得到回收片段。

將回收片段連接到pMD18-T載體上(具體方法參照試劑盒使用說明)，利用熱擊轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37℃暗培養(yǎng)12 h。挑取單菌落于LB(含有Amp)培養(yǎng)基中37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。進行菌液PCR 擴增，檢測得到陽性克隆并送往公司測序(北京六合華大基因有限公司)。

1.2.8 抗病性鑒定

室內(nèi)進行品種抗病性測定。選取本單位的10個材料，經(jīng)過表面消毒后在營養(yǎng)缽中種植，每個材料設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種30 株幼苗。所用的土壤事先高溫高壓滅菌處理。待幼苗長出兩片真葉時選擇生長一致的健康植株，采用汁液摩擦接種法進行病毒接種[5]。將接種的幼苗置于防蟲溫室中，溫度控制在21 ～ 28℃。接種5 d后逐日觀察癥狀，接種30 d待病情穩(wěn)定后，統(tǒng)計病情指數(shù)，初步評估這幾個品種的抗病性。

根據(jù)甜瓜病毒病癥狀特定，參照陳潔云[5]制定以下分級標(biāo)準(zhǔn)：

0，無明顯癥狀；1，葉片輕花葉或輕度卷葉；2，重花葉或植株輕度矮化；3，嚴(yán)重皰斑花葉伴隨畸形，植株無明顯矮化；4，葉片明顯縮小伴重度畸形花葉，植株明顯矮化。

病情指數(shù)(DI)=100×∑(病害的級數(shù)×該級病害株數(shù)/病害的最高級×樣本總數(shù))。

2 結(jié)果與分析

2.1 撤防蟲網(wǎng)最佳時間

2.1.1 病情指數(shù)

分別于7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去各處理小區(qū)的防蟲網(wǎng)。5 d后逐日觀察癥狀，30 d后統(tǒng)計對照和4個處理小區(qū)的病情指數(shù)， 結(jié)果顯示對照的病情指數(shù)是83.64，4個處理小區(qū)的病情指數(shù)分別是53.82、37.25、24.25和21.07，各個處理與對照之間的差異極顯著，小拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)對減輕復(fù)播甜瓜病毒病的發(fā)生有顯著的效果。圖1

M：對照小區(qū)(Mock)；1：7月20日撤去防蟲網(wǎng)；2：7月25日撤去防蟲網(wǎng)；3：8月1日撤去防蟲網(wǎng)；4：8月5日撤去防蟲網(wǎng)

2.1.2 產(chǎn)量

平均單株結(jié)果數(shù)是構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素，而病毒病是影響復(fù)播甜瓜單株結(jié)果數(shù)和產(chǎn)量的主要原因，不同時期撤去防蟲網(wǎng)后的病情指數(shù)有差異，蟲媒雌花授粉率也各不相同，導(dǎo)致單株平均結(jié)果數(shù)與產(chǎn)量也不同。

在7月20日，7月25日、8月1日和8月5日撤去各處理小區(qū)的防蟲網(wǎng)，收獲前統(tǒng)計各小區(qū)的平均單株結(jié)果數(shù)和產(chǎn)量。結(jié)果顯示，沒有覆蓋防蟲網(wǎng)的對照小區(qū)，平均單株結(jié)果數(shù)為0.4個，幾乎絕收，其他處理的4個小區(qū)平均單株結(jié)果數(shù)分別為2.3、2.5、3.1和2.2個。在8月1日揭去防蟲網(wǎng)復(fù)播甜瓜產(chǎn)量最高。圖2

注：A：平均單株結(jié)果數(shù)；B產(chǎn)量；M：對照小區(qū)(Mock)；1：7月20日撤去防蟲網(wǎng)；2：7月25日撤去防蟲網(wǎng)；3：8月1日撤去防蟲網(wǎng)；4：8月5日撤去防蟲網(wǎng)

2.1.3 品質(zhì)和商品率

研究表明，對照的平均含糖量為10.9，4個處理小區(qū)的平均含糖量依次為15.9、15.7、15.8和15.3，各個處理之間的差異不顯著。覆蓋防蟲網(wǎng)有效的減輕了病毒病的危害，保證了復(fù)播甜瓜的品質(zhì)，滿足商品瓜的含糖量要求。圖2

復(fù)播甜瓜肥水管理等方面做的比較精細(xì)，在將病毒病控制好的前提下，商品率能達到較高水平。試驗田對照的商品率為8.9%，4個處理小區(qū)的商品率分別為70.8%、71.5%、79.3%和76.9%，在8月1日揭去防蟲網(wǎng)，商品率最高。圖3

注：A：中心折光含糖量；B商品率；M：對照小區(qū)(Mock)；1：7月20日撤去防蟲網(wǎng)；2：7月25日撤去防蟲網(wǎng)；3：8月1日撤去防蟲網(wǎng)；4：8月5日撤去防蟲網(wǎng)

