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      拱棚覆網(wǎng)對喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病的防治效果

      2019-03-03 03:12:34毛建才王豪杰李俊華翟文強
      新疆農(nóng)業(yè)科學(xué) 2019年12期
      關(guān)鍵詞:復(fù)播防蟲網(wǎng)喀什地區(qū)

      毛建才,王豪杰,李俊華,翟文強

      (新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心,烏魯木齊 830091)

      0 引 言

      【研究意義】喀什地區(qū)光熱資源豐富,平原地區(qū)平均無霜期215 d,小麥?zhǔn)崭詈筮m合復(fù)播甜瓜生產(chǎn)。傳統(tǒng)上復(fù)播甜瓜在6月底到7月上旬播種,9月底到10月上旬采收,果實不僅品質(zhì)好且非常耐貯。由于復(fù)播甜瓜的銷售價格高于正播甜瓜(7月下旬到8月上旬上市)2~4倍。但近年由于病毒病危害,常規(guī)方法已無法種植復(fù)播甜瓜,研究通過改進栽培模式,研究喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病的防疫,對甜瓜抗病育種有實際意義?!厩叭搜芯窟M展】關(guān)于新疆甜瓜病毒病的報道僅限于正播甜瓜,對于復(fù)播甜瓜病毒病的種類及優(yōu)勢病毒尚沒有報道。到目前為止,引起正播甜瓜病毒病的主要是黃瓜花葉病毒(CMV)、西瓜花葉病毒(WMV)和小西葫蘆花葉病毒(ZYMV)[1-3],引起復(fù)播甜瓜病毒病的種類還有待確定。【本研究切入點】病毒病是影響復(fù)播甜瓜最重要的病害,通過覆蓋防蟲網(wǎng)防治復(fù)播甜瓜病毒病的方法未見報道,研究該種栽培方式下的甜瓜產(chǎn)量、品質(zhì)、商品率等,評價其生產(chǎn)應(yīng)用的可行性及應(yīng)用前景。通過小拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)能夠隔絕傳毒媒介昆蟲的傳毒,降低復(fù)播甜瓜病毒病的發(fā)生率。但此種方法對復(fù)播甜瓜病毒病的防治效果以及對甜瓜坐果、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響需要明確。研究揭去防蟲網(wǎng)后,既能達到防治病毒病的最大化,又影響甜瓜正常授粉,并達到坐果率及果品質(zhì)量最優(yōu)化?!緮M解決的關(guān)鍵問題】研究不同時期揭去防蟲網(wǎng)甜瓜的產(chǎn)量、品質(zhì)和商品率,分析最佳揭網(wǎng)時間,確定該種栽培模式的可行性及應(yīng)用前景和引起喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病種類,對選擇的材料進行抗病性篩選,為生產(chǎn)和抗病育種研究打基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材 料

      毒源按各病毒病發(fā)病時期采自新疆喀什各個地區(qū),之后迅速置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。RNA提取試劑盒,DNA純化、回收試劑盒購自天根生物公司,HIFIScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自康為世紀(jì)公司,其他常規(guī)試劑均購自北京全式金公司,大腸桿菌DH5α由本試驗室保存,氨芐霉素(Amp)的使用濃度為100 μg/mL。表1

      防蟲網(wǎng)罩(60目)購自喀什,復(fù)播甜瓜試驗品種(系)“金秀”、溫室抗病性鑒定材料均由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心提供,田間試驗在新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈密瓜研究中心疏勒研究示范基地進行。

      表 1 供試材料及來源Table 1 Information of the test materials

      1.2 方 法

      1.2.1 拱棚覆網(wǎng)栽培模式

      甜瓜簡約化栽模式參照王豪杰等[4]的進行,播種后立即搭建拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)。

      1.2.2 撤防蟲網(wǎng)最佳時間確定1.2.2.1 病情指數(shù)調(diào)查

      采用隨機區(qū)組試驗,將試驗地分為4個小區(qū),命名為1、2、3、4號小區(qū),每個小區(qū)設(shè)置三個重復(fù),6月25號播種,之后覆蓋防蟲網(wǎng),以不覆蓋防蟲網(wǎng)的小區(qū)作為對照。分別于7月20日,7月25日、8月1日和8月5日撤去第1、2、3、4號小區(qū)的防蟲網(wǎng)。撤去防蟲網(wǎng)一周后逐日觀察癥狀,30 d后記錄癥狀等級,分級標(biāo)準(zhǔn)參照陳潔云等[6]等的方法進行,統(tǒng)計每個重復(fù)的病情指數(shù)。

