席繼鋒 袁立崗 楊楠 鄧雙義 賈斌 張永生 李超程 夏歡 王香祖

摘要：為滿足畜牧生產(chǎn)需求，更有效地控制奶牛的后代性別，采用RNA干擾技術(shù)分別對(duì)2頭成年健康繁殖性能正常的荷斯坦公牛Zfy基因mRNA進(jìn)行干擾，應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析方法。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組公牛的后代性別比例發(fā)生明顯的偏移，母犢比例達(dá)75%以上，而子代的體尺、生長(zhǎng)發(fā)育及繁殖性能等均無(wú)變化。得出結(jié)論，干擾Zfy基因生產(chǎn)奶牛性控精液的方法簡(jiǎn)單、方便、易操作，在生產(chǎn)中具有一定的推廣價(jià)值和應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：奶牛;性別控制;試驗(yàn);效果驗(yàn)證

中圖分類號(hào)： S823.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）23-0195-02

與Y染色體相關(guān)的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子（Y chromosome linked Zinc-finger protein transcriptional factor，Zfy），是位于Y染色體短臂上的能夠編碼鋅指蛋白的基因。Zfy基因參與哺乳動(dòng)物的單倍體生精細(xì)胞的更新分化和發(fā)育，對(duì)于減數(shù)分裂和精子生成至關(guān)重要。Zfy與精子的形成與發(fā)生相關(guān)，作為一個(gè)較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄激活因子，引導(dǎo)靶基因穿過(guò)核膜，定位于精子細(xì)胞核內(nèi)，可能對(duì)精子變態(tài)過(guò)程中的某些基因具有轉(zhuǎn)錄激活作用[1-2]。1986年，Vergnaud等通過(guò)對(duì)Y染色體上有不同缺失的患者的DNA文庫(kù)進(jìn)行分子雜交，首次克隆獲得了Zfy基因[3]。而睪丸決定因子最佳候選基因Sry被發(fā)現(xiàn)前，Zfy基因曾被認(rèn)為是睪丸決定因子的候選基因[4]，在雄性睪丸生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-6]。彭強(qiáng)等首次用RNAi的方法通過(guò)構(gòu)建Zfy基因siRNA重組表達(dá)載體進(jìn)行小鼠體內(nèi)RNAi的研究，從而研究編碼Zfy基因在精子的生成過(guò)程中的作用，其后代出現(xiàn)雄性小鼠比例下降現(xiàn)象[7]。馬軍德通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒RNAi載體對(duì)小鼠進(jìn)行性別控制產(chǎn)生了顯著效果，在小鼠后代性別鑒定中絕大部分窩組的母鼠率都達(dá)到了70%以上[8]。本研究就Zfy基因干擾技術(shù)在奶牛性別控制中的應(yīng)用進(jìn)行簡(jiǎn)單的介紹。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與設(shè)備 酵母、蛋白胨、氯化鈉、氨芐青霉素、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒（北京天根生化有限公司）、無(wú)水乙醇、異丙醇、雙抗（上海英駿生物技術(shù)有限公司）。

冷凍離心機(jī)、水浴鍋、振蕩器、搖床、恒溫干燥箱。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)公牛來(lái)自新疆天山畜牧生物工程股份有限公司種公牛站，隨機(jī)選擇系譜資料完整的健康荷斯坦種公牛2頭，受配荷斯坦母牛均健康、成年，繁殖性能良好。

1.2 方法

1.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒制備 將保存的菌種從-80 ℃超低溫冰箱中取出，室溫解凍后，超凈臺(tái)中將200 μL菌液接種至200 mL含氨芐青霉素（100 μg/mL）的Luria-Bertani培養(yǎng)基，搖床內(nèi)37 ℃、8 000 r/min過(guò)夜培養(yǎng)。12～16 h后將處于對(duì)數(shù)期的菌液取出，按照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒，測(cè)定濃度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Zfy基因mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)重組干擾質(zhì)粒pLL3.7-A、pLL3.7-B對(duì)奶牛生精細(xì)胞的Zfy基因mRNA表達(dá)水平的干擾效果，結(jié)果顯示，與對(duì)照組（未做任何干擾處理）相比，奶牛生精細(xì)胞轉(zhuǎn)染pLL3.7-A后Zfy基因mRNA表達(dá)水平顯著降低了50%（P<0.05），轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pLL3.7-B后Zfy基因mRNA表達(dá)水平降低了76%，與對(duì)照組差異極顯著（P<0.01）（圖1）。