應(yīng)用 WMV、ZYMV 和CMV特異性引物分別檢測伽師縣、麥蓋提縣、疏勒縣、疏附這四個地區(qū)收集到的畸形、花葉型和黃化型病毒病樣。經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳后，CMV特異性引物經(jīng)反應(yīng)，擴增得到476 bp的特異性條帶(圖4A)；WMV擴增得到1 000 bp的特異性條帶(圖4B)；ZYMV擴增得到1 100 bp的特異性條帶(圖4C)。通過回收、測序，在GENBANK上進行比對，這三個地區(qū)所采集到的樣品均能檢測到WMV、ZYMV 和CMV三種病毒，這與夏季正播甜瓜的病原是一致的，且多為復(fù)合侵染。圖4

2.2 不同甜瓜品種的抗病性鑒定

在接種一周后逐漸觀察，接種30 d后，發(fā)病的植株出現(xiàn)典型的黃化、花葉、植株矮化等癥狀，統(tǒng)計病情指數(shù)?？共⌒澡b定結(jié)果顯示，所有供試品種中，黃皮9818的病情指數(shù)最高，是71.39，K-1的病情指數(shù)最低，是7.22，達到了耐病的水平。所有的對照處理植株均表現(xiàn)健康。表3

注:A：黃瓜花葉病毒(CMV)鑒定結(jié)果；B：西瓜花葉病毒(WMV)鑒定結(jié)果；C：小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)鑒定結(jié)果；M：DL-2000 marker；—：陰性對照

表3 不同甜瓜品種抗病性鑒定結(jié)果Table 3 Resistance test for various melon cultivars against melon virus

3 討 論

甜瓜生產(chǎn)在喀什地區(qū)的農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)民脫貧增收中具有重要的作用，是極有區(qū)域優(yōu)勢的重大特色產(chǎn)業(yè)[6]?？κ驳貐^(qū)有著獨特的氣候條件和豐富的光熱資源，小麥?zhǔn)崭詈蠓N植復(fù)播甜瓜是一種積極而有效的選擇，對延長甜瓜市場供應(yīng)期、促進農(nóng)民脫貧增收有很重要的現(xiàn)實意義。病毒病是影響復(fù)播甜瓜生產(chǎn)最主要的病害，嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[6-9]。病毒是分子病原物，目前尚無有效的防治方法和防治藥劑，一旦流行，就會造成較為嚴(yán)重的為害[10]，對于復(fù)播甜瓜極大可能造成絕收。昆蟲是甜瓜病毒病傳播最有效的媒介，7月是喀什地區(qū)蚜蟲、粉虱等媒介昆蟲的主要傳毒期，也是復(fù)播甜瓜開花結(jié)果的關(guān)鍵時期。覆蓋防蟲網(wǎng)能有效隔絕傳毒媒介昆蟲的傳毒，極大程度上降低復(fù)播甜瓜病毒病的發(fā)生率，但對甜瓜結(jié)果會造成影響(蟲媒雌花不能授粉)。該報道對何時撤去防蟲網(wǎng)既能達到防止病毒病的最大化，也不影響甜瓜正常授粉，達到坐果率及果品質(zhì)量的最優(yōu)化展開研究。

據(jù)文獻報道，在全世界范圍內(nèi)為害葫蘆科作物的主要病毒為 WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和 PRSV[10-20]。 關(guān)于新疆地區(qū)的甜瓜病毒病也有報道[1]，但限于正播品種，對復(fù)播甜瓜的病毒病及優(yōu)勢病毒尚沒有報道。研究采用RT-PCR對喀什地區(qū)幾個復(fù)播甜瓜主產(chǎn)區(qū)(伽師、麥蓋提、疏勒)的病毒病進行分子生物學(xué)鑒定，明確了復(fù)播甜瓜病毒病的種類與正播甜瓜的種類一致。

近年來調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前在南疆主栽的甜瓜品種對病毒病都比較敏感，很難發(fā)現(xiàn)對病毒病有良好抗性的品種。因此，研究中除選用了南、北疆一些常見的甜瓜商業(yè)品種，還選用幾個新品系進行抗病性鑒定。這些鑒別寄主雖然沒有在大田中大面積栽培，但其很可能存在對病毒有良好抗性的抗病基因[21]?？共⌒澡b定結(jié)果表明，編號K-1的材料的病情指數(shù)僅為7.22，在溫室大棚種植也有較好的抗性，其抗病機理和相關(guān)抗性基因的挖掘有待進一步研究。

4 結(jié) 論

小拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)能有效防治喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病的傳播與流行，技術(shù)可行，前景廣闊。在8月1號前后撤去防蟲網(wǎng)，既能達到病毒防治效果的最大化，也不影響復(fù)播甜瓜的授粉和坐果，達到坐果率及果品質(zhì)量的最優(yōu)化?？κ驳貐^(qū)晚秋復(fù)播甜瓜病毒病的種類是WMV、ZYMV 和CMV，且多為復(fù)合侵染，這與侵染正播甜瓜病毒病的種類相一致。新疆主栽的甜瓜品種對病毒病都比較敏感，僅K-1在抗病性鑒定中表現(xiàn)良好，在溫室大棚中也有較好的抗性。