      1.2.2.2 果品質(zhì)量參數(shù)統(tǒng)計

      中心折光糖度測定用電子測糖儀測量,每個小區(qū)隨機選取5個單瓜測量;產(chǎn)量的統(tǒng)計方式是從每個小區(qū)隨機選取20個單瓜稱重,取平均值折合成單位面積產(chǎn)量。平均單株結(jié)果數(shù)、商品率的計算方式參照王豪杰等[4]的方法進行。

      1.2.3 甜瓜病毒總RNA的提取

      將樣品置于液氮中迅速研磨成粉狀,裝100 mg左右的組織加入1 mL TRizol,200 μL氯仿,在室溫中放置5 min,使核酸和蛋白質(zhì)完全分離,之后置于4℃離心機中,12 000 r/min離心10 min。吸取上清,加入600 μL氯仿、200 μL無水乙醇,12 000 r/min離心10 min。吸取上清,加入等量的異丙醇,顛倒混勻,在冰上放置10 min,繼續(xù)離心10 min,棄去上清液,沉淀用1mL的乙醇(Φ=75%)洗滌2次,置于室溫中干燥,用適量的DEPC水溶解,檢測純度和濃度后,分裝保存于-80℃冰箱中備用。

      1.2.4 病毒 cDNA第一鏈合成

      病毒cDNA第一鏈的合成采用康為實際公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行。向DEPC水處理過的PCR管中1 μg總RNA,1 μL gDNA Eraser Buffer,0.5 μL gDNA Eraser,用無核酸酶的純水補充至10 μL,混合均勻,短暫離心后在42℃水浴鍋中反應(yīng)2 min。反應(yīng)結(jié)束后,短暫離心置于冰上冷卻。之后再加入1 μL HiFiScript,1 μL Primer Mix,4 μL反應(yīng)Buffer,4 μL無核酸酶的高純水,混合均勻,短暫離心后置于42℃水浴鍋中反應(yīng)15 min,85℃反應(yīng)5 min終止反應(yīng)。將cDNA分裝后置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.5 引物設(shè)計

      PCR引物參照李繼洋[1]等的設(shè)計,由北京六合華大基因公司合成。表2

      表2 甜瓜3種病毒PCR反應(yīng)引物Table 2 Primer information for PCR reaction of three virus in melon

      1.2.6 病毒RT-PCR檢測

      隨機選取15個供試樣品,提取總RNA并合成cDNA第一鏈,用于RT-PCR檢測。反應(yīng)體系(25 μL)包括:2.5 μL 10×Buffer(含MgCl2),2 μL dNTPs(10 mmol/L),上下游引物(10 μmol/L)各1、0.5 μLTaqDNA聚合酶,1 μL模板cDNA,ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為:30 × (94℃ 30 s,70℃ 30 s,72℃ 1.5 min),最后,72℃ 10 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。

      1.2.7 病毒PCR產(chǎn)物的純化與連接

      將凝膠中與GenBank中比對的WMV、CMV、ZYMV CP蛋白基因片段預(yù)測大小相近的擴增產(chǎn)物條帶進行切膠回收。利用瓊脂糖DNA回收試劑盒(DP209-03)進行純化。具體方法參照試劑盒使用說明。將切下的膠塊稱重,加入等倍體積溶膠液,50℃水浴放置,待膠塊完全溶解之后,將所得溶液加入吸附柱中,室溫放置2 min,之后12 000 r/min離心1 min,倒掉收集管中的廢液;用600 μL漂洗液漂洗2次,棄廢液,12 000 r/min離心2 min,室溫干燥。將吸附柱放到一個干凈的離心管中,向吸附膜中間位置懸空滴加適量的洗脫緩沖液,室溫放置2 min,之后置于離心機12 000 r/min離心2 min,得到回收片段。

      將回收片段連接到pMD18-T載體上(具體方法參照試劑盒使用說明),利用熱擊轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,37℃暗培養(yǎng)12 h。挑取單菌落于LB(含有Amp)培養(yǎng)基中37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)。進行菌液PCR 擴增,檢測得到陽性克隆并送往公司測序(北京六合華大基因有限公司)。

      1.2.8 抗病性鑒定

      室內(nèi)進行品種抗病性測定。選取本單位的10個材料,經(jīng)過表面消毒后在營養(yǎng)缽中種植,每個材料設(shè)置3個重復(fù),每個重復(fù)接種30 株幼苗。所用的土壤事先高溫高壓滅菌處理。待幼苗長出兩片真葉時選擇生長一致的健康植株,采用汁液摩擦接種法進行病毒接種[5]。將接種的幼苗置于防蟲溫室中,溫度控制在21 ~ 28℃。接種5 d后逐日觀察癥狀,接種30 d待病情穩(wěn)定后,統(tǒng)計病情指數(shù),初步評估這幾個品種的抗病性。