1.2.3 公牛體內(nèi)干擾試驗(yàn) 選取1頭荷斯坦種公牛做對(duì)照，不做任何處理。選擇干擾效果較好的質(zhì)粒pLL3.7-B進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)。將提取好的質(zhì)粒用滅菌PBS濾液稀釋，同時(shí)加入雙抗以防止感染，然后按每管2.5 mg/5 mL的量對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行分裝。試驗(yàn)組公牛每側(cè)睪丸注射劑量2.5 mg，沿睪丸縱軸進(jìn)針，一邊注射一邊緩慢回抽針頭，注射完畢拔出針頭，碘酒消毒。試驗(yàn)公牛間隔7 d注射1次，共注射3次。第3次注射后第7天開(kāi)始采精，以后每隔7 d采精1次，連續(xù)采精5次。收集精液，迅速檢測(cè)精子活力和密度，然后制作0.25 mL的細(xì)管凍精，液氮中凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 奶牛配種 奶牛配種均采用人工授精技術(shù)，試驗(yàn)組（注射pLL3.7-B干擾質(zhì)粒）和對(duì)照組分別配種母牛100頭，試驗(yàn)組與對(duì)照組奶牛均在同一條件下飼養(yǎng)管理。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行Fisher（卡方檢驗(yàn)）檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛后代性別統(tǒng)計(jì)

對(duì)照組和試驗(yàn)組奶牛由專人負(fù)責(zé)管理，記錄牛號(hào)、年齡、胎次、配種日期、產(chǎn)犢日期等，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1可知，對(duì)照組母犢率為51.58%，公母比例接近 1 ∶ 1，與生產(chǎn)實(shí)際中的正常性別比例相比差異不顯著（P>0.05）;試驗(yàn)組母犢率高達(dá)75.26%，與生產(chǎn)實(shí)際中的正常性別比例相比差異極顯著（P<0.01）。

2.2 奶牛體尺測(cè)量

隨機(jī)選取試驗(yàn)公牛和普通公牛后代各5頭進(jìn)行體尺測(cè)量（體高、背高、肩高、十字部高、體斜長(zhǎng)、體直長(zhǎng)、胸圍、管圍、坐骨端高、腰角寬、頭長(zhǎng)、最大額寬、最小額寬、尻長(zhǎng)），具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。

由表2可知，試驗(yàn)組奶牛體尺與對(duì)照組奶牛體尺對(duì)應(yīng)的各項(xiàng)指標(biāo)差異不顯著（P>0.05），說(shuō)明性控奶牛生長(zhǎng)發(fā)育正常，性控凍精可以進(jìn)一步在生產(chǎn)中推廣。

3 討論

動(dòng)物的性別決定機(jī)制與眾多基因調(diào)控通路和機(jī)制相關(guān)聯(lián)，人們往往通過(guò)研究性別決定的關(guān)鍵基因來(lái)調(diào)控動(dòng)物性別和探究調(diào)控機(jī)制。Zfy基因曾被確定為性別決定候選基因。目前研究表明，盡管它不能直接決定睪丸的發(fā)育和原始生殖嵴的分化，但是它對(duì)于單倍體Y精子的發(fā)育起到關(guān)鍵作用。Y染色體上的特異基因Zfy對(duì)于Y精子頭部和尾部的發(fā)育[9]、生殖細(xì)胞的減數(shù)分裂[10-12]、染色體聯(lián)會(huì)交換的發(fā)生及染色體的失活[13]等起著重要的作用。

Zfy基因是位于Y染色體上的特異性基因，是染色體上編碼鋅指蛋白的基因，從減數(shù)分裂期開(kāi)始表達(dá)，在圓形精子細(xì)胞中的含量最高。Page等明確指出Zfy基因與性別分化、精子發(fā)生有關(guān)[14]。Zfy基因是Y染色體短臂上特異性單拷貝序列，一直以來(lái)人們針對(duì)Zfy基因的特異性主要集中在動(dòng)物性別鑒定方面的研究，而利用該基因進(jìn)行動(dòng)物性別控制方面的研究仍為空白，本試驗(yàn)的開(kāi)展將對(duì)家畜的性別控制技術(shù)開(kāi)發(fā)提供新的思路和方法。

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收稿日期：2018-09-06

基金項(xiàng)目：2017年度新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院資助課題（編號(hào)：XJNZYKJ201704）;新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第十二師科技專項(xiàng)（編號(hào)：NYJH2013010）。

作者簡(jiǎn)介：席繼鋒（1978—），男，甘肅人，博士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：fftt2011@163.com。

通信作者：王香祖，博士，副教授，主要從事動(dòng)物遺傳育種與繁殖研究。E-mail：173897302@qq.com。