      根據(jù)甜瓜病毒病癥狀特定,參照陳潔云[5]制定以下分級標(biāo)準(zhǔn):

      0,無明顯癥狀;1,葉片輕花葉或輕度卷葉;2,重花葉或植株輕度矮化;3,嚴(yán)重皰斑花葉伴隨畸形,植株無明顯矮化;4,葉片明顯縮小伴重度畸形花葉,植株明顯矮化。

      病情指數(shù)(DI)=100×∑(病害的級數(shù)×該級病害株數(shù)/病害的最高級×樣本總數(shù))。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 撤防蟲網(wǎng)最佳時間

      2.1.1 病情指數(shù)

      分別于7月20日,7月25日、8月1日和8月5日撤去各處理小區(qū)的防蟲網(wǎng)。5 d后逐日觀察癥狀,30 d后統(tǒng)計對照和4個處理小區(qū)的病情指數(shù), 結(jié)果顯示對照的病情指數(shù)是83.64,4個處理小區(qū)的病情指數(shù)分別是53.82、37.25、24.25和21.07,各個處理與對照之間的差異極顯著,小拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)對減輕復(fù)播甜瓜病毒病的發(fā)生有顯著的效果。圖1

      M:對照小區(qū)(Mock);1:7月20日撤去防蟲網(wǎng);2:7月25日撤去防蟲網(wǎng);3:8月1日撤去防蟲網(wǎng);4:8月5日撤去防蟲網(wǎng)

      2.1.2 產(chǎn)量

      平均單株結(jié)果數(shù)是構(gòu)成產(chǎn)量的主要因素,而病毒病是影響復(fù)播甜瓜單株結(jié)果數(shù)和產(chǎn)量的主要原因,不同時期撤去防蟲網(wǎng)后的病情指數(shù)有差異,蟲媒雌花授粉率也各不相同,導(dǎo)致單株平均結(jié)果數(shù)與產(chǎn)量也不同。

      在7月20日,7月25日、8月1日和8月5日撤去各處理小區(qū)的防蟲網(wǎng),收獲前統(tǒng)計各小區(qū)的平均單株結(jié)果數(shù)和產(chǎn)量。結(jié)果顯示,沒有覆蓋防蟲網(wǎng)的對照小區(qū),平均單株結(jié)果數(shù)為0.4個,幾乎絕收,其他處理的4個小區(qū)平均單株結(jié)果數(shù)分別為2.3、2.5、3.1和2.2個。在8月1日揭去防蟲網(wǎng)復(fù)播甜瓜產(chǎn)量最高。圖2

      注:A:平均單株結(jié)果數(shù);B產(chǎn)量;M:對照小區(qū)(Mock);1:7月20日撤去防蟲網(wǎng);2:7月25日撤去防蟲網(wǎng);3:8月1日撤去防蟲網(wǎng);4:8月5日撤去防蟲網(wǎng)

      2.1.3 品質(zhì)和商品率

      研究表明,對照的平均含糖量為10.9,4個處理小區(qū)的平均含糖量依次為15.9、15.7、15.8和15.3,各個處理之間的差異不顯著。覆蓋防蟲網(wǎng)有效的減輕了病毒病的危害,保證了復(fù)播甜瓜的品質(zhì),滿足商品瓜的含糖量要求。圖2

      復(fù)播甜瓜肥水管理等方面做的比較精細(xì),在將病毒病控制好的前提下,商品率能達到較高水平。試驗田對照的商品率為8.9%,4個處理小區(qū)的商品率分別為70.8%、71.5%、79.3%和76.9%,在8月1日揭去防蟲網(wǎng),商品率最高。圖3

      注:A:中心折光含糖量;B商品率;M:對照小區(qū)(Mock);1:7月20日撤去防蟲網(wǎng);2:7月25日撤去防蟲網(wǎng);3:8月1日撤去防蟲網(wǎng);4:8月5日撤去防蟲網(wǎng)

      應(yīng)用 WMV、ZYMV 和CMV特異性引物分別檢測伽師縣、麥蓋提縣、疏勒縣、疏附這四個地區(qū)收集到的畸形、花葉型和黃化型病毒病樣。經(jīng)過1%的瓊脂糖凝膠電泳后,CMV特異性引物經(jīng)反應(yīng),擴增得到476 bp的特異性條帶(圖4A);WMV擴增得到1 000 bp的特異性條帶(圖4B);ZYMV擴增得到1 100 bp的特異性條帶(圖4C)。通過回收、測序,在GENBANK上進行比對,這三個地區(qū)所采集到的樣品均能檢測到WMV、ZYMV 和CMV三種病毒,這與夏季正播甜瓜的病原是一致的,且多為復(fù)合侵染。圖4

      2.2 不同甜瓜品種的抗病性鑒定

      在接種一周后逐漸觀察,接種30 d后,發(fā)病的植株出現(xiàn)典型的黃化、花葉、植株矮化等癥狀,統(tǒng)計病情指數(shù)??共⌒澡b定結(jié)果顯示,所有供試品種中,黃皮9818的病情指數(shù)最高,是71.39,K-1的病情指數(shù)最低,是7.22,達到了耐病的水平。所有的對照處理植株均表現(xiàn)健康。表3

      注:A:黃瓜花葉病毒(CMV)鑒定結(jié)果;B:西瓜花葉病毒(WMV)鑒定結(jié)果;C:小西葫蘆黃花葉病毒(ZYMV)鑒定結(jié)果;M:DL-2000 marker;—:陰性對照

      表3 不同甜瓜品種抗病性鑒定結(jié)果Table 3 Resistance test for various melon cultivars against melon virus

      3 討 論

      甜瓜生產(chǎn)在喀什地區(qū)的農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)民脫貧增收中具有重要的作用,是極有區(qū)域優(yōu)勢的重大特色產(chǎn)業(yè)[6]??κ驳貐^(qū)有著獨特的氣候條件和豐富的光熱資源,小麥?zhǔn)崭詈蠓N植復(fù)播甜瓜是一種積極而有效的選擇,對延長甜瓜市場供應(yīng)期、促進農(nóng)民脫貧增收有很重要的現(xiàn)實意義。病毒病是影響復(fù)播甜瓜生產(chǎn)最主要的病害,嚴(yán)重影響產(chǎn)量和品質(zhì)[6-9]。病毒是分子病原物,目前尚無有效的防治方法和防治藥劑,一旦流行,就會造成較為嚴(yán)重的為害[10],對于復(fù)播甜瓜極大可能造成絕收。昆蟲是甜瓜病毒病傳播最有效的媒介,7月是喀什地區(qū)蚜蟲、粉虱等媒介昆蟲的主要傳毒期,也是復(fù)播甜瓜開花結(jié)果的關(guān)鍵時期。覆蓋防蟲網(wǎng)能有效隔絕傳毒媒介昆蟲的傳毒,極大程度上降低復(fù)播甜瓜病毒病的發(fā)生率,但對甜瓜結(jié)果會造成影響(蟲媒雌花不能授粉)。該報道對何時撤去防蟲網(wǎng)既能達到防止病毒病的最大化,也不影響甜瓜正常授粉,達到坐果率及果品質(zhì)量的最優(yōu)化展開研究。

      據(jù)文獻報道,在全世界范圍內(nèi)為害葫蘆科作物的主要病毒為 WMV、CMV、ZYMV、SqMV 和 PRSV[10-20]。 關(guān)于新疆地區(qū)的甜瓜病毒病也有報道[1],但限于正播品種,對復(fù)播甜瓜的病毒病及優(yōu)勢病毒尚沒有報道。研究采用RT-PCR對喀什地區(qū)幾個復(fù)播甜瓜主產(chǎn)區(qū)(伽師、麥蓋提、疏勒)的病毒病進行分子生物學(xué)鑒定,明確了復(fù)播甜瓜病毒病的種類與正播甜瓜的種類一致。

      近年來調(diào)研發(fā)現(xiàn),目前在南疆主栽的甜瓜品種對病毒病都比較敏感,很難發(fā)現(xiàn)對病毒病有良好抗性的品種。因此,研究中除選用了南、北疆一些常見的甜瓜商業(yè)品種,還選用幾個新品系進行抗病性鑒定。這些鑒別寄主雖然沒有在大田中大面積栽培,但其很可能存在對病毒有良好抗性的抗病基因[21]??共⌒澡b定結(jié)果表明,編號K-1的材料的病情指數(shù)僅為7.22,在溫室大棚種植也有較好的抗性,其抗病機理和相關(guān)抗性基因的挖掘有待進一步研究。

      4 結(jié) 論

      小拱棚覆蓋防蟲網(wǎng)能有效防治喀什地區(qū)復(fù)播甜瓜病毒病的傳播與流行,技術(shù)可行,前景廣闊。在8月1號前后撤去防蟲網(wǎng),既能達到病毒防治效果的最大化,也不影響復(fù)播甜瓜的授粉和坐果,達到坐果率及果品質(zhì)量的最優(yōu)化??κ驳貐^(qū)晚秋復(fù)播甜瓜病毒病的種類是WMV、ZYMV 和CMV,且多為復(fù)合侵染,這與侵染正播甜瓜病毒病的種類相一致。新疆主栽的甜瓜品種對病毒病都比較敏感,僅K-1在抗病性鑒定中表現(xiàn)良好,在溫室大棚中也有較好的抗性。